Name: generation of a human ipsc-based blood-brain barrier chip
Uploaded: 2020-03-02T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of a Human iPSC-Based Blood-Brain Barrier Chip at JoVE.com

Vi vil takke Dr. Soshana Svendsen for kritisk redigering. Dette arbeidet ble støttet av Israel Science Foundation stipend 1621/18, Ministry of Science and Technology (MOST), Israel 3-15647, California Institute for Regenerative Medicine grant Disc1-08800, Sherman Family Foundation, NIH-NINDS stipend 1UG3NS105703, og ALS Association stipend 18-SI-389. AH ble finansiert av Wallenberg Foundation (stipendnummer 2015.0178).

1. Generasjon av iPSC-avledede nevrale stamceller (iNPCer)
<ol><li>Produser EZ-kuler fra iPSC kolonier som beskrevet nedenfor og som tidligere publisert20,21,22.<ol>
<li>Kultur iPSC kolonier for å samtidigpåvirke kjellermembran matrisebelagte 6 brønnplater (0,5 mg/plate) i mTESR1 eller andre kommersielle medier (se Materialtabell).</li>
		<li>Fjern iPSC medium og erstatt med 2 ml EZ-sfæremedium [ESM; DMEM:...

<ol>
	<li>Pardridge, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+endogenous+transporters+as+therapeutic+targets:+a+new+model+for+small+molecule+CNS+drug+discovery.">Blood-brain barrier endogenous transporters as therapeutic targets: a new model for small molecule CNS drug discovery.</a> Expert Opinion on Therapeutic Targets. 19 (8), 1059-1072 (2015).</li><li>Gastfriend, B. D., Palecek, S. P., Shusta, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+blood-brain+barrier:+beyond+the+endothelial+cells.">Modeling the blood-brain barrier: beyond the endothelial cells.</a> Current Opinion in Biomedical Engineering. 5, 6-12 (2018).</li><li>Jamieson, J. J., Linville, R. M., Ding, Y. Y., Gerecht, S., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+iPSC-derived+pericytes+on+barrier+function+of+iPSC-derived+brain+microvascular+endothelial+cells+in+2D+and+3D.">Role of iPSC-derived pericytes on barrier function of iPSC-derived brain microvascular endothelial cells in 2D and 3D.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 16 (1), 15 (2019).</li><li>El-Habashy, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+treatment+strategies+for+brain+tumors+and+metastases.">Novel treatment strategies for brain tumors and metastases.</a> Pharmaceutical Patent Analyst. 3 (3), 279-296 (2014).</li><li>Lim, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntington's+disease+iPSC-derived+brain+microvascular+endothelial+cells+reveal+WNT-mediated+angiogenic+and+blood-brain+barrier+deficits.">Huntington's disease iPSC-derived brain microvascular endothelial cells reveal WNT-mediated angiogenic and blood-brain barrier deficits.</a> Cell Reports. 19 (7), 1365-1377 (2017).</li><li>Dumitrescu, A. M., Liao, X. H., Weiss, R. E., Millen, K., Refetoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+thyroid+hormone+deprivation+and+excess+in+monocarboxylate+transporter+(mct)+8-deficient+mice.">Tissue-specific thyroid hormone deprivation and excess in monocarboxylate transporter (mct) 8-deficient mice.</a> Endocrinology. 147 (9), 4036-4043 (2006).</li><li>Spencer, J. I., Bell, J. S., DeLuca, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+pathology+in+multiple+sclerosis:+reframing+pathogenesis+around+the+blood-brain+barrier.">Vascular pathology in multiple sclerosis: reframing pathogenesis around the blood-brain barrier.</a> Journal of Neurology and Neurosurgical Psychiatry. 89 (1), 42-52 (2018).</li><li>Yamazaki, Y., Kanekiyo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+dysfunction+and+the+pathogenesis+of+Alzheimer's+disease.">Blood-brain barrier dysfunction and the pathogenesis of Alzheimer's disease.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (9), 1965 (2017).</li><li>Ben-Zvi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mfsd2a+is+critical+for+the+formation+and+function+of+the+blood-brain+barrier.">Mfsd2a is critical for the formation and function of the blood-brain barrier.</a> Nature. 509 (7501), 507 (2014).</li><li>Heng, M. Y., Detloff, P. J., Albin, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rodent+genetic+models+of+Huntington+disease.">Rodent genetic models of Huntington disease.</a> Neurobiology of Disease. 32 (1), 1-9 (2008).</li><li>Ho, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALS+disrupts+spinal+motor+neuron+maturation+and+aging+pathways+within+gene+co-expression+networks.">ALS disrupts spinal motor neuron maturation and aging pathways within gene co-expression networks.</a> Nature Neuroscience. 19 (9), 1256 (2016).</li><li>Griep, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BBB+on+chip:+microfluidic+platform+to+mechanically+and+biochemically+modulate+blood-brain+barrier+function.">BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function.</a> Biomedical Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).</li><li>Prabhakarpandian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+tumor+networks+for+screening+drug+delivery+systems.">Synthetic tumor networks for screening drug delivery systems.</a> Journal of controlled release. 201, 49-55 (2015).</li><li>Delsing, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barrier+properties+and+transcriptome+expression+in+human+iPSC-derived+models+of+the+blood-brain+barrier.">Barrier properties and transcriptome expression in human iPSC-derived models of the blood-brain barrier.</a> Stem Cells. 36 (12), 1816-1827 (2018).</li><li>Park, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-enhanced+Blood-Brain+Barrier+Chip+recapitulates+human+barrier+function+and+shuttling+of+drugs+and+antibodies.">Hypoxia-enhanced Blood-Brain Barrier Chip recapitulates human barrier function and shuttling of drugs and antibodies.</a> Nature Communications. 10 (1), 2621 (2019).</li><li>Vatine, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPSC-Derived+Blood-Brain+Barrier+Chips+Enable+Disease+Modeling+and+Personalized+Medicine+Applications.">Human iPSC-Derived Blood-Brain Barrier Chips Enable Disease Modeling and Personalized Medicine Applications.</a> Cell Stem Cell. 24 (6), 995-1005 (2019).</li><li>Henry, O. Y. F., Villenave, R., Cronce, M. J., Leineweber, W. D., Benz, M. A., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organs-on-chips+with+integrated+electrodes+for+trans-epithelial+electrical+resistance+(TEER)+measurements+of+human+epithelial+barrier+function.">Organs-on-chips with integrated electrodes for trans-epithelial electrical resistance (TEER) measurements of human epithelial barrier function.</a> Lab on a Chip. 17 (13), 2264-2271 (2017).</li><li>Sances, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPSC-derived+endothelial+cells+and+microengineered+organ+chip+enhance+neuronal+development.">Human iPSC-derived endothelial cells and microengineered organ chip enhance neuronal development.</a> Stem Cell Reports. 10 (4), 1222-1236 (2018).</li><li>Workman, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+utilization+of+induced+pluripotent+stem+cell&#8211;derived+human+intestinal+organoids+using+microengineered+chips.">Enhanced utilization of induced pluripotent stem cell&#8211;derived human intestinal organoids using microengineered chips.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 669-677 (2018).</li><li>Ebert, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EZ+spheres:+a+stable+and+expandable+culture+system+for+the+generation+of+pre-rosette+multipotent+stem+cells+from+human+ESCs+and+iPSCs.">EZ spheres: a stable and expandable culture system for the generation of pre-rosette multipotent stem cells from human ESCs and iPSCs.</a> Stem Cell Research. 10 (3), 417-427 (2013).</li><li>Shelley, B. C., Gowing, G., Svendsen, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cGMP-applicable+expansion+method+for+aggregates+of+human+neural+stem+and+progenitor+cells+derived+from+pluripotent+stem+cells+or+fetal+brain+tissue.">A cGMP-applicable expansion method for aggregates of human neural stem and progenitor cells derived from pluripotent stem cells or fetal brain tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), e51219 (2014).</li><li>Vatine, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+psychomotor+retardation+using+iPSCs+from+MCT8-deficient+patients+indicates+a+prominent+role+for+the+blood-brain+barrier.">Modeling psychomotor retardation using iPSCs from MCT8-deficient patients indicates a prominent role for the blood-brain barrier.</a> Cell Stem Cell. 20 (6), 831-843 (2017).</li><li>Svendsen, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+the+rapid+and+long+term+growth+of+human+neural+precursor+cells.">A new method for the rapid and long term growth of human neural precursor cells.</a> Journal of Neuroscience Methods. 85 (2), 141-152 (1998).</li><li>Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+retinoic+acid-enhanced,+multicellular+human+blood-brain+barrier+model+derived+from+stem+cell+sources.">A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources.</a> Scientific Reports. 4, 4160 (2014).</li><li>Canfield, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+isogenic+blood-brain+barrier+model+comprising+brain+endothelial+cells,+astrocytes,+and+neurons+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">An isogenic blood-brain barrier model comprising brain endothelial cells, astrocytes, and neurons derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Journal of Neurochemistry. 140 (6), 874-888 (2017).</li><li>Jamieson, J. J., Gerecht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chipping+Away+at+Blood-Brain-Barrier+Modeling.">Chipping Away at Blood-Brain-Barrier Modeling.</a> Cell stem cell. 24 (6), 831-832 (2019).</li><li>Faal, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Mesoderm+and+Neural+Crest-Derived+Pericytes+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells+to+Study+Blood-Brain+Barrier+Interactions.">Induction of Mesoderm and Neural Crest-Derived Pericytes from Human Pluripotent Stem Cells to Study Blood-Brain Barrier Interactions.</a> Stem Cell Reports. 12 (3), 451-460 (2019).</li><li>Lippmann, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+blood-brain+barrier+endothelial+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 30 (8), 783 (2012).</li><li>Qian, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+blood-brain+barrier+endothelial+cells.">Directed differentiation of human pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells.</a> Science Advances. 3 (11), 1701679 (2017).</li><li>Neal, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified,+Fully+Defined+Differentiation+Scheme+for+Producing+Blood-Brain+Barrier+Endothelial+Cells+from+Human+iPSCs.">A Simplified, Fully Defined Differentiation Scheme for Producing Blood-Brain Barrier Endothelial Cells from Human iPSCs.</a> Stem Cell Reports. 12 (6), 1380-1388 (2019).</li><li>Wevers, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+perfused+human+blood-brain+barrier+on-a-chip+for+high-throughput+assessment+of+barrier+function+and+antibody+transport.">A perfused human blood-brain barrier on-a-chip for high-throughput assessment of barrier function and antibody transport.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 15 (1), 23 (2018).</li><li>Huh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabrication+of+human+organs-on-chips.">Microfabrication of human organs-on-chips.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2135 (2013).</li><li>Huh, D., Matthews, B. D., Mammoto, A., Montoya-Zavala, M., Hsin, H. Y., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+organ-level+lung+functions+on+a+chip.">Reconstituting organ-level lung functions on a chip.</a> Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).</li></ol>

Kombinasjonen av organ-on-chip-teknologi og iPSC-avledede celler i NVU holder løfte om nøyaktig modellering av det menneskelige BBB. Her gir vi en detaljert protokoll for enkel og robust anvendelse av den nylig publiserte iPSC-baserte BBB-chip16. En oversikt og tidspunkt for frøing paradigme er vist i figur 3. For å oppnå og vedlikeholde barrierefunksjoner som er egnet for BBB-modellering, er det avgjørende å generere en homogen iBMEC monolayer og beholde integ...

BBB er en svært selektiv barriere som skiller CNS fra det sirkulerende blodet. Det beskytter kritiske hjernefunksjoner mot potensielt forstyrrende stoffer, faktorer og xenobiotika samtidig som tilstrømningen av næringsstoffer og andre metabolitter som kreves for å opprettholde hjernens homeostase1. BBB er en flercellet NVU der pericytes, astrocyttende endeføtter og nevronale prosesser direkte kontakter hjernens mikrovaskulære endotelceller (BMECer). Disse interaksjonene tillater BMECs å danne spesialiserte barriereegenskaper som støttes av stramme og overholder veikryss2,3. Dannelsen av denne barrieren begrenser paracellulær passasje av molekyler, men den inneholder polariserte transportører for å aktivt transportere molekyler inn i CNS eller tilbake i blodet1. På grunn av disse unike barriereegenskapene utgjør BBB et stort hinder for levering av biofarmasi i hjernen, og det er anslått at mindre enn 5% av FDA-godkjente små molekyler kan nå CNS4.
Dyremodeller har blitt mye brukt til å studere BBB-penetans og de molekylære mekanismene som er involvert i BBB-utvikling5. Mens dyremodeller trofast representerer det komplekse flercellulære in vivo-miljøet, utelukker forskjeller i uttrykk og aktivitet av BBB-transportører samt substratspesifisitet på tvers av arter ofte nøyaktig ekstrapolering av dyredata til mennesker6. Dermed er menneskebaserte modeller avgjørende for å studere den menneskelige BBB og for bruk i utviklingen av legemidler designet for å målrette CNS. Dette behovet blir enda tydeligere med den økende dominansen av biologiske, menneskespesifikke legemidler i det farmasøytiske utviklingsfeltet. Akkumulerende bevis tyder på at en kompromittert BBB er forbundet med en rekke alvorlige CNS lidelser, inkludert hjernesvulster og nevrologiske sykdommer7,8,9. Menneskelige modeller som trofast reflekterer disse sykdommene har potensial til både 1) identifisere nye veier som kan målrettes for narkotikautvikling og 2) forutsi CNS penetan, og dermed redusere tid og ressurser i prekliniske studier og muligens redusere svikt i kliniske studier.
In vitro-modeller har blitt mye implementert for å studere interaksjoner mellom BMECs og andre celler i NVU og gjennomføre skjermer for potensielle BBB-permeable legemidler10. For å gjenskape viktige aspekter ved den menneskelige BBB, må in vitro-modellene vise fysiologisk relevante egenskaper (dvs. lav paracellulær permeabilitet og fysiologisk relevant transendothelial elektrisk motstand [TEER] på tvers av den endoteliske monolayer). I tillegg må den molekylære profilen til et in vitro-system inkludere uttrykk for representative funksjonelle transportsystemer. Vanligvis består in vitro-modeller av endotelceller som er co-cultured på en semipermeable membran med kombinasjoner av andre NVU-celler for å forbedre BBB egenskaper11. Denne tilnærmingen gir enkel og relativt rask vurdering av barrierefunksjonalitet og molekylgjennomtrengelighet. Slike cellebaserte BBB-modeller kan etableres med dyre- eller menneskecellekilder, inkludert celler isolert fra kirurgiske eksisjoner eller udødelige BMEC-linjer.
Nylig ble protokoller for å differensiere menneskelige pluripotente celler i BMECer introdusert som en attraktiv kilde for in vitro menneskelige BBB-modeller12,13. Indusert pluripotent stamcelle (iPSC)-avledede BMECs (iBMECs) er svært skalerbare, viser avgjørende morfologiske og funksjonelle egenskaper ved den menneskelige BBB, og bærer genetikken til pasienten. I kulturen danner iBMECs et monolayer som uttrykker stramme koblingsmarkører og viser i vivo-lignende tette koblingskomplekser. Disse cellene uttrykker også BBB-markører, inkludert BBB glukosetransportør, glukosetransportør 1 (GLUT1). Viktigere, og i motsetning til andre alternative cellekilder for menneskelige BMECer, iBMECs skaffe barriere egenskaper med verdier så høyt som de målt in vivo14, polarisere langs basolateral eakse, og uttrykke funksjonelle efflux pumper. Videre ønsker bruk av iPSCer fra ulike begge 1) muligheten til å teste aspekter av BBB på en personlig medisin måte og 2) gir en fleksibel kilde for å generere flere celletyper av NVU. Generere disse cellene fra en isogen cellekilde for å lage personlige BBB chips ville også hjelpe i å forstå mellom individuelle forskjeller i narkotikaresponser, som er en viktig årsak til motstand eller kompromittert respons på behandling observert i kliniske studier.
Bruk av iBMECs som monolayers i en tallerken eller på en semi gjennomtrengelig transwell innsats representerer en kraftig tilnærming for BBB modellering. Disse systemene har en tendens til å være robuste, reproduserbare og kostnadseffektive. I tillegg er funksjonelle analyser som TEER og permeabilitet relativt enkle å utføre. Todimensjonale (2D) systemer klarer imidlertid ikke å rekapitulere 3D-naturen til in vivo-vev, og de mangler de fysiologiske skjærstresskreftene som tilbys av sirkulerende blod og blodceller. Dette begrenser evnen til vaskulær endotel i disse modellene for å utvikle og opprettholde iboende BBB egenskaper og funksjoner.
Mikrokonstruerte systemer foret av levende celler har blitt implementert for å modellere ulike organfunksjoner i et konsept som kalles organ-on-chips. Ved å gjenskape in vivo-lignende flercellet arkitektur, vevsgrensesnitt, fysikokjemiske mikromiljøer og vaskulær perfusjon, genererer disse mikrokonstruerte plattformene nivåer av vev og organfunksjonalitet som ikke er mulig med konvensjonelle 2D kultursystemer. De muliggjør også høyoppløselig, sanntidsavbildning og analyse av biokjemiske, genetiske og metabolske profiler som ligner på levende celler i in vivo vev og organkontekst. En spesiell utfordring av organ-on-chip er imidlertid at design, fabrikasjon og anvendelse av disse mikrokonstruerte chips krever spesialisert ingeniørkompetanse som vanligvis mangler i biologisk orienterte akademiske laboratorier.
Vi har nylig kombinert iPSC og organ-on-chip teknologier for å generere en personlig BBB chip modell15,16. For å overvinne de teknologiske utfordringene som er beskrevet, brukes den kommersielt tilgjengelige Chip-S1 sammen med kulturmodulen, et instrument designet for å automatisere vedlikeholdet av sjetongene på en enkel og robust måte (Emuler Inc.). BBB-brikken gjenskaper interaksjoner mellom nevrale og endotelceller og oppnår fysiologisk relevante TEER-verdier, som måles ved skreddersydde organbrikker med integrerte gullelektroder17. I tillegg viser BBB-brikken lav paracellulær permeabilitet, reagerer på inflammatoriske signaler på orgelnivå, uttrykker aktive efflux pumper, og viser prediktiv transport av løselige biomarkører og biofarmasi. Spesielt fanger BBB-chips generert fra flere personer de forventede funksjonelle forskjellene mellom friske individer og pasienter med nevrologiske sykdommer15.
Protokollen som er beskrevet nedenfor beskriver en pålitelig, effektiv og reproduserbar metode for generering av humane iPSC-baserte BBB-brikker under dynamiske strømningsforhold. Veiledning gis om typen analyser og endepunktsanalyser som kan utføres direkte i BBB-chipen eller fra prøvetaking av avløpsvann. Dermed demonstrerer protokollen spekteret av teknikker som kan brukes for evaluering av biologiske og funksjonelle egenskaper og svar i en menneskelig relevant modell.
En kort beskrivelse av iPSC-baserte BBB-chip er gitt her. Menneskelige iPSCer er i utgangspunktet differensiert og forplantes i vevkulturflasker som frittflytende aggregater av nevrale forfedre, kalt EZ-sfærer. Den øverste kanalen av Chip-S116,18,19 er seeded med dissosierte EZ-kuler som danner "hjernen side" av chip, som celler skiller over 7 dager inn i en blandet kultur av nevrale stamceller (iNPCer), iAstrocytes, og iNeurons. Menneskelige iPSCer er også differensiert i vevkulturplater til iBMECs. Den nederste kanalen av brikken er seeded med iBMECs å danne "blod siden" som de utvikler seg for å danne en endotelrør (Figur 1). Den porøse ekstracellulære matrisen (ECM)-belagt membran som skiller topp- og bunnkanalene 1) tillater dannelsen av celle-til-celle-interaksjoner mellom kanaler og 2) gjør det mulig for brukeren å kjøre permeabilitetsanalyser og bildeceller i begge kanalene ved hjelp av et konvensjonelt lysmikroskop.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SCR005</td>
			<td>Dissociation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bfgf</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chip-S1</td>
			<td>Emulate Inc</td>
			<td>Chip-S1</td>
			<td>Organ-Chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D3571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran-FITC</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>46944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM: F12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31330038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emulate Reagent 1 (ER-1)</td>
			<td>Emulate Inc</td>
			<td>ER-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emulate Reagent 2 (ER-2)</td>
			<td>Emulate Inc</td>
			<td>ER-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP)</td>
			<td>Dako</td>
			<td>Z0334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GLUT-1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MA5-11315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050038</td>
			<td>Glutamine supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hBDNF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOSR</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>Basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>StemCell Technologies, Inc.</td>
			<td>85851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA</td>
			<td>Biological industries</td>
			<td>01-340-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nestin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NutriStem</td>
			<td>Biological industries</td>
			<td>05-100-1A</td>
			<td>Alternate media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PECAM-1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platelet-poor plasma-derived bovine serum (PPP)</td>
			<td>Biomedical Technologies</td>
			<td>J64483AB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid (RA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S100&#946;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZO-1 Monoclonal Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>33-9100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;III-tubulin (Tuj1&#945;)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>31350010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of a human ipsc-based blood-brain barrier chip

Blodhjernebarrieren (BBB) dannes av nevrovaskulære enheter (NVUer) som beskytter sentralnervesystemet (CNS) fra en rekke faktorer som finnes i blodet som kan forstyrre delikat hjernefunksjon. Som sådan er BBB et stort hinder for levering av terapeutiske midler til CNS. Akkumulerende bevis tyder på at BBB spiller en nøkkelrolle i utbruddet og progresjonen av nevrologiske sykdommer. Dermed er det et enormt behov for en BBB-modell som kan forutsi penetrasjon av CNS-målrettede legemidler, samt belyse BBBs rolle i helse og sykdom.
Vi har nylig kombinert organ-on-chip og indusert pluripotent stamcelle (iPSC) teknologier for å generere en BBB chip fullt personlig til mennesker. Denne nye plattformen viser cellulære, molekylære og fysiologiske egenskaper som er egnet for prediksjon av narkotika- og molekyltransport over hele den menneskelige BBB. Videre, ved hjelp av pasientspesifikke BBB-chips, har vi generert modeller av nevrologisk sykdom og demonstrert potensialet for personlige prediktive medisinapplikasjoner. Gitt her er en detaljert protokoll som viser hvordan å generere iPSC-avledede BBB chips, som begynner med differensiering av iPSC-avledet hjerne mikrovaskulære endotelceller (iBMECs) og resulterer i blandede nevrale kulturer som inneholder nevrale forfedre, differensierte nevroner og astrocytter. Også beskrevet er en prosedyre for seeding celler i orgelchip og kuling av BBB chips under kontrollert lamimer flyt. Til slutt er detaljerte beskrivelser av BBB-chipanalyser gitt, inkludert paracellulær permeabilitetsanalyser for vurdering av legemiddel og molekylpermeabilitet samt immuncytokjemiske metoder for å bestemme sammensetningen av celletyper i brikken.

Figur 6A,B,C representerer en BBB chip seeded med EZ-kuler på "hjernesiden" toppkanal og iBMECs på "blodsiden"" bunnkanal. iBMECs ble seeded først og lov til å feste over natten, hvoretter EZ-sfærer ble seeded. Chips ble deretter kultivert under statiske forhold med daglig medieerstatning i syv dager. BBB-brikken ble deretter fikset ved hjelp av 4% PFA ved RT i 10 min og vasket 3x med DPBS. Immuncytokjemi ble utført på BBB-chipen ved hjelp av 1) nestin som markør for...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of a Human iPSC-Based Blood-Brain Barrier Chip at JoVE.com

Generation of a Human iPSC-Based Blood-Brain Barrier Chip

Blod-hjernebarrieren (BBB) er en flercellet nevrovaskulær enhet som regulerer hjernens homeostase tett. Ved å kombinere menneskelige iPSCer og organ-on-chip-teknologier, har vi generert en personlig BBB-chip, egnet for sykdomsmodellering og CNS-prognoser for legemiddelpenetrabilitet. En detaljert protokoll er beskrevet for generering og drift av BBB-chipen.

Generasjon av en human iPSC-basert blod-brain barriere chip

The blood brain barrier (BBB) is formed by neurovascular units (NVUs) that shield the central nervous system (CNS) from a range of factors found in the ...

Denne protokollen vil demonstrere hvordan differensierte induserte pluripotente stamceller kan seedes på et organ-on-chip for å generere en fullt menneskelig, personlig, mikrofluidisk blod-hjernebarriere, som kan brukes til å forutsi sentralnervesystemets narkotikapermeabilitet og for å studere nevrologiske lidelser. Ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig organ-on-chip, vil vi demonstrere hvordan et hvert biologisk orientert laboratorium kan bruke denne teknologien til å generere en personlig, mikrofluidisk blod-hjernebarriere-on-chip. Akkumulerende bevis tyder på at BBB spiller en rolle i nevrologisk sykdom ved å generere personlige BBB chips avledet fra iPSCs av personer med en genetisk nevrologisk sykdom.Det vil være mulig å studere BBB-rollen i helse og sykdom. Denne metoden kan også være nyttig for farmasøytiske selskaper, som kan bruke denne menneskelige BBB-plattformen til å screene for penetrerbarheten av kandidat nevrologiske legemidler inn i den menneskelige hjernen. Anvendelsen av organ-on-chip teknologier krever vanligvis spesialiserte ingeniørferdigheter.Ved hjelp av kommersielt tilgjengelige plattformer gjør det mulig å bruke denne teknologien i ethvert biologisk orientert laboratorium. For å begynne, ta med parabolen som inneholder de tilberedte chips til biosikkerhetsskapet. Bruk en P200-pipette til å vaske begge kanalene forsiktig ved å tilsette 200 mikroliter med nevral differensieringsmedium i innløpet og trekke væsken fra uttaket.Unngå kontakt med portene, nøye aspirere overflødige mediedråper fra overflaten av brikken. Rør forsiktig cellefjæringen for å sikre en homogen cellesuspensjon. For å så de iPSC-avledede nevrale stamcellene inn i toppkanalen for å generere hjernesiden, legg til en P200-spiss som inneholder 30 til 100 mikroliter cellesuspensjon ved konsentrasjonen av en gang 10 til de seks cellene per milliliter til toppkanalinntaket, og slipp forsiktig spissen fra pipetten.Ta en tom P200 pipette, trykk stempelet, sett inn i toppkanaluttaket, og trekk forsiktig encelledeturen gjennom spissen. Overfør brikken til mikroskopet for å sjekke såetettheten og homogen fordeling av celler i toppkanalen. Etter å ha bekreftet celletettheten ved 20% dekning, legg umiddelbart sjetongene i inkubatoren i to timer ved 37 grader Celsius.Deretter vasker du bort cellene som ikke festes ved å legge til frisk nevrale differensieringsmedium i innløpet og trekke væsken via pipette fra stikkontakten. Hold cellene under statiske forhold ved 37 grader Celsius med en daglig neural differensieringsmiddelerstatning. Etter at iNPCer har festet eller på en påfølgende dag etter såing, ta med parabolen som inneholder de tilberedte chips til biosikkerhetsskapet.Vask forsiktig bunnkanalen med 200 mikroliter endotelcellemedium. Unngå kontakt med portene, nøye aspirere dråper av overflødig endotelcellemedium fra overflaten av brikken, og sørg for å forlate medium i begge kanaler. Rør forsiktig cellefjæringen for å sikre en homogen cellesuspensjon.Bruk en P200 pipette, trekk opp 30 til 100 mikroliter av den iPSC-avledede hjernen mikrovaskulære endotelcelleoppheng ved konsentrasjonen av 14 til 20 ganger 10 til de seks cellene per milliliter, og plasser spissen i bunnkanalinntaket. Det mest kritiske trinnet for å oppnå funksjonelle barriereegenskaper er såing av hjernens mikrovaskulære endotelceller. Det er avgjørende for frøceller med riktig tetthet for å unngå bobledannelse for å verifisere homogen fordeling i organbrikken.Trykk stempelet på en P200-pipette med en tom spiss, sett inn i det nederste kanaluttaket, og slipp pipettestempelet langsomt for å trekke enkeltcellefjæringen forsiktig gjennom den nederste kanalen. Aspirer overflødig celle suspensjon fra overflaten av brikken. Unngå direkte kontakt med innløps- og utløpsportene for å sikre at ingen cellefjæring aspireres ut av kanalene.Overfør brikken til mikroskopet for å sjekke såetettheten. Den nederste kanalen er fylt med celler uten observerbare hull i mellom. Etter å ha bekreftet riktig celletetthet, frø cellene i de resterende chips.For å feste cellene på den porøse membranen, som ligger på toppen av bunnkanalen, inverter hver brikke, og la dem hvile i en chip vugge. Plasser et lite reservoar som inneholder sterile DPBS inne i 150-millimeters parabolen for å gi fuktighet til cellene. Inkuber sjetongene ved 37 grader Celsius i omtrent tre timer eller til celler i bunnkanalen har festet seg.Når de iPSC-avledede mikrovaskulære hjernecellene har festet seg, vender du sjetongene tilbake til en oppreist stilling for å tillate celletilbehør til den nederste delen av bunnkanalen. 48 timer etter såing av iPSC-avledede hjerne mikrovaskulære endotelceller, likevekt temperaturen på endotelcellemediet ved oppvarming i et 37-graders Celsius vannbad i en time. Deretter degas mediet ved inkubasjon under et vakuumdrevet filtreringssystem i 15 minutter.Deretter renser du utsiden av den bærbare modulemballasjen og skuffene med 70% etanol, tørk og overfører dem til biosikkerhetsskapet. Åpne pakken, og plasser modulene i skuffen Orienter dem med reservoarene mot baksiden av skuffen. Pipette tre milliliter av pre-equilibrated, varmt medium til hvert innløp reservoar.Legg endotelcellekulturmedium til innløpsreservoaret på bunnkanalen og nevrale differensieringsmediet til toppkanalinntaksreservoaret på toppkanalen. Deretter pipette 300 mikroliter av pre-likevektet, varmt medium til hvert utløp reservoar, rett over hver utløpsport. Plasser opptil seks bærbare moduler på hver skuff.Ta skuffene til inkubatoren, og skyv helt inn i kulturmodulen med skuffhåndtaket vendt utover. Velg og kjør hovedsyklusen på kulturmodulen. Lukk inkubatordøren, og la kulturmodulen prime de bærbare modulene i omtrent ett minutt.Grunningssyklusen fullføres når statuslinjen leser klar. Fjern brettet fra kulturmodulen, og ta den med til biosikkerhetsskapet. Inspiser undersiden av hver bærbare modul i biosikkerhetskabinettet for å kontrollere at de bærbare modulene ble primet.Se etter tilstedeværelsen av små dråper på alle fire porter. Hvis en bærbar modul ikke viser dråper, kjører du prime syklusen på disse modulene. Hvis noe papir dryppet på skuffen, som forekommer oftere av utløpsportene, rengjør du skuffen med 70% etanol.Deretter vasker du forsiktig begge kanalene på hver brikke med varmt, likevektscellespesifikt kulturmedium for å fjerne eventuelle bobler i kanalen, og legg små dråper med medier på toppen av hver innløps- og utløpsport. Sett sjetongene med bærere inn i de bærbare modulene, og legg opptil seks på hver skuff. Sett skuffene inn i kulturmodulen.Programmer de aktuelle organbrikkekulturforholdene, for eksempel strømningshastighet og stretch, på kulturmodulen. Så snart reguleringssyklusen er fullført, noe som tar omtrent to timer, starter de programmerte forholdene. Etter det begynner kulturmodulen å strømme på de forhåndsinnstilte organbrikkekulturforholdene.Immunocytochemistry på iPSC-baserte blod-hjerne barrier chip syv dager etter seeding viser EZ sfærer differensiert i en blandet nevrale cellepopulasjon i den øverste hjernen sidekanal, inkludert S100 beta-positive astrocytter, Nestin-positive nevrale stamceller, samt GFAP-positive astrocytter, og beta III tubulin-positive nevroner. IPSC-avledede mikrovaskulære hjerneludokulære endotelceller seeded i den nederste blodsidekanalen uttrykte GLUT-1 og PECAM-1. Evaluering av blod-hjerne barriere chip permeabilitet viser at organbrikken seeded med iPSC-avledet hjerne mikrovaskulære endotelceller og EZ kuler hadde en stram barriere sammenlignet med organchips seeded med iPSC-avledede hjernen mikrovaskulære endotelceller alene.Organchips seeded med EZ kuler alene viste ingen barriere egenskaper. Fra den første overflatebehandlingen av kanalen til medium-vekslingen hver dag, unngå bobledannelse i kanalen. Gjennom hele trinnet i protokollen der overflateaktiveringsreagens, ekstracellulær matrise eller celleholdig medium må settes inn gjennom kanalene, er det ekstremt viktig å nøye kontrollere at ingen boble er funnet.Permeabilitetsanalysen kan utføres for å vurdere den menneskelige hjerneens penetrerbarhet av kandidatmedisiner. Denne tilnærmingen kan tjene for testing av potensielle terapeutiske midler. Anvendelsen av den iPSC-baserte BBB-brikken gjør det mulig å studere BBB-rollen i ulike nevrologiske sykdommer.I fremtiden kan en slik plattform være nyttig for prediktive, personlige medisinapplikasjoner.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Human Adipose Stem Cells through Dedifferentiation of Mature Adipocytes in Ceiling Cultures

Generation of Human adipose stamceller gjennom Dedifferentiation av Mature Adipocytter i Ceiling kulturer

Mature adipocytes have been shown to reverse their phenotype into fibroblast-like cells in vitro through a technique called ceiling culture. Mature ...

Generation of Integration-free Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Hair-derived Keratinocytes

Generasjon Integrerings- fritt menneskeskapte Pluripotent stamceller Bruke Hair-avledet Keratinocytter

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using ...

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

Generering av genmodifiserte organotypiske Skin kulturer Bruke devitalized Menneskelig Dermis

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

Generering av Induced Pluripotent stamceller fra humane melanom Tumor-infiltrerende lymfocytter

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Definert og Scalable Generation of hepatocytter lignende celler fra menneskelige Pluripotent stamceller

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

Generering av IPSC-avledet menneskelige hjerne Organoids til Model Tidlig nevrologiske lidelser

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin

Generasjon og dyrking av primære menneskelige keratinocytter fra voksen hud

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. ...

Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids

Sanntids måling av epitelial barriere permeabilitet i menneskelig Intestinal Organoids

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted ...

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Analysen for Blood-Brain Barrier integritet i Drosophila melanogaster

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous ...

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

Generering av flercellede Human Primary livmor Organoids

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...