Name: generation of a human ipsc-based blood-brain barrier chip
Uploaded: 2020-03-02T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of a Human iPSC-Based Blood-Brain Barrier Chip at JoVE.com

Ringraziamo la dott.ssa Soshana Svendsen per l'editing critico. Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione della Israel Science Foundation 1621/18, dal Ministero della Scienza e della Tecnologia (MOST), da Israele 3-15647, dalla borsa di studio California Institute for Regenerative Medicine ID DISC1-08800, dalla Sherman Family Foundation, dalla NIH-NINDS grant 1UG3NS105703 e dalla sovvenzione 18-SI-389 della ALS Association. AH è stata finanziata dalla Wallenberg Foundation (numero di sovvenzione 2015.0178).

1. Generazione di cellule progenitrici neurali derivate da iPSC (iNPC)
<ol><li>Produrre sfere E z da colonie iPSC come descritto di seguito e come pubblicato in precedenza20,21,22.<ol>
<li>Coltura colonie iPSC alla confluenza su membrana seminterrato rivestito 6 lastre di pozzo (0,5 mg/piastra) in mTESR1 o altri supporti commerciali (vedi Tabella dei materiali).</li>
		<li>Rimuovere il mezzo iPSC e sostituire ...

<ol>
	<li>Pardridge, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+endogenous+transporters+as+therapeutic+targets:+a+new+model+for+small+molecule+CNS+drug+discovery.">Blood-brain barrier endogenous transporters as therapeutic targets: a new model for small molecule CNS drug discovery.</a> Expert Opinion on Therapeutic Targets. 19 (8), 1059-1072 (2015).</li><li>Gastfriend, B. D., Palecek, S. P., Shusta, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+blood-brain+barrier:+beyond+the+endothelial+cells.">Modeling the blood-brain barrier: beyond the endothelial cells.</a> Current Opinion in Biomedical Engineering. 5, 6-12 (2018).</li><li>Jamieson, J. J., Linville, R. M., Ding, Y. Y., Gerecht, S., Searson, P. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BBB+on+chip:+microfluidic+platform+to+mechanically+and+biochemically+modulate+blood-brain+barrier+function.">BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function.</a> Biomedical Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).</li><li>Prabhakarpandian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+tumor+networks+for+screening+drug+delivery+systems.">Synthetic tumor networks for screening drug delivery systems.</a> Journal of controlled release. 201, 49-55 (2015).</li><li>Delsing, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barrier+properties+and+transcriptome+expression+in+human+iPSC-derived+models+of+the+blood-brain+barrier.">Barrier properties and transcriptome expression in human iPSC-derived models of the blood-brain barrier.</a> Stem Cells. 36 (12), 1816-1827 (2018).</li><li>Park, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-enhanced+Blood-Brain+Barrier+Chip+recapitulates+human+barrier+function+and+shuttling+of+drugs+and+antibodies.">Hypoxia-enhanced Blood-Brain Barrier Chip recapitulates human barrier function and shuttling of drugs and antibodies.</a> Nature Communications. 10 (1), 2621 (2019).</li><li>Vatine, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPSC-Derived+Blood-Brain+Barrier+Chips+Enable+Disease+Modeling+and+Personalized+Medicine+Applications.">Human iPSC-Derived Blood-Brain Barrier Chips Enable Disease Modeling and Personalized Medicine Applications.</a> Cell Stem Cell. 24 (6), 995-1005 (2019).</li><li>Henry, O. Y. F., Villenave, R., Cronce, M. J., Leineweber, W. D., Benz, M. A., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organs-on-chips+with+integrated+electrodes+for+trans-epithelial+electrical+resistance+(TEER)+measurements+of+human+epithelial+barrier+function.">Organs-on-chips with integrated electrodes for trans-epithelial electrical resistance (TEER) measurements of human epithelial barrier function.</a> Lab on a Chip. 17 (13), 2264-2271 (2017).</li><li>Sances, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPSC-derived+endothelial+cells+and+microengineered+organ+chip+enhance+neuronal+development.">Human iPSC-derived endothelial cells and microengineered organ chip enhance neuronal development.</a> Stem Cell Reports. 10 (4), 1222-1236 (2018).</li><li>Workman, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+utilization+of+induced+pluripotent+stem+cell&#8211;derived+human+intestinal+organoids+using+microengineered+chips.">Enhanced utilization of induced pluripotent stem cell&#8211;derived human intestinal organoids using microengineered chips.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 669-677 (2018).</li><li>Ebert, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EZ+spheres:+a+stable+and+expandable+culture+system+for+the+generation+of+pre-rosette+multipotent+stem+cells+from+human+ESCs+and+iPSCs.">EZ spheres: a stable and expandable culture system for the generation of pre-rosette multipotent stem cells from human ESCs and iPSCs.</a> Stem Cell Research. 10 (3), 417-427 (2013).</li><li>Shelley, B. 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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+psychomotor+retardation+using+iPSCs+from+MCT8-deficient+patients+indicates+a+prominent+role+for+the+blood-brain+barrier.">Modeling psychomotor retardation using iPSCs from MCT8-deficient patients indicates a prominent role for the blood-brain barrier.</a> Cell Stem Cell. 20 (6), 831-843 (2017).</li><li>Svendsen, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+the+rapid+and+long+term+growth+of+human+neural+precursor+cells.">A new method for the rapid and long term growth of human neural precursor cells.</a> Journal of Neuroscience Methods. 85 (2), 141-152 (1998).</li><li>Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+blood-brain+barrier+endothelial+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 30 (8), 783 (2012).</li><li>Qian, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+blood-brain+barrier+endothelial+cells.">Directed differentiation of human pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells.</a> Science Advances. 3 (11), 1701679 (2017).</li><li>Neal, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified,+Fully+Defined+Differentiation+Scheme+for+Producing+Blood-Brain+Barrier+Endothelial+Cells+from+Human+iPSCs.">A Simplified, Fully Defined Differentiation Scheme for Producing Blood-Brain Barrier Endothelial Cells from Human iPSCs.</a> Stem Cell Reports. 12 (6), 1380-1388 (2019).</li><li>Wevers, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+perfused+human+blood-brain+barrier+on-a-chip+for+high-throughput+assessment+of+barrier+function+and+antibody+transport.">A perfused human blood-brain barrier on-a-chip for high-throughput assessment of barrier function and antibody transport.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 15 (1), 23 (2018).</li><li>Huh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabrication+of+human+organs-on-chips.">Microfabrication of human organs-on-chips.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2135 (2013).</li><li>Huh, D., Matthews, B. D., Mammoto, A., Montoya-Zavala, M., Hsin, H. Y., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+organ-level+lung+functions+on+a+chip.">Reconstituting organ-level lung functions on a chip.</a> Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).</li></ol>

La combinazione della tecnologia organ-on-chip e delle cellule derivate da iPSC nell'NVU promette una modellazione accurata della BBB umana. Qui, forniamo un protocollo dettagliato per l'applicazione semplice e robusta del chip BBB basato su iPSC recentemente pubblicato16. Una panoramica e la temporizzazione del paradigma di seeding è illustrato nella Figura 3. Per ottenere e mantenere funzioni di barriera adatte alla modellazione BBB, la generazione di un monostrato...

Il BBB è una barriera altamente selettiva che separa il SNC dal sangue circolante. Protegge le funzioni cerebrali critiche da sostanze potenzialmente dirompenti, fattori, e xenobiotici, consentendo anche l'afflusso di sostanze nutritive e altri metaboliti necessari per mantenere l'omeostasi del cervello1. Il BBB è un NVU multicellulare in cui periciti, piedi finali astrociti e processi neuronali contattano direttamente le cellule endoteliali microvascolari cerebrali (BMEC). Queste interazioni consentono ai BMEC di formare proprietà di barriera specializzate supportate da giunzioni strette e aderente2,3. La formazione di questa barriera limita il passaggio paracellulare delle molecole, ma contiene trasportatori polarizzati per trasportare attivamente le molecole nel SNC o di nuovo nel sangue1. A causa di queste proprietà di barriera uniche, la BBB costituisce un grande ostacolo alla consegna di biofarmaceutici nel cervello, e si stima che meno del 5% delle piccole molecole approvate dalla FDA possa raggiungere il CNS4.
I modelli animali sono stati ampiamente utilizzati per studiare la penetrazione BBB e i meccanismi molecolari coinvolti nello sviluppo di BBB5. Mentre i modelli animali rappresentano fedelmente il complesso ambiente multicellulare in vivo, le differenze di espressione e di attività dei trasportatori BBB, nonché la specificità del substrato tra le specie spesso precludono un'accurata estrapolazione dei dati sugli animali agli esseri umani6. Pertanto, i modelli a base umana sono fondamentali per studiare la BBB umana e per l'uso nello sviluppo di farmaci progettati per indirizzare il SNC. Questa necessità diventa ancora più evidente con la crescente dominanza dei farmaci biologici, specifici per l'uomo nel campo dello sviluppo farmaceutico. Sempre più prove suggeriscono che una BBB compromessa è associata a una serie di gravi disturbi del SNC, tra cui tumori cerebrali e malattie neurologiche7,8,9. I modelli umani che riflettono fedelmente queste malattie hanno il potenziale sia 1) identificare nuovi percorsi che potrebbero essere mirati per lo sviluppo di farmaci e 2) prevedere la penetrazione del SNC, riducendo così il tempo e le risorse negli studi preclinici e possibilmente diminuendo il tasso di fallimento negli studi clinici.
I modelli in vitro sono stati ampiamente implementati per studiare le interazioni tra BMEC e altre cellule della NVU e condurre schermi per potenziali farmaci permeabili BBB10. Per ricreare gli aspetti chiave della BBB umana, i modelli in vitro devono mostrare proprietà fisiologicamente rilevanti (cioè bassa permeabilità paracellulare e resistenza elettrica transetthelial fisiologica [TEER] attraverso il monostrato endoteliale). Inoltre, il profilo molecolare di un sistema in vitro deve includere l'espressione di sistemi di trasporto funzionali rappresentativi. Tipicamente, i modelli in vitro sono composti da cellule endoteliali co-coltivate su una membrana semipermeabile con combinazioni di altre cellule NVU per migliorare le proprietà BBB11. Questo approccio consente una valutazione semplice e relativamente rapida della funzionalità della barriera e della permeabilità delle molecole. Tali modelli BBB a base cellulare possono essere stabiliti con fonti cellulari animali o umane, comprese le cellule isolate da escissioni chirurgiche o linee BMEC immortalate.
Recentemente, sono stati introdotti protocolli per differenziare le cellule pluripotenti umane in BMEC come fonte interessante per i modelli BBB umani in vitro12,13. I BMEC derivati da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) sono altamente scalabili, dimostrano le caratteristiche morfologiche e funzionali cruciali della BBB umana e portano la genetica del paziente. Nella coltura, gli iBMEC formano un monostrato che esprime marcatori di giunzione stretti e display in complessi di giunzione stretti simili a in vivo. Queste cellule esprimono anche marcatori BBB, tra cui il trasportatore di glucosio BBB, il trasportatore di glucosio 1 (GLUT1). È importante sottolineare che, e a differenza di altre fonti di cellule alternative per i BMEC umani, gli iBMETC acquisiscono proprietà di barriera con valori alti come quelli misurati in vivo14, polarizzano lungo l'asse basolaterale ed esprimono pompe efflux funzionali. Inoltre, l'uso di iPSC da vari soggetti sia 1) accoglie con favore l'opportunità di testare gli aspetti della BBB in modo medico personalizzato e 2) fornisce una fonte flessibile per la generazione di ulteriori tipi di cella della NVU. Generare queste cellule da una fonte di cellule isogeniche per creare chip BBB personalizzati aiuterebbe anche a comprendere le differenze inter individuali nelle risposte dei farmaci, che è una delle principali cause di resistenza o risposta compromessa al trattamento osservata negli studi clinici.
L'uso di iBMEC come monostrati in un piatto o su un inserto transwell semi permeabile rappresenta un approccio potente per la modellazione BBB. Questi sistemi tendono ad essere robusti, riproducibili ed economici. Inoltre, le analisi funzionali come TEER e la permeabilità sono relativamente semplici da eseguire. Tuttavia, i sistemi bidimensionali (2D) non riescono a ricapitolare la natura 3D del tessuto in vivo, e non hanno le forze fisiologiche di stress da taglio fornite dalle cellule del sangue e del sangue circolanti. Questo limita la capacità dell'endotelio vascolare in questi modelli di sviluppare e mantenere proprietà e funzioni BBB intrinseche.
I sistemi microingegneririvestiti allineati da cellule viventi sono stati implementati per modellare varie funzionalità degli organi in un concetto chiamato organ-on-chips. Ricreando l'architettura multicellulare in vivo, le interfacce dei tessuti, i microambienti fisiochimici e la perfusione vascolare, queste piattaforme microingegnerizzate generano livelli di funzionalità dei tessuti e degli organi non possibili con sistemi di coltura 2D convenzionali. Consentono inoltre l'alta risoluzione, l'imaging in tempo reale e l'analisi di profili biochimici, genetici e metabolici simili alle cellule viventi nel contesto del tessuto in vivo e dell'organo. Tuttavia, una sfida particolare dell'organo su chip è che la progettazione, la fabbricazione e l'applicazione di questi chip microingegnerizzati richiede competenze ingegneristiche specializzate che di solito mancano nei laboratori accademici biologicamente orientati.
Recentemente abbiamo combinato tecnologie iPSC e organ-on-chip per generare un modello di chip BBB personalizzato15,16. Al fine di superare le sfide tecnologiche descritte, il Chip-S1 disponibile in commercio viene utilizzato insieme al modulo di coltura, uno strumento progettato per automatizzare la manutenzione dei chip in modo semplice e robusto (Emulate Inc.). Il chip BBB ricrea le interazioni tra cellule neurali ed endoteliali e raggiunge valori TEER fisiologicamente rilevanti, che vengono misurati da chip di organo su misura con elettrodi d'oro integrati17. Inoltre, il chip BBB mostra una bassa permeabilità paracellulare, risponde a segnali infiammatori a livello di organo, esprime pompe di flusso di efflusso attive e mostra il trasporto predittivo di biomarcatori solubili e biofarmaceutici. In particolare, i chip BBB generati da diversi individui catturano le differenze funzionali attese tra individui sani e pazienti con malattie neurologiche15.
Il protocollo descritto di seguito descrive un metodo affidabile, efficiente e riproducibile per la generazione di chip BBB basati su iPSC umani in condizioni di flusso dinamico. Vengono fornite indicazioni sul tipo di analisi dei saggi e degli endpoint che possono essere eseguite direttamente nel chip BBB o dagli effluenti di campionamento. Così, il protocollo dimostra lo spettro delle tecniche che possono essere applicate per la valutazione delle proprietà biologiche e funzionali e delle risposte in un modello rilevante per l'uomo.
Qui viene fornita una breve descrizione del chip BBB basato su iPSC. Gli iPSC umani sono inizialmente differenziati e propagati nei flaconi di coltura dei tessuti come aggregati a fluttuazione libera di progenitori neurali, indicati nelle sfere ez. Il canale superiore del Chip-S116,18,19 è seminato con sfere E sfere ez dissociate che formano il "lato cerebrale" del chip, in quanto le cellule si differenziano per 7 giorni in una coltura mista di cellule progenitrici neurali (iNPC), iAstrociti e iNeuron. Gli iPSC umani sono anche differenziati nelle piastre di coltura dei tessuti in iBMEC. Il canale inferiore del chip viene seminato con iBMEC per formare il "lato sangue" mentre si sviluppano per formare un tubo endoteliale (Figura 1). La membrana rivestita a matrice extracellulare porosa (ECM) che separa i canali superiore e inferiore 1) consente la formazione di interazioni tra cellule e cellule tra i canali e 2) consente all'utente di eseguire saggi permeabilità e celle di immagine in entrambi i canali utilizzando un microscopio luminoso convenzionale.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SCR005</td>
			<td>Dissociation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bfgf</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chip-S1</td>
			<td>Emulate Inc</td>
			<td>Chip-S1</td>
			<td>Organ-Chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D3571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran-FITC</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>46944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM: F12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31330038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emulate Reagent 1 (ER-1)</td>
			<td>Emulate Inc</td>
			<td>ER-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emulate Reagent 2 (ER-2)</td>
			<td>Emulate Inc</td>
			<td>ER-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP)</td>
			<td>Dako</td>
			<td>Z0334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GLUT-1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MA5-11315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050038</td>
			<td>Glutamine supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hBDNF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOSR</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>Basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>StemCell Technologies, Inc.</td>
			<td>85851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA</td>
			<td>Biological industries</td>
			<td>01-340-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nestin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NutriStem</td>
			<td>Biological industries</td>
			<td>05-100-1A</td>
			<td>Alternate media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PECAM-1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platelet-poor plasma-derived bovine serum (PPP)</td>
			<td>Biomedical Technologies</td>
			<td>J64483AB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid (RA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S100&#946;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZO-1 Monoclonal Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>33-9100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;III-tubulin (Tuj1&#945;)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>31350010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of a human ipsc-based blood-brain barrier chip

La barriera ematoencefalica (BBB) è formata da unità neurovascolari (NKU) che proteggono il sistema nervoso centrale (SNC) da una serie di fattori presenti nel sangue che possono interrompere la delicata funzione cerebrale. Come tale, la BBB è un ostacolo importante per la fornitura di terapie al SNC. Sempre più prove suggeriscono che la BBB svolge un ruolo chiave nell'insorgenza e nella progressione delle malattie neurologiche. Pertanto, vi è un'enorme necessità di un modello BBB in grado di prevedere la penetrazione di farmaci mirati al SNC e di chiarire il ruolo della BBB nella salute e nella malattia.
Recentemente abbiamo combinato tecnologie di cellule staminali pluripotenti (iPSC) organo-su chip e cellule staminali pluripotenti indotte per generare un chip BBB completamente personalizzato per l'uomo. Questa nuova piattaforma mostra proprietà cellulari, molecolari e fisiologiche che sono adatte per la previsione del trasporto di farmaci e molecole attraverso il BBB umano. Inoltre, utilizzando chip BBB specifici per il paziente, abbiamo generato modelli di malattia neurologica e dimostrato il potenziale per applicazioni di medicina predittiva personalizzata. Fornito qui è un protocollo dettagliato che dimostra come generare chip BBB derivati da iPSC, a partire dalla differenziazione delle cellule endoteliali microvascolari cerebrali derivate da iPSC (iBMEC) e con conseguente colture neurali miste contenenti progenitori neurali, neuroni differenziati e astrociti. Viene inoltre descritta una procedura per la semina di cellule nel chip dell'organo e la coltura dei chip BBB sotto flusso laminare controllato. Infine, vengono fornite descrizioni dettagliate delle analisi dei chip BBB, compresi i saggi di permeabilità paracellulare per la valutazione della permeabilità di farmaci e molecole, nonché metodi immunocitochimici per determinare la composizione dei tipi di cellule all'interno del chip.

Figura 6A,B,C rappresenta un chip BBB seminato con sfere ez sul canale superiore "lato cervello" e iBMETsul canale inferiore "lato sangue". Gli iBMEC sono stati prima di edte e hanno permesso di attaccarsi durante la notte, dopo di che sono state seminate le sfere dell'EZ. I trucioli sono stati poi coltivati in condizioni statiche con sostituzione giornaliera dei media per sette giorni. Il chip BBB è stato poi fissato utilizzando il 4% di PFA a RT per 10 min e lavato 3x con...

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Generation of a Human iPSC-Based Blood-Brain Barrier Chip

La barriera emato-encefalica (BBB) è un'unità neurovascolare multicellulare che regola strettamente l'omeostasi cerebrale. Combinando gli iPSC umani e le tecnologie organ-on-chip, abbiamo generato un chip BBB personalizzato, adatto per la modellazione delle malattie e le previsioni di penetrazione dei farmaci del SNC. Viene descritto un protocollo dettagliato per la generazione e il funzionamento del chip BBB.

Generazione di un chip di barriera emato-encefalica basata sull'iPSC umano

The blood brain barrier (BBB) is formed by neurovascular units (NVUs) that shield the central nervous system (CNS) from a range of factors found in the ...

Questo protocollo dimostrerà come le cellule staminali pluripotenti indotte differenziate possono essere sezionate su un organo su chip per generare una barriera e-encefalica del sangue completamente umana, personalizzata e microfluidico, che può essere utilizzata per prevedere la permeabilità dei farmaci del sistema nervoso centrale e per studiare i disturbi neurologici. Utilizzando un organ-on-chip disponibile in commercio, dimostreremo come qualsiasi laboratorio biologicamente orientato può utilizzare questa tecnologia per generare una barriera e-encefalica microfluidico personalizzata su chip. L'accumulo di prove suggerisce che la BBB gioca un ruolo nella malattia neurologica generando chip BBB personalizzati derivati da iPSC di individui con una malattia neurologica genetica.Sarà possibile studiare il ruolo della BBB nella salute e nelle malattie. Questo metodo può essere utile anche per le aziende farmaceutiche, che possono utilizzare questa piattaforma BBB umana per esaminare la penetrabilità dei farmaci neurologici candidati nel cervello umano. L'applicazione di tecnologie organ-on-chip di solito richiede competenze ingegneristiche specializzate.L'utilizzo di piattaforme disponibili in commercio consente l'applicazione di questa tecnologia in qualsiasi laboratorio biologicamente orientato. Per iniziare, portare il piatto contenente i trucioli preparati nell'armadietto della biosicurezza. Utilizzando una pipetta P200, lavare delicatamente entrambi i canali aggiungendo 200 microlitri di mezzo di differenziazione neurale nell'ingresso e estraendo il liquido dall'uscita.Evitando il contatto con le porte, aspirare accuratamente le goccioline di supporto in eccesso dalla superficie del chip. Agitare delicatamente la sospensione cellulare per garantire una sospensione cellulare omogenea. Per seminare le cellule progenitrici neurali derivate da iPSC nel canale superiore per generare il lato cerebrale, aggiungere una punta P200 contenente da 30 a 100 microlitri di sospensione cellulare alla concentrazione di uno per 10 alle sei cellule per millilitro all'ingresso del canale superiore e rilasciare delicatamente la punta dalla pipetta.Prendere una pipetta P200 vuota, deprimere lo stantuffo, inserire nella presa del canale superiore e tirare con cura la sospensione a cella singola attraverso la punta. Trasferire il chip al microscopio per controllare la densità di semina e la distribuzione omogenea delle cellule all'interno del canale superiore. Dopo aver confermato la densità cellulare al 20% di copertura, posizionare immediatamente i trucioli nell'incubatrice per due ore a 37 gradi Celsius.Successivamente, lavare via le cellule che non si attaccano aggiungendo un nuovo mezzo di differenziazione neurale nell'ingresso e tirando il liquido tramite pipetta dall'uscita. Mantenere le cellule in condizioni statiche a 37 gradi Celsius con una sostituzione giornaliera del mezzo di differenziazione neurale. Dopo che gli INPC si sono attaccati o in un giorno successivo alla semina, portare il piatto contenente i trucioli preparati nell'armadietto della biosicurezza.Lavare delicatamente il canale inferiore con 200 microlitri di mezzo cellulare endoteliale. Evitando il contatto con le porte, aspirare con cura goccioline di mezzo cellulare endoteliale in eccesso dalla superficie del chip, assicurandosi di lasciare il mezzo in entrambi i canali. Agitare delicatamente la sospensione cellulare per garantire una sospensione cellulare omogenea.Utilizzando una pipetta P200, disegnare da 30 a 100 microlitri della sospensione cellulare endoteliale microvascolare cerebrale derivata dall'iPSC alla concentrazione da 14 a 20 volte 10 alle sei cellule per millilitro e posizionare la punta nell'ingresso del canale inferiore. Il passo più critico per ottenere proprietà barriera funzionale è la semina di cellule endoteliali microvascolari cerebrali. È fondamentale seminare le cellule a densità corretta per evitare la formazione di bolle per verificare la distribuzione omogenea all'interno del chip dell'organo.Premere lo stantuffo su una pipetta P200 con una punta vuota, inserire nella presa del canale inferiore e rilasciare lentamente lo stantuffo della pipetta per tirare con cura la sospensione a cella singola attraverso il canale inferiore. Aspirare la sospensione cellulare in eccesso dalla superficie del truciolo. Evitare il contatto diretto con le porte di ingresso e di uscita per garantire che nessuna sospensione cellulare sia aspirata fuori dai canali.Trasferire il chip al microscopio per controllare la densità di semina. Il canale inferiore è riempito con celle senza spazi osservabili nel mezzo. Dopo aver confermato la corretta densità cellulare, seminare le cellule nei trucioli rimanenti.Per attaccare le cellule alla membrana porosa, che si trova sopra il canale inferiore, invertire ogni chip e lasciarle riposare in una culla di chip. Posizionare un piccolo serbatoio contenente DPBS sterile all'interno del piatto da 150 millimetri per fornire umidità alle cellule. Incubare i trucioli a 37 gradi Celsius per circa tre ore o fino a quando le cellule nel canale inferiore non si sono attaccate.Una volta che le cellule endoteliali endoteliali cerebrali derivate da iPSC si sono attaccate, capovolgere i trucioli in posizione verticale per consentire l'attacco cellulare alla parte inferiore del canale inferiore. 48 ore dopo la semina delle cellule endoteliali microvascolari cerebrali derivate dall'iPSC, equilibrano la temperatura del mezzo cellulare endoteliale riscaldandosi in un bagno d'acqua Celsius di 37 gradi per un'ora. Quindi, degasa il mezzo per incubazione sotto un sistema di filtrazione a vuoto per 15 minuti.Successivamente, sanificare l'esterno dell'imballaggio e dei vassoi del modulo portatile con il 70% di etanolo, pulirli e trasferirli nell'armadio di biosicurezza. Aprire la confezione e posizionare i moduli nel vassoio Orientarli con i serbatoi verso la parte posteriore del vassoio. Pipetta tre millilitri del supporto pre-equilibrato e caldo ad ogni serbatoio di ingresso.Aggiungere il mezzo di coltura cellulare endoteliale al serbatoio di ingresso del canale inferiore e il mezzo di differenziazione neurale al serbatoio di ingresso del canale superiore del canale superiore. Quindi, pipettare 300 microlitri dei supporti pre-equilibrati e caldi in ogni serbatoio di uscita, direttamente su ogni porta di uscita. Posizionare fino a sei moduli portatili su ogni vassoio.Portare i vassoi nell'incubatore e scivolare completamente nel modulo di coltura con la maniglia del vassoio rivolta verso l'esterno. Selezionare ed eseguire il ciclo primario nel modulo impostazioni cultura. Chiudere la porta dell'incubatore e consentire al modulo di coltura di innescare i moduli portatili per circa un minuto.Il ciclo di adescamento viene completato quando la barra di stato è pronta. Rimuovere il vassoio dal modulo di coltura e portarlo all'armadio per la biosicurezza. Ispezionare la parte inferiore di ogni modulo portatile nell'armadio di biosicurezza per verificare che i moduli portatili siano stati innescati con successo.Cerca la presenza di piccole goccioline in tutte e quattro le porte. Se un modulo portatile non mostra goccioline, rieseguire il ciclo primario su tali moduli. Se un supporto gocciola sul vassoio, che si verifica più spesso dalle porte di uscita, pulire il vassoio con il 70% di etanolo.Successivamente, lavare delicatamente entrambi i canali di ciascun chip con un mezzo di coltura caldo e equilibrato specifico della cella per rimuovere eventuali bolle nel canale e posizionare piccole goccioline di supporti sulla parte superiore di ogni porta di ingresso e uscita. Inserire i chip con i supporti nei moduli portatili e posizionare fino a sei su ciascun vassoio. Inserire i vassoi nel modulo delle impostazioni cultura.Programmare le condizioni appropriate di coltura dei truciolo d'organo, come portata ed allungamento, sul modulo di coltura. Non appena il ciclo di regolamentazione è completo, che richiede circa due ore, iniziano le condizioni programmate. Successivamente, il modulo di coltura inizia il flusso in condizioni di coltura di chip d'organo preimpostate.L'immunocitochimica sul chip barriera eo-encefalica basato su iPSC sette giorni dopo il seeding mostra le sfere EZ differenziate in una popolazione di cellule neurali miste nel canale lato cervello superiore, inclusi astrociti beta-positivi S100, cellule progenitrici neurali positive alla nestina, così come astrociti positivi alla GFAP e neuroni positivi alla tubulina beta III. Cellule endoteliali cerebrali microvascolari derivate dall'IPSC sementi nel canale inferiore del lato sanguigno espresse GLUT-1 e PECAM-1. La valutazione della permeabilità del chip della barriera eencefalica dimostra che il chip dell'organo seminato con cellule endoteliali endoteliali microvascolari cerebrali derivate da iPSC e sfere EZ aveva una barriera stretta rispetto ai chip d'organo sementi con cellule endoteliali cerebrali derivate da iPSC.I trucioli d'organo seminati con sfere EZ da soli non mostravano proprietà barriera. Dal trattamento superficiale iniziale del canale alla commutazione media ogni giorno, evitare la formazione di bolle nel canale. Durante tutto il passaggio del protocollo in cui il reagente di attivazione della superficie, la matrice extracellulare o il supporto contenente celle devono essere inseriti attraverso i canali, è estremamente importante verificare attentamente che non si riscontri alcuna bolla.Il saggio di permeabilità può essere eseguito per valutare la penetrabilità cerebrale umana dei farmaci candidati. Questo approccio può servire per testare potenziali terapie. L'applicazione del chip BBB basato su iPSC consente di studiare il ruolo della BBB in varie malattie neurologiche.In futuro, tale piattaforma potrebbe essere utile per applicazioni mediche predittive e personalizzate.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Human Adipose Stem Cells through Dedifferentiation of Mature Adipocytes in Ceiling Cultures

Generazione di cellule staminali adiposo umano attraverso dedifferenziazione di adipociti maturi in Culture soffitto

Mature adipocytes have been shown to reverse their phenotype into fibroblast-like cells in vitro through a technique called ceiling culture. Mature ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Generation of Integration-free Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Hair-derived Keratinocytes

Generazione di cellule staminali Integrazione-libero umano pluripotenti indotte Utilizzando capelli derivati ​​da cheratinociti

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using ...

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

Generazione di culture geneticamente modificate pelle organotipiche Uso devitalizzate derma umano

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

Generazione di cellule staminali pluripotenti indotte da melanoma umano Linfociti infiltranti il ​​tumore

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Definito e Generazione scalabile di cellule epatociti-come da cellule staminali umane pluripotenti

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

Generazione di IPSC-derivati ​​cervello umano organoidi per creare un modello disturbi dello sviluppo neurologico precoce

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin

Generazione e la coltura dei Keratinocytes umani primari da pelle adulta

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. ...

Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids

Misura in tempo reale di permeabilità della barriera epiteliale in Organoids intestinale umana

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted ...

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Analisi per l'integrità della barriera del cervello edelico nella Drosophila melanogaster

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous ...

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

Generazione di organoidi endometriali primari umani multicellulari

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...