Name: generation of a human ipsc-based blood-brain barrier chip
Uploaded: 2020-03-02T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of a Human iPSC-Based Blood-Brain Barrier Chip at JoVE.com

批判的な編集に対するソシャナ・スヴェンセン博士に感謝します。この研究は、イスラエル科学財団助成金1621/18、科学技術省(MOST)、イスラエル3-15647、カリフォルニア再生医療研究所助成金DISC1-08800、シャーマンファミリー財団、NIH-NINDS助成金1UG3NS105703、ALS協会助成金18-SI-389によって支援されました。AHはワレンバーグ財団(助成金番号2015.0178)によって資金提供されました。

1. iPSC由来神経前駆細胞(iNPC)の生成
<ol><li>iPSCコロニーからEZ球体を作製する(後述したように、以前に公開された20、21、22)。<ol>
<li>培養iPSCコロニーは、基調膜マトリックスコーティングされた6ウェルプレート(0.5 mg/plate)のmTESR1または他の商業用媒体に収束する(材料の表を参照)。</li>
		<li>iPSC培地を取り出し、2...

<ol>
	<li>Pardridge, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+endogenous+transporters+as+therapeutic+targets:+a+new+model+for+small+molecule+CNS+drug+discovery.">Blood-brain barrier endogenous transporters as therapeutic targets: a new model for small molecule CNS drug discovery.</a> Expert Opinion on Therapeutic Targets. 19 (8), 1059-1072 (2015).</li><li>Gastfriend, B. D., Palecek, S. P., Shusta, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+blood-brain+barrier:+beyond+the+endothelial+cells.">Modeling the blood-brain barrier: beyond the endothelial cells.</a> Current Opinion in Biomedical Engineering. 5, 6-12 (2018).</li><li>Jamieson, J. J., Linville, R. M., Ding, Y. Y., Gerecht, S., Searson, P. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntington's+disease+iPSC-derived+brain+microvascular+endothelial+cells+reveal+WNT-mediated+angiogenic+and+blood-brain+barrier+deficits.">Huntington's disease iPSC-derived brain microvascular endothelial cells reveal WNT-mediated angiogenic and blood-brain barrier deficits.</a> Cell Reports. 19 (7), 1365-1377 (2017).</li><li>Dumitrescu, A. M., Liao, X. H., Weiss, R. E., Millen, K., Refetoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+thyroid+hormone+deprivation+and+excess+in+monocarboxylate+transporter+(mct)+8-deficient+mice.">Tissue-specific thyroid hormone deprivation and excess in monocarboxylate transporter (mct) 8-deficient mice.</a> Endocrinology. 147 (9), 4036-4043 (2006).</li><li>Spencer, J. I., Bell, J. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BBB+on+chip:+microfluidic+platform+to+mechanically+and+biochemically+modulate+blood-brain+barrier+function.">BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function.</a> Biomedical Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).</li><li>Prabhakarpandian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+tumor+networks+for+screening+drug+delivery+systems.">Synthetic tumor networks for screening drug delivery systems.</a> Journal of controlled release. 201, 49-55 (2015).</li><li>Delsing, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barrier+properties+and+transcriptome+expression+in+human+iPSC-derived+models+of+the+blood-brain+barrier.">Barrier properties and transcriptome expression in human iPSC-derived models of the blood-brain barrier.</a> Stem Cells. 36 (12), 1816-1827 (2018).</li><li>Park, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-enhanced+Blood-Brain+Barrier+Chip+recapitulates+human+barrier+function+and+shuttling+of+drugs+and+antibodies.">Hypoxia-enhanced Blood-Brain Barrier Chip recapitulates human barrier function and shuttling of drugs and antibodies.</a> Nature Communications. 10 (1), 2621 (2019).</li><li>Vatine, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPSC-Derived+Blood-Brain+Barrier+Chips+Enable+Disease+Modeling+and+Personalized+Medicine+Applications.">Human iPSC-Derived Blood-Brain Barrier Chips Enable Disease Modeling and Personalized Medicine Applications.</a> Cell Stem Cell. 24 (6), 995-1005 (2019).</li><li>Henry, O. Y. F., Villenave, R., Cronce, M. J., Leineweber, W. D., Benz, M. A., Ingber, D. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+utilization+of+induced+pluripotent+stem+cell&#8211;derived+human+intestinal+organoids+using+microengineered+chips.">Enhanced utilization of induced pluripotent stem cell&#8211;derived human intestinal organoids using microengineered chips.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 669-677 (2018).</li><li>Ebert, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EZ+spheres:+a+stable+and+expandable+culture+system+for+the+generation+of+pre-rosette+multipotent+stem+cells+from+human+ESCs+and+iPSCs.">EZ spheres: a stable and expandable culture system for the generation of pre-rosette multipotent stem cells from human ESCs and iPSCs.</a> Stem Cell Research. 10 (3), 417-427 (2013).</li><li>Shelley, B. 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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+psychomotor+retardation+using+iPSCs+from+MCT8-deficient+patients+indicates+a+prominent+role+for+the+blood-brain+barrier.">Modeling psychomotor retardation using iPSCs from MCT8-deficient patients indicates a prominent role for the blood-brain barrier.</a> Cell Stem Cell. 20 (6), 831-843 (2017).</li><li>Svendsen, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+the+rapid+and+long+term+growth+of+human+neural+precursor+cells.">A new method for the rapid and long term growth of human neural precursor cells.</a> Journal of Neuroscience Methods. 85 (2), 141-152 (1998).</li><li>Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. 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J., Gerecht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chipping+Away+at+Blood-Brain-Barrier+Modeling.">Chipping Away at Blood-Brain-Barrier Modeling.</a> Cell stem cell. 24 (6), 831-832 (2019).</li><li>Faal, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Mesoderm+and+Neural+Crest-Derived+Pericytes+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells+to+Study+Blood-Brain+Barrier+Interactions.">Induction of Mesoderm and Neural Crest-Derived Pericytes from Human Pluripotent Stem Cells to Study Blood-Brain Barrier Interactions.</a> Stem Cell Reports. 12 (3), 451-460 (2019).</li><li>Lippmann, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+blood-brain+barrier+endothelial+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 30 (8), 783 (2012).</li><li>Qian, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+blood-brain+barrier+endothelial+cells.">Directed differentiation of human pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells.</a> Science Advances. 3 (11), 1701679 (2017).</li><li>Neal, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified,+Fully+Defined+Differentiation+Scheme+for+Producing+Blood-Brain+Barrier+Endothelial+Cells+from+Human+iPSCs.">A Simplified, Fully Defined Differentiation Scheme for Producing Blood-Brain Barrier Endothelial Cells from Human iPSCs.</a> Stem Cell Reports. 12 (6), 1380-1388 (2019).</li><li>Wevers, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+perfused+human+blood-brain+barrier+on-a-chip+for+high-throughput+assessment+of+barrier+function+and+antibody+transport.">A perfused human blood-brain barrier on-a-chip for high-throughput assessment of barrier function and antibody transport.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 15 (1), 23 (2018).</li><li>Huh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabrication+of+human+organs-on-chips.">Microfabrication of human organs-on-chips.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2135 (2013).</li><li>Huh, D., Matthews, B. D., Mammoto, A., Montoya-Zavala, M., Hsin, H. Y., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+organ-level+lung+functions+on+a+chip.">Reconstituting organ-level lung functions on a chip.</a> Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).</li></ol>

NVUのオルガン・オンチップ技術とiPSC由来細胞の組み合わせは、ヒトBBBの正確なモデリングを約束しています。ここでは、最近公開されたiPSCベースのBBBチップ16のシンプルで堅牢なアプリケーションのための詳細なプロトコルを提供します。シードパラダイムの概要とタイミングを図 3に示します。BBB モデリングに適したバリア機能を得て維持するには...

BBBは循環血液からCNSを分離する非常に選択的な障壁である。これは、潜在的に破壊的な物質、要因、および異種生物学から重要な脳機能を保護する一方で、脳の恒常性を維持するために必要な栄養素やその他の代謝産物の流入を可能にする1.BBBは、多細胞NVUであり、ペリサイト、アストロサイトエンドフィート、およびニューロンプロセスが脳微小血管内皮細胞(BMECs)と直接接触する。これらの相互作用により、BMEC は、密閉ジャンクション2、3でサポートされる特殊なバリア プロパティを形成できます。このバリアの形成は、分子の傍細胞通過を制限しますが、分子をCNSに積極的に輸送したり、血液1に戻すために偏光輸送体を含んでいます。これらのユニークなバリア特性により、BBBはバイオ医薬品の脳への送達に対する大きな障害となり、FDA承認低分子の5%未満がCNS4に到達できると推定される。
動物モデルはBBBの浸透およびBBB開発に関与する分子機構を研究するために広く使用されている5.動物モデルは、複雑な多細胞インビボ環境を忠実に表すが、BBBトランスポーターの発現および活性の違いならびに種間の基質特異性は、ヒトへの動物データの正確な外挿を妨げる場合が多い6。したがって、ヒトベースのモデルは、ヒトBBBを研究し、CNSを標的にするように設計された薬物の開発に使用するために重要である。この必要性は、医薬品開発分野における生物学的、ヒト特異的薬物の優位性の増加に伴ってさらに明らかになる。蓄積された証拠は、侵害されたBBBが脳腫瘍および神経疾患7、8、9を含む多くの重度のCNS障害に関連していることを示唆している。これらの疾患を忠実に反映するヒトモデルは、1)創薬の対象となり得る新しい経路を同定し、2)CNS浸透を予測し、前臨床試験における時間と資源を減少させ、臨床試験における失敗率を低下させる可能性がある。
インビトロモデルは、BMECとNVUの他の細胞との相互作用を研究し、将来のBBB透過性薬物10のスクリーンを実施するために広く実施されている。ヒトBBBの重要な側面を再現するには、インビトロモデルは生理学的に関連する特性(すなわち、低い細胞内透膜透過性および生理的に関連する内皮単層にわたる経内皮性電気抵抗[TEER])を示さなければならない。また、インビトロ系の分子プロファイルには、代表的な機能的輸送システムの発現が含まれなければならない。典型的には、インビトロモデルは、BBB特性を増強するために他のNVU細胞の組み合わせと半透過性膜上で共培養される内皮細胞で構成される11。このアプローチにより、バリア機能と分子透過性を簡単かつ比較的迅速に評価できます。このような細胞ベースのBBBモデルは、外科的切除または不死化BMEC線から単離された細胞を含む動物またはヒト細胞源で確立することができる。
近年、BMECsにヒト多能性細胞を分化するプロトコルが、インビトロヒトBBBモデル12、13の魅力的な供給源として導入された。人工多能性幹細胞(iPSC)由来BMECs(iBMECs)は、非常にスケーラブルであり、ヒトBBBの重要な形態学的および機能的特徴を実証し、患者の遺伝学を運ぶ。培養では、iBMECsは、タイトな接合マーカーを表現し、生体内のようなタイトなジャンクション複合体に表示する単層を形成する。これらの細胞はまた、BBBグルコーストランスポーター、グルコーストランスポーター1(GLUT1)を含むBBBマーカーを発現する。重要なことは、ヒトBMECの他の代替細胞源とは異なり、iBMECはvivo14で測定されたものと同じくらい高い値を持つバリア特性を獲得し、バソ辺膜軸に沿って偏光し、機能的な流出ポンプを発現する。さらに、様々な被験者のiPSCを用い、両方とも1)は、BBBの側面を個別化した医薬の方法で試験する機会を歓迎し、2)NVUの追加細胞タイプを生成するための柔軟な供給源を提供する。アイソジェニック細胞源からこれらの細胞を生成してパーソナライズされたBBBチップを作成することは、薬物応答の個人差間を理解するのにも役立ちます。
iBMEIcを皿の単層として、または半透水性トランスウェルインサートで使用すると、BBBモデリングのための強力なアプローチを表します。これらのシステムは、堅牢で再現性が高く、コスト効率が高い傾向があります。さらに、TEERや透透度などの機能解析は比較的簡単に行えます。しかし、2次元(2D)系では生体内組織の3D性を再現できず、血液や血液細胞の循環によって生じる生理的剪断力が欠如しています。これは、これらのモデルにおける血管内皮の能力を制限し、固有のBBB特性および機能を開発し維持する。
生きた細胞が並ぶマイクロエンジニアリングシステムは、オルガンオンチップと呼ばれる概念で様々な器官機能をモデル化するために実装されています。生体構造の多細胞構造、組織組織のインターフェース、物理化学的微小環境、血管灌流を再現することにより、これらのマイクロエンジニアリングプラットフォームは、組織および器官の機能性のレベルを生成する従来の2D培養システム。また、生体内組織や臓器のコンテキストで生きた細胞と同様の生化学的、遺伝的、代謝のプロファイルを高解像度、リアルタイムイメージング、および分析することができます。しかし、オルガン・オン・チップの特定の課題は、これらのマイクロエンジニアリングチップの設計、製造、および応用には、生物学的指向の学術ラボに通常欠けている専門的なエンジニアリング専門知識が必要です。
最近、iPSCとオルガンオンチップの技術を組み合わせて、パーソナライズされたBBBチップモデル15,16を生成しました。説明されている技術的な課題を克服するために、市販のChip-S1は、シンプルで堅牢な方法でチップのメンテナンスを自動化するように設計された、カルチャーモジュールと一緒に使用されます(Emulate Inc.)。BBBチップは、神経細胞と内皮細胞の相互作用を再現し、統合された金電極17を有するカスタムメイドのオルガンチップによって測定される生理学的に関連するTEER値を達成する。さらに、BBBチップは低い細胞透過性を示し、臓器レベルでの炎症の手掛かりに応答し、活性な流出ポンプを発現し、可溶性バイオマーカーおよびバイオ医薬品の予測輸送を示す。特に、いくつかの個体から生成されたBBBチップは、神経疾患15を有する健康な個人と患者との間の期待される機能的な違いを捉える。
以下に詳述するプロトコルは、動的流動条件下でヒトiPSCベースのBBBチップを生成するための信頼性、効率的、および再現性のある方法を記述しています。BBBチップで直接、またはサンプリング排水から実行できるアッセイおよびエンドポイント分析のタイプに関するガイダンスが提供されます。このように、このプロトコルは、人間関連モデルにおける生物学的および機能的特性および応答を評価するために適用できる技術のスペクトルを示す。
iPSCベースのBBBチップの簡単な説明は、ここに提供されています。ヒトiPSCは、最初に分化され、EZ球と呼ばれる神経前駆物質の自由浮遊凝集体として組織培養フラスコに伝播される。Chip-S116,18,19のトップチャンネルには、細胞が7日間にわたって分化して神経前駆細胞(iNPCs)、iAストロサイト、およびiニューロンの混合培養に分化するため、チップの「脳側」を形成する解化されたEZ球体が播種されます。ヒトiPSCは、組織培養プレート内でもiBMECsに分けられます。チップの底流路はiBMECsで播種され、内皮管を形成するように発達する「血液側」を形成する(図1)。上下のチャネルを分離する多孔性細胞外マトリックス(ECM)コーティング膜は、チャネルと2との間の細胞間相互作用の形成を可能にし、2)は、ユーザーが従来の光顕微鏡を使用していずれかのチャネルで透過性アッセイおよび画像細胞を実行することを可能にする。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SCR005</td>
			<td>Dissociation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bfgf</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chip-S1</td>
			<td>Emulate Inc</td>
			<td>Chip-S1</td>
			<td>Organ-Chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D3571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran-FITC</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>46944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM: F12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31330038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emulate Reagent 1 (ER-1)</td>
			<td>Emulate Inc</td>
			<td>ER-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emulate Reagent 2 (ER-2)</td>
			<td>Emulate Inc</td>
			<td>ER-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP)</td>
			<td>Dako</td>
			<td>Z0334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GLUT-1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MA5-11315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050038</td>
			<td>Glutamine supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hBDNF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOSR</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>Basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>StemCell Technologies, Inc.</td>
			<td>85851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA</td>
			<td>Biological industries</td>
			<td>01-340-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nestin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NutriStem</td>
			<td>Biological industries</td>
			<td>05-100-1A</td>
			<td>Alternate media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PECAM-1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platelet-poor plasma-derived bovine serum (PPP)</td>
			<td>Biomedical Technologies</td>
			<td>J64483AB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid (RA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S100&#946;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZO-1 Monoclonal Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>33-9100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;III-tubulin (Tuj1&#945;)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>31350010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of a human ipsc-based blood-brain barrier chip

血液脳関門(BBB)は、繊細な脳機能を破壊する可能性のある血液中枢神経系(CNS)を様々な要因から保護する神経血管ユニット(Nvus)によって形成される。したがって、BBBは、CNSへの治療薬の送達に対する主要な障害である。蓄積された証拠は、BBBが神経疾患の発症および進行において重要な役割を果たしていることを示唆している。したがって、健康と病気におけるBBBの役割を解明するだけでなく、CNS標的薬の浸透を予測できるBBBモデルが非常に必要とされています。
最近、臓器オンチップと誘導多能性幹細胞(iPSC)技術を組み合わせて、人間に完全にパーソナライズされたBBBチップを生成しました。この新しいプラットフォームは、ヒトBBBを横断する薬物および分子輸送の予測に適した細胞、分子、および生理学的特性を表示する。さらに、患者固有のBBBチップを用いて、神経疾患モデルを生成し、個別化された予測医療用途の可能性を実証しました。ここでは、iPSC由来のBBBチップを生成する方法を示す詳細なプロトコルを提供し、iPSC由来の脳微小血管内皮細胞(iBME)の分化から始まり、神経前駆細胞を含む混合神経培養を生み出す結果、分化されたニューロン、およびアストロサイト。また、制御された層流下でBBBチップを培養して臓器チップに細胞を播種する手順についても説明する。最後に、BBBチップ分析の詳細な説明は、薬剤および分子透過性を評価するための細胞内透過性アッセイ、ならびにチップ内の細胞タイプの組成を決定するための免疫細胞化学的方法を含む提供される。

図6A、B、Cは、「脳側」の上流にEZ球体を、そして「血液側」の底流にiBMECsを播種したBBBチップを表す。iBMECは最初に種をまき、一晩で付着させ、その後EZ球体をシードした。その後、チップは静的条件下で培養され、毎日のメディア交換は7日間行われました。BBBチップは、RTで4%PFAを10分間用いて固定し、DPBSで3倍洗浄した。BBBチップ上で免疫細胞化学を行い?...

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Generation of a Human iPSC-Based Blood-Brain Barrier Chip

血液脳関門(BBB)は、多細胞神経血管の単位は、密接に脳の恒常性を調節します。ヒトiPSCと臓器オンチップ技術を組み合わせることで、疾患モデリングやCNS薬物浸透性予測に適したパーソナライズされたBBBチップを生成しました。BBBチップの生成と動作に関する詳細なプロトコルについて説明します。

ヒトiPSCベースの血液脳バリアチップの生成

The blood brain barrier (BBB) is formed by neurovascular units (NVUs) that shield the central nervous system (CNS) from a range of factors found in the ...

このプロトコルは、分化された人工多能性幹細胞をオルガンオンチップに播種して、中枢神経系の薬物透過性を予測し、神経疾患を研究するために使用できる完全にヒトでパーソナライズされたマイクロ流体血液脳関門を生成する方法を示す。市販のオルガンオンチップを使用して、生物学的指向のラボがこの技術を使用して、パーソナライズされたマイクロ流体血液脳関門オンチップを生成する方法を実証します。証拠の蓄積は、BBBが遺伝性神経疾患を有する個人のiPSCに由来するパーソナライズされたBBBチップを生成することによって神経疾患に役割を果たしていることを示唆している。健康と病気におけるBBBの役割を研究することが可能になります。この方法はまた、製薬会社のために有用であり得る, これは、人間の脳に候補神経薬の浸透性をスクリーニングするために、この人間のBBBプラットフォームを使用することができます.オルガンオンチップ技術の応用には、通常、専門的なエンジニアリングスキルが必要です。市販のプラットフォームを使用することで、生物学的指向のラボでこの技術を適用できます。まず、準備したチップを含む皿をバイオセーフティキャビネットに持って行きます。P200ピペットを使用して、200マイクロリットルの神経分化媒体を入口に加え、液体を出口から引き出すことによって、両方のチャネルを穏やかに洗浄します。ポートとの接触を避け、チップの表面から余分な媒体液滴を慎重に吸引する。細胞懸濁液を穏やかに撹拌し、均質な細胞懸濁液を確保します。iPSC由来の神経前駆細胞をトップチャネルに播種して脳側を生成するには、1ミリリットル当たり10倍の濃度で30~100マイクロリットルの細胞懸濁液を含むP200チップをトップチャネル入口に加え、ピペットから先端を静かに放出します。空のP200ピペットを取り、プランジャーを押し、上部チャネル出口に挿入し、慎重にチップを通して単一細胞懸濁液を引き出します。チップを顕微鏡に移して、トップチャネル内の細胞の播種密度と均質な分布を確認します。20%のカバレッジで細胞密度を確認した後、すぐに37°Cで2時間インキュベーターにチップを入れます。その後、新鮮な神経分化培地を入口に加え、出口からピペットを介して液体を引っ張ることによって、付着しない細胞を洗い流します。毎日の神経分化培地交換で37°Cの静的条件下で細胞を保ちます。iNPCが取り付けられた後、または播種後のその後の日に、準備されたチップを含む皿をバイオセーフティキャビネットに持って来てください。底流路を200マイクロリットルの内皮細胞培地で静かに洗います。ポートとの接触を避け、チップの表面から過剰な内皮細胞媒体の液滴を慎重に吸引し、両方のチャネルに培地を残すことを確認する。細胞懸濁液を穏やかに撹拌し、均質な細胞懸濁液を確保します。P200ピペットを用いて、iPSC由来脳内皮細胞懸濁液の30~100マイクロリットルを1ミリリットル当たり6個の細胞に14~20倍の濃度で引き上げ、先端をボトムチャネルインレットに入れ口に入れる。機能性バリア特性を達成するための最も重要なステップは、脳内皮細胞の播種である。適切な密度で細胞をシードして、オルガンチップ内の均質な分布を検証するために、泡の形成を避けることは重要です。P200ピペットのプランジャーを空のチップで押し下げ、下チャンネルの出口に挿入し、ピペットプランジャーをゆっくりと解放して、下のチャネルを通して単一細胞の懸濁液を慎重に引っ張ります。余分な細胞懸濁液をチップの表面から吸引する。細胞懸濁液がチャネルから吸引されないように、入口ポートと出口ポートとの直接接触を避けてください。チップを顕微鏡に移して、播種密度を確認します。下のチャネルは、間に観察可能なギャップのないセルで埋められます。正しい細胞密度を確認した後、残りのチップに細胞をシードします。底チャンネルの上部にある多孔質膜に細胞を取り付けるには、各チップを反転させ、チップクレードルで休ませます。150ミリメートル皿の中に滅菌DPBSを含む小さな貯水池を置き、細胞に湿度を提供します。チップを約37°Cで約3時間、または下部チャネルの細胞が取り付けられるまでインキュベートします。iPSC由来の脳内血管内皮細胞が付着したら、チップを直立した位置に戻し、細胞が下部チャネルの下部に付着できるようにします。iPSC由来脳微小血管内皮細胞の播種後48時間、37°Cの水浴で1時間温温することにより内皮細胞培地の温度を平衡化する。次いで、真空駆動ろ過システム下でインキュベーションにより培地を15分間脱気する。次に、70%エタノールで携帯用モジュールのパッケージとトレイの外装を消毒し、拭き取り、バイオセーフティキャビネットに移します。パッケージを開き、モジュールをトレイの奥に向けてリザーバに向けます。各入口貯留層に事前に平衡した、暖かい媒体のピペット3ミリリットル。最下チャネルの入口貯留層に内皮細胞培養培地を加え、上部チャネルの上部チャネル入口貯留部に神経分化培地を加える。次いで、ピペット300マイクロリットルの予め平衡化された、各出口貯留層に、各出口ポートを直接上に向ける。各トレイに最大6台のポータブルモジュールを配置します。トレイをインキュベーターに持ち込み、トレイハンドルを外側に向けて培養モジュールに完全にスライドさせます。カルチャ モジュールでプライム サイクルを選択して実行します。インキュベーターのドアを閉め、培養モジュールがポータブルモジュールを約1分間プライムできるようにします。ステータス バーが準備完了したら、プライミング サイクルが完了します。トレイを培養モジュールから取り出し、バイオセーフティキャビネットに持ち込みます。バイオセーフティキャビネットの各ポータブルモジュールの下側を調べて、ポータブルモジュールが正常にプライミングされたことを確認します。4つのポートすべてに小さな液滴が存在することを探します。任意のポータブルモジュールがドロップレットを表示しない場合は、それらのモジュールのプライムサイクルを再実行します。コンセントポートによって頻繁に発生するトレイにメディアが滴り落ちた場合は、70%エタノールでトレイをクリーニングします。次に、各チップの両方のチャネルを暖かく平衡化された細胞特異的培養培地で穏やかに洗浄し、チャネル内の可能な泡を除去し、各入口と出口ポートの上部に小さなメディアの液滴を置きます。キャリア付きチップをポータブルモジュールに挿入し、各トレイに最大6個を置きます。トレイをカルチャ モジュールに挿入します。流量や伸張などの適切な臓器チップ培養条件を培養モジュールにプログラムします。規制サイクルが完了すると、約2時間かかるとすぐに、プログラムされた条件が開始されます。その後、培養モジュールは、プリセット臓器チップ培養条件で流れ始める。iPSCベースの血液脳関門チップの免疫細胞化学は、7日後に、S100β陽性アストロサイト、ネスチン陽性神経前駆細胞、GFAP陽性アストロサイト、βIIIチューブリン陽性ニューロンを含む、トップ脳側チャネルの混合神経細胞集団に分化されたEZ球を示す。底部の血液側チャネルに播種されたIPSC由来脳微小血管内皮細胞は、GLUT-1およびPECAM-1を発現した。血液脳関門チップ透過性の評価は、iPSC由来脳内皮細胞およびEZ球を播種した臓器チップが、iPSC由来の脳内皮細胞を播種した臓器チップと比較して緊密な障壁を有していたことを示している。EZ球体のみで播種されたオルガンチップは、バリア特性を示さなかった。チャネルの初期表面処理から毎日の媒体切り替えまで、チャネル内の気泡の形成を避ける。表面活性化試薬、細胞外マトリックス、または細胞含有媒体をチャネルを介して挿入する必要があるプロトコルのステップを通して、気泡が見つからないことを注意深く検証することが非常に重要です。透過性アッセイは、候補薬物のヒト脳浸透性を評価するために行うことができる。このアプローチは、潜在的な治療薬をテストするのに役立ちます。iPSCベースのBBBチップを応用することで、様々な神経疾患におけるBBBの役割を研究することができます。将来的には、このようなプラットフォームは、予測的でパーソナライズされた医療アプリケーションに役立つ可能性があります。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Human Adipose Stem Cells through Dedifferentiation of Mature Adipocytes in Ceiling Cultures

天井の培養における成熟脂肪細胞の脱分化を経てヒト脂肪幹細胞の生成

Mature adipocytes have been shown to reverse their phenotype into fibroblast-like cells in vitro through a technique called ceiling culture. Mature ...

Generation of Integration-free Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Hair-derived Keratinocytes

髪の由来ケラチノサイトを使用した統合フリーヒト誘導多能性幹細胞の生成

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using ...

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

失活ヒト真皮を用いて遺伝子組換え器官皮膚培養物の生成

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

ヒトメラノーマ腫瘍浸潤リンパ球から誘導多能性幹細胞の生成

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

ヒト多能性幹細胞から肝細胞様細胞の定義され、スケーラブルな世代

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

初期の神経発達障害をモデル化するためのiPSC由来のヒト脳オルガノイドの生成

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin

世代、大人の肌からプライマリ ヒト角化培養

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. ...

Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids

人間の腸 Organoids 上皮関門の透過性のリアルタイム計測

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted ...

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

ショウジョウバエメラノガスターにおける血液脳関門完全性に関するアッセイ

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous ...

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

多細胞ヒト初等子宮内膜オルガノイドの生成

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...