Name: generation of a human ipsc-based blood-brain barrier chip
Uploaded: 2020-03-02T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of a Human iPSC-Based Blood-Brain Barrier Chip at JoVE.com

Vi vil takke Dr. Soshana Svendsen for kritisk redigering. Dette arbeidet ble støttet av Israel Science Foundation stipend 1621/18, Ministry of Science and Technology (MOST), Israel 3-15647, California Institute for Regenerative Medicine grant Disc1-08800, Sherman Family Foundation, NIH-NINDS stipend 1UG3NS105703, og ALS Association stipend 18-SI-389. AH ble finansiert av Wallenberg Foundation (stipendnummer 2015.0178).

1. Generasjon av iPSC-avledede nevrale stamceller (iNPCer)
<ol><li>Produser EZ-kuler fra iPSC kolonier som beskrevet nedenfor og som tidligere publisert20,21,22.<ol>
<li>Kultur iPSC kolonier for å samtidigpåvirke kjellermembran matrisebelagte 6 brønnplater (0,5 mg/plate) i mTESR1 eller andre kommersielle medier (se Materialtabell).</li>
		<li>Fjern iPSC medium og erstatt med 2 ml EZ-sfæremedium [ESM; DMEM:...

<ol>
	<li>Pardridge, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+endogenous+transporters+as+therapeutic+targets:+a+new+model+for+small+molecule+CNS+drug+discovery.">Blood-brain barrier endogenous transporters as therapeutic targets: a new model for small molecule CNS drug discovery.</a> Expert Opinion on Therapeutic Targets. 19 (8), 1059-1072 (2015).</li><li>Gastfriend, B. D., Palecek, S. P., Shusta, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+blood-brain+barrier:+beyond+the+endothelial+cells.">Modeling the blood-brain barrier: beyond the endothelial cells.</a> Current Opinion in Biomedical Engineering. 5, 6-12 (2018).</li><li>Jamieson, J. J., Linville, R. M., Ding, Y. Y., Gerecht, S., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+iPSC-derived+pericytes+on+barrier+function+of+iPSC-derived+brain+microvascular+endothelial+cells+in+2D+and+3D.">Role of iPSC-derived pericytes on barrier function of iPSC-derived brain microvascular endothelial cells in 2D and 3D.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 16 (1), 15 (2019).</li><li>El-Habashy, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+treatment+strategies+for+brain+tumors+and+metastases.">Novel treatment strategies for brain tumors and metastases.</a> Pharmaceutical Patent Analyst. 3 (3), 279-296 (2014).</li><li>Lim, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntington's+disease+iPSC-derived+brain+microvascular+endothelial+cells+reveal+WNT-mediated+angiogenic+and+blood-brain+barrier+deficits.">Huntington's disease iPSC-derived brain microvascular endothelial cells reveal WNT-mediated angiogenic and blood-brain barrier deficits.</a> Cell Reports. 19 (7), 1365-1377 (2017).</li><li>Dumitrescu, A. M., Liao, X. H., Weiss, R. E., Millen, K., Refetoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+thyroid+hormone+deprivation+and+excess+in+monocarboxylate+transporter+(mct)+8-deficient+mice.">Tissue-specific thyroid hormone deprivation and excess in monocarboxylate transporter (mct) 8-deficient mice.</a> Endocrinology. 147 (9), 4036-4043 (2006).</li><li>Spencer, J. I., Bell, J. S., DeLuca, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+pathology+in+multiple+sclerosis:+reframing+pathogenesis+around+the+blood-brain+barrier.">Vascular pathology in multiple sclerosis: reframing pathogenesis around the blood-brain barrier.</a> Journal of Neurology and Neurosurgical Psychiatry. 89 (1), 42-52 (2018).</li><li>Yamazaki, Y., Kanekiyo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+dysfunction+and+the+pathogenesis+of+Alzheimer's+disease.">Blood-brain barrier dysfunction and the pathogenesis of Alzheimer's disease.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (9), 1965 (2017).</li><li>Ben-Zvi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mfsd2a+is+critical+for+the+formation+and+function+of+the+blood-brain+barrier.">Mfsd2a is critical for the formation and function of the blood-brain barrier.</a> Nature. 509 (7501), 507 (2014).</li><li>Heng, M. Y., Detloff, P. J., Albin, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rodent+genetic+models+of+Huntington+disease.">Rodent genetic models of Huntington disease.</a> Neurobiology of Disease. 32 (1), 1-9 (2008).</li><li>Ho, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALS+disrupts+spinal+motor+neuron+maturation+and+aging+pathways+within+gene+co-expression+networks.">ALS disrupts spinal motor neuron maturation and aging pathways within gene co-expression networks.</a> Nature Neuroscience. 19 (9), 1256 (2016).</li><li>Griep, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BBB+on+chip:+microfluidic+platform+to+mechanically+and+biochemically+modulate+blood-brain+barrier+function.">BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function.</a> Biomedical Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).</li><li>Prabhakarpandian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+tumor+networks+for+screening+drug+delivery+systems.">Synthetic tumor networks for screening drug delivery systems.</a> Journal of controlled release. 201, 49-55 (2015).</li><li>Delsing, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barrier+properties+and+transcriptome+expression+in+human+iPSC-derived+models+of+the+blood-brain+barrier.">Barrier properties and transcriptome expression in human iPSC-derived models of the blood-brain barrier.</a> Stem Cells. 36 (12), 1816-1827 (2018).</li><li>Park, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-enhanced+Blood-Brain+Barrier+Chip+recapitulates+human+barrier+function+and+shuttling+of+drugs+and+antibodies.">Hypoxia-enhanced Blood-Brain Barrier Chip recapitulates human barrier function and shuttling of drugs and antibodies.</a> Nature Communications. 10 (1), 2621 (2019).</li><li>Vatine, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPSC-Derived+Blood-Brain+Barrier+Chips+Enable+Disease+Modeling+and+Personalized+Medicine+Applications.">Human iPSC-Derived Blood-Brain Barrier Chips Enable Disease Modeling and Personalized Medicine Applications.</a> Cell Stem Cell. 24 (6), 995-1005 (2019).</li><li>Henry, O. Y. F., Villenave, R., Cronce, M. J., Leineweber, W. D., Benz, M. A., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organs-on-chips+with+integrated+electrodes+for+trans-epithelial+electrical+resistance+(TEER)+measurements+of+human+epithelial+barrier+function.">Organs-on-chips with integrated electrodes for trans-epithelial electrical resistance (TEER) measurements of human epithelial barrier function.</a> Lab on a Chip. 17 (13), 2264-2271 (2017).</li><li>Sances, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPSC-derived+endothelial+cells+and+microengineered+organ+chip+enhance+neuronal+development.">Human iPSC-derived endothelial cells and microengineered organ chip enhance neuronal development.</a> Stem Cell Reports. 10 (4), 1222-1236 (2018).</li><li>Workman, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+utilization+of+induced+pluripotent+stem+cell&#8211;derived+human+intestinal+organoids+using+microengineered+chips.">Enhanced utilization of induced pluripotent stem cell&#8211;derived human intestinal organoids using microengineered chips.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 669-677 (2018).</li><li>Ebert, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EZ+spheres:+a+stable+and+expandable+culture+system+for+the+generation+of+pre-rosette+multipotent+stem+cells+from+human+ESCs+and+iPSCs.">EZ spheres: a stable and expandable culture system for the generation of pre-rosette multipotent stem cells from human ESCs and iPSCs.</a> Stem Cell Research. 10 (3), 417-427 (2013).</li><li>Shelley, B. C., Gowing, G., Svendsen, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cGMP-applicable+expansion+method+for+aggregates+of+human+neural+stem+and+progenitor+cells+derived+from+pluripotent+stem+cells+or+fetal+brain+tissue.">A cGMP-applicable expansion method for aggregates of human neural stem and progenitor cells derived from pluripotent stem cells or fetal brain tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), e51219 (2014).</li><li>Vatine, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+psychomotor+retardation+using+iPSCs+from+MCT8-deficient+patients+indicates+a+prominent+role+for+the+blood-brain+barrier.">Modeling psychomotor retardation using iPSCs from MCT8-deficient patients indicates a prominent role for the blood-brain barrier.</a> Cell Stem Cell. 20 (6), 831-843 (2017).</li><li>Svendsen, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+the+rapid+and+long+term+growth+of+human+neural+precursor+cells.">A new method for the rapid and long term growth of human neural precursor cells.</a> Journal of Neuroscience Methods. 85 (2), 141-152 (1998).</li><li>Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+retinoic+acid-enhanced,+multicellular+human+blood-brain+barrier+model+derived+from+stem+cell+sources.">A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources.</a> Scientific Reports. 4, 4160 (2014).</li><li>Canfield, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+isogenic+blood-brain+barrier+model+comprising+brain+endothelial+cells,+astrocytes,+and+neurons+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">An isogenic blood-brain barrier model comprising brain endothelial cells, astrocytes, and neurons derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Journal of Neurochemistry. 140 (6), 874-888 (2017).</li><li>Jamieson, J. J., Gerecht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chipping+Away+at+Blood-Brain-Barrier+Modeling.">Chipping Away at Blood-Brain-Barrier Modeling.</a> Cell stem cell. 24 (6), 831-832 (2019).</li><li>Faal, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Mesoderm+and+Neural+Crest-Derived+Pericytes+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells+to+Study+Blood-Brain+Barrier+Interactions.">Induction of Mesoderm and Neural Crest-Derived Pericytes from Human Pluripotent Stem Cells to Study Blood-Brain Barrier Interactions.</a> Stem Cell Reports. 12 (3), 451-460 (2019).</li><li>Lippmann, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+blood-brain+barrier+endothelial+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 30 (8), 783 (2012).</li><li>Qian, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+blood-brain+barrier+endothelial+cells.">Directed differentiation of human pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells.</a> Science Advances. 3 (11), 1701679 (2017).</li><li>Neal, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified,+Fully+Defined+Differentiation+Scheme+for+Producing+Blood-Brain+Barrier+Endothelial+Cells+from+Human+iPSCs.">A Simplified, Fully Defined Differentiation Scheme for Producing Blood-Brain Barrier Endothelial Cells from Human iPSCs.</a> Stem Cell Reports. 12 (6), 1380-1388 (2019).</li><li>Wevers, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+perfused+human+blood-brain+barrier+on-a-chip+for+high-throughput+assessment+of+barrier+function+and+antibody+transport.">A perfused human blood-brain barrier on-a-chip for high-throughput assessment of barrier function and antibody transport.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 15 (1), 23 (2018).</li><li>Huh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabrication+of+human+organs-on-chips.">Microfabrication of human organs-on-chips.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2135 (2013).</li><li>Huh, D., Matthews, B. D., Mammoto, A., Montoya-Zavala, M., Hsin, H. Y., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+organ-level+lung+functions+on+a+chip.">Reconstituting organ-level lung functions on a chip.</a> Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).</li></ol>

Kombinasjonen av organ-on-chip-teknologi og iPSC-avledede celler i NVU holder løfte om nøyaktig modellering av det menneskelige BBB. Her gir vi en detaljert protokoll for enkel og robust anvendelse av den nylig publiserte iPSC-baserte BBB-chip16. En oversikt og tidspunkt for frøing paradigme er vist i figur 3. For å oppnå og vedlikeholde barrierefunksjoner som er egnet for BBB-modellering, er det avgjørende å generere en homogen iBMEC monolayer og beholde integ...

BBB er en svært selektiv barriere som skiller CNS fra det sirkulerende blodet. Det beskytter kritiske hjernefunksjoner mot potensielt forstyrrende stoffer, faktorer og xenobiotika samtidig som tilstrømningen av næringsstoffer og andre metabolitter som kreves for å opprettholde hjernens homeostase1. BBB er en flercellet NVU der pericytes, astrocyttende endeføtter og nevronale prosesser direkte kontakter hjernens mikrovaskulære endotelceller (BMECer). Disse interaksjonene tillater BMECs å danne spesialiserte barriereegenskaper som støttes av stramme og overholder veikryss2,3. Dannelsen av denne barrieren begrenser paracellulær passasje av molekyler, men den inneholder polariserte transportører for å aktivt transportere molekyler inn i CNS eller tilbake i blodet1. På grunn av disse unike barriereegenskapene utgjør BBB et stort hinder for levering av biofarmasi i hjernen, og det er anslått at mindre enn 5% av FDA-godkjente små molekyler kan nå CNS4.
Dyremodeller har blitt mye brukt til å studere BBB-penetans og de molekylære mekanismene som er involvert i BBB-utvikling5. Mens dyremodeller trofast representerer det komplekse flercellulære in vivo-miljøet, utelukker forskjeller i uttrykk og aktivitet av BBB-transportører samt substratspesifisitet på tvers av arter ofte nøyaktig ekstrapolering av dyredata til mennesker6. Dermed er menneskebaserte modeller avgjørende for å studere den menneskelige BBB og for bruk i utviklingen av legemidler designet for å målrette CNS. Dette behovet blir enda tydeligere med den økende dominansen av biologiske, menneskespesifikke legemidler i det farmasøytiske utviklingsfeltet. Akkumulerende bevis tyder på at en kompromittert BBB er forbundet med en rekke alvorlige CNS lidelser, inkludert hjernesvulster og nevrologiske sykdommer7,8,9. Menneskelige modeller som trofast reflekterer disse sykdommene har potensial til både 1) identifisere nye veier som kan målrettes for narkotikautvikling og 2) forutsi CNS penetan, og dermed redusere tid og ressurser i prekliniske studier og muligens redusere svikt i kliniske studier.
In vitro-modeller har blitt mye implementert for å studere interaksjoner mellom BMECs og andre celler i NVU og gjennomføre skjermer for potensielle BBB-permeable legemidler10. For å gjenskape viktige aspekter ved den menneskelige BBB, må in vitro-modellene vise fysiologisk relevante egenskaper (dvs. lav paracellulær permeabilitet og fysiologisk relevant transendothelial elektrisk motstand [TEER] på tvers av den endoteliske monolayer). I tillegg må den molekylære profilen til et in vitro-system inkludere uttrykk for representative funksjonelle transportsystemer. Vanligvis består in vitro-modeller av endotelceller som er co-cultured på en semipermeable membran med kombinasjoner av andre NVU-celler for å forbedre BBB egenskaper11. Denne tilnærmingen gir enkel og relativt rask vurdering av barrierefunksjonalitet og molekylgjennomtrengelighet. Slike cellebaserte BBB-modeller kan etableres med dyre- eller menneskecellekilder, inkludert celler isolert fra kirurgiske eksisjoner eller udødelige BMEC-linjer.
Nylig ble protokoller for å differensiere menneskelige pluripotente celler i BMECer introdusert som en attraktiv kilde for in vitro menneskelige BBB-modeller12,13. Indusert pluripotent stamcelle (iPSC)-avledede BMECs (iBMECs) er svært skalerbare, viser avgjørende morfologiske og funksjonelle egenskaper ved den menneskelige BBB, og bærer genetikken til pasienten. I kulturen danner iBMECs et monolayer som uttrykker stramme koblingsmarkører og viser i vivo-lignende tette koblingskomplekser. Disse cellene uttrykker også BBB-markører, inkludert BBB glukosetransportør, glukosetransportør 1 (GLUT1). Viktigere, og i motsetning til andre alternative cellekilder for menneskelige BMECer, iBMECs skaffe barriere egenskaper med verdier så høyt som de målt in vivo14, polarisere langs basolateral eakse, og uttrykke funksjonelle efflux pumper. Videre ønsker bruk av iPSCer fra ulike begge 1) muligheten til å teste aspekter av BBB på en personlig medisin måte og 2) gir en fleksibel kilde for å generere flere celletyper av NVU. Generere disse cellene fra en isogen cellekilde for å lage personlige BBB chips ville også hjelpe i å forstå mellom individuelle forskjeller i narkotikaresponser, som er en viktig årsak til motstand eller kompromittert respons på behandling observert i kliniske studier.
Bruk av iBMECs som monolayers i en tallerken eller på en semi gjennomtrengelig transwell innsats representerer en kraftig tilnærming for BBB modellering. Disse systemene har en tendens til å være robuste, reproduserbare og kostnadseffektive. I tillegg er funksjonelle analyser som TEER og permeabilitet relativt enkle å utføre. Todimensjonale (2D) systemer klarer imidlertid ikke å rekapitulere 3D-naturen til in vivo-vev, og de mangler de fysiologiske skjærstresskreftene som tilbys av sirkulerende blod og blodceller. Dette begrenser evnen til vaskulær endotel i disse modellene for å utvikle og opprettholde iboende BBB egenskaper og funksjoner.
Mikrokonstruerte systemer foret av levende celler har blitt implementert for å modellere ulike organfunksjoner i et konsept som kalles organ-on-chips. Ved å gjenskape in vivo-lignende flercellet arkitektur, vevsgrensesnitt, fysikokjemiske mikromiljøer og vaskulær perfusjon, genererer disse mikrokonstruerte plattformene nivåer av vev og organfunksjonalitet som ikke er mulig med konvensjonelle 2D kultursystemer. De muliggjør også høyoppløselig, sanntidsavbildning og analyse av biokjemiske, genetiske og metabolske profiler som ligner på levende celler i in vivo vev og organkontekst. En spesiell utfordring av organ-on-chip er imidlertid at design, fabrikasjon og anvendelse av disse mikrokonstruerte chips krever spesialisert ingeniørkompetanse som vanligvis mangler i biologisk orienterte akademiske laboratorier.
Vi har nylig kombinert iPSC og organ-on-chip teknologier for å generere en personlig BBB chip modell15,16. For å overvinne de teknologiske utfordringene som er beskrevet, brukes den kommersielt tilgjengelige Chip-S1 sammen med kulturmodulen, et instrument designet for å automatisere vedlikeholdet av sjetongene på en enkel og robust måte (Emuler Inc.). BBB-brikken gjenskaper interaksjoner mellom nevrale og endotelceller og oppnår fysiologisk relevante TEER-verdier, som måles ved skreddersydde organbrikker med integrerte gullelektroder17. I tillegg viser BBB-brikken lav paracellulær permeabilitet, reagerer på inflammatoriske signaler på orgelnivå, uttrykker aktive efflux pumper, og viser prediktiv transport av løselige biomarkører og biofarmasi. Spesielt fanger BBB-chips generert fra flere personer de forventede funksjonelle forskjellene mellom friske individer og pasienter med nevrologiske sykdommer15.
Protokollen som er beskrevet nedenfor beskriver en pålitelig, effektiv og reproduserbar metode for generering av humane iPSC-baserte BBB-brikker under dynamiske strømningsforhold. Veiledning gis om typen analyser og endepunktsanalyser som kan utføres direkte i BBB-chipen eller fra prøvetaking av avløpsvann. Dermed demonstrerer protokollen spekteret av teknikker som kan brukes for evaluering av biologiske og funksjonelle egenskaper og svar i en menneskelig relevant modell.
En kort beskrivelse av iPSC-baserte BBB-chip er gitt her. Menneskelige iPSCer er i utgangspunktet differensiert og forplantes i vevkulturflasker som frittflytende aggregater av nevrale forfedre, kalt EZ-sfærer. Den øverste kanalen av Chip-S116,18,19 er seeded med dissosierte EZ-kuler som danner "hjernen side" av chip, som celler skiller over 7 dager inn i en blandet kultur av nevrale stamceller (iNPCer), iAstrocytes, og iNeurons. Menneskelige iPSCer er også differensiert i vevkulturplater til iBMECs. Den nederste kanalen av brikken er seeded med iBMECs å danne "blod siden" som de utvikler seg for å danne en endotelrør (Figur 1). Den porøse ekstracellulære matrisen (ECM)-belagt membran som skiller topp- og bunnkanalene 1) tillater dannelsen av celle-til-celle-interaksjoner mellom kanaler og 2) gjør det mulig for brukeren å kjøre permeabilitetsanalyser og bildeceller i begge kanalene ved hjelp av et konvensjonelt lysmikroskop.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SCR005</td>
			<td>Dissociation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bfgf</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chip-S1</td>
			<td>Emulate Inc</td>
			<td>Chip-S1</td>
			<td>Organ-Chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D3571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran-FITC</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>46944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM: F12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31330038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emulate Reagent 1 (ER-1)</td>
			<td>Emulate Inc</td>
			<td>ER-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emulate Reagent 2 (ER-2)</td>
			<td>Emulate Inc</td>
			<td>ER-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP)</td>
			<td>Dako</td>
			<td>Z0334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GLUT-1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MA5-11315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050038</td>
			<td>Glutamine supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hBDNF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOSR</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>Basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>StemCell Technologies, Inc.</td>
			<td>85851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA</td>
			<td>Biological industries</td>
			<td>01-340-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nestin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NutriStem</td>
			<td>Biological industries</td>
			<td>05-100-1A</td>
			<td>Alternate media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PECAM-1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platelet-poor plasma-derived bovine serum (PPP)</td>
			<td>Biomedical Technologies</td>
			<td>J64483AB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid (RA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S100&#946;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZO-1 Monoclonal Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>33-9100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;III-tubulin (Tuj1&#945;)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>31350010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of a human ipsc-based blood-brain barrier chip

Blodhjernebarrieren (BBB) dannes av nevrovaskulære enheter (NVUer) som beskytter sentralnervesystemet (CNS) fra en rekke faktorer som finnes i blodet som kan forstyrre delikat hjernefunksjon. Som sådan er BBB et stort hinder for levering av terapeutiske midler til CNS. Akkumulerende bevis tyder på at BBB spiller en nøkkelrolle i utbruddet og progresjonen av nevrologiske sykdommer. Dermed er det et enormt behov for en BBB-modell som kan forutsi penetrasjon av CNS-målrettede legemidler, samt belyse BBBs rolle i helse og sykdom.
Vi har nylig kombinert organ-on-chip og indusert pluripotent stamcelle (iPSC) teknologier for å generere en BBB chip fullt personlig til mennesker. Denne nye plattformen viser cellulære, molekylære og fysiologiske egenskaper som er egnet for prediksjon av narkotika- og molekyltransport over hele den menneskelige BBB. Videre, ved hjelp av pasientspesifikke BBB-chips, har vi generert modeller av nevrologisk sykdom og demonstrert potensialet for personlige prediktive medisinapplikasjoner. Gitt her er en detaljert protokoll som viser hvordan å generere iPSC-avledede BBB chips, som begynner med differensiering av iPSC-avledet hjerne mikrovaskulære endotelceller (iBMECs) og resulterer i blandede nevrale kulturer som inneholder nevrale forfedre, differensierte nevroner og astrocytter. Også beskrevet er en prosedyre for seeding celler i orgelchip og kuling av BBB chips under kontrollert lamimer flyt. Til slutt er detaljerte beskrivelser av BBB-chipanalyser gitt, inkludert paracellulær permeabilitetsanalyser for vurdering av legemiddel og molekylpermeabilitet samt immuncytokjemiske metoder for å bestemme sammensetningen av celletyper i brikken.

Figur 6A,B,C representerer en BBB chip seeded med EZ-kuler på "hjernesiden" toppkanal og iBMECs på "blodsiden"" bunnkanal. iBMECs ble seeded først og lov til å feste over natten, hvoretter EZ-sfærer ble seeded. Chips ble deretter kultivert under statiske forhold med daglig medieerstatning i syv dager. BBB-brikken ble deretter fikset ved hjelp av 4% PFA ved RT i 10 min og vasket 3x med DPBS. Immuncytokjemi ble utført på BBB-chipen ved hjelp av 1) nestin som markør for...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of a Human iPSC-Based Blood-Brain Barrier Chip at JoVE.com

Generation of a Human iPSC-Based Blood-Brain Barrier Chip

Blod-hjernebarrieren (BBB) er en flercellet nevrovaskulær enhet som regulerer hjernens homeostase tett. Ved å kombinere menneskelige iPSCer og organ-on-chip-teknologier, har vi generert en personlig BBB-chip, egnet for sykdomsmodellering og CNS-prognoser for legemiddelpenetrabilitet. En detaljert protokoll er beskrevet for generering og drift av BBB-chipen.

Generasjon av en human iPSC-basert blod-brain barriere chip

The blood brain barrier (BBB) is formed by neurovascular units (NVUs) that shield the central nervous system (CNS) from a range of factors found in the ...

Denne protokollen vil demonstrere hvordan differensierte induserte pluripotente stamceller kan seedes på et organ-on-chip for å generere en fullt menneskelig, personlig, mikrofluidisk blod-hjernebarriere, som kan brukes til å forutsi sentralnervesystemets narkotikapermeabilitet og for å studere nevrologiske lidelser. Ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig organ-on-chip, vil vi demonstrere hvordan et hvert biologisk orientert laboratorium kan bruke denne teknologien til å generere en personlig, mikrofluidisk blod-hjernebarriere-on-chip. Akkumulerende bevis tyder på at BBB spiller en rolle i nevrologisk sykdom ved å generere personlige BBB chips avledet fra iPSCs av personer med en genetisk nevrologisk sykdom.Det vil være mulig å studere BBB-rollen i helse og sykdom. Denne metoden kan også være nyttig for farmasøytiske selskaper, som kan bruke denne menneskelige BBB-plattformen til å screene for penetrerbarheten av kandidat nevrologiske legemidler inn i den menneskelige hjernen. Anvendelsen av organ-on-chip teknologier krever vanligvis spesialiserte ingeniørferdigheter.Ved hjelp av kommersielt tilgjengelige plattformer gjør det mulig å bruke denne teknologien i ethvert biologisk orientert laboratorium. For å begynne, ta med parabolen som inneholder de tilberedte chips til biosikkerhetsskapet. Bruk en P200-pipette til å vaske begge kanalene forsiktig ved å tilsette 200 mikroliter med nevral differensieringsmedium i innløpet og trekke væsken fra uttaket.Unngå kontakt med portene, nøye aspirere overflødige mediedråper fra overflaten av brikken. Rør forsiktig cellefjæringen for å sikre en homogen cellesuspensjon. For å så de iPSC-avledede nevrale stamcellene inn i toppkanalen for å generere hjernesiden, legg til en P200-spiss som inneholder 30 til 100 mikroliter cellesuspensjon ved konsentrasjonen av en gang 10 til de seks cellene per milliliter til toppkanalinntaket, og slipp forsiktig spissen fra pipetten.Ta en tom P200 pipette, trykk stempelet, sett inn i toppkanaluttaket, og trekk forsiktig encelledeturen gjennom spissen. Overfør brikken til mikroskopet for å sjekke såetettheten og homogen fordeling av celler i toppkanalen. Etter å ha bekreftet celletettheten ved 20% dekning, legg umiddelbart sjetongene i inkubatoren i to timer ved 37 grader Celsius.Deretter vasker du bort cellene som ikke festes ved å legge til frisk nevrale differensieringsmedium i innløpet og trekke væsken via pipette fra stikkontakten. Hold cellene under statiske forhold ved 37 grader Celsius med en daglig neural differensieringsmiddelerstatning. Etter at iNPCer har festet eller på en påfølgende dag etter såing, ta med parabolen som inneholder de tilberedte chips til biosikkerhetsskapet.Vask forsiktig bunnkanalen med 200 mikroliter endotelcellemedium. Unngå kontakt med portene, nøye aspirere dråper av overflødig endotelcellemedium fra overflaten av brikken, og sørg for å forlate medium i begge kanaler. Rør forsiktig cellefjæringen for å sikre en homogen cellesuspensjon.Bruk en P200 pipette, trekk opp 30 til 100 mikroliter av den iPSC-avledede hjernen mikrovaskulære endotelcelleoppheng ved konsentrasjonen av 14 til 20 ganger 10 til de seks cellene per milliliter, og plasser spissen i bunnkanalinntaket. Det mest kritiske trinnet for å oppnå funksjonelle barriereegenskaper er såing av hjernens mikrovaskulære endotelceller. Det er avgjørende for frøceller med riktig tetthet for å unngå bobledannelse for å verifisere homogen fordeling i organbrikken.Trykk stempelet på en P200-pipette med en tom spiss, sett inn i det nederste kanaluttaket, og slipp pipettestempelet langsomt for å trekke enkeltcellefjæringen forsiktig gjennom den nederste kanalen. Aspirer overflødig celle suspensjon fra overflaten av brikken. Unngå direkte kontakt med innløps- og utløpsportene for å sikre at ingen cellefjæring aspireres ut av kanalene.Overfør brikken til mikroskopet for å sjekke såetettheten. Den nederste kanalen er fylt med celler uten observerbare hull i mellom. Etter å ha bekreftet riktig celletetthet, frø cellene i de resterende chips.For å feste cellene på den porøse membranen, som ligger på toppen av bunnkanalen, inverter hver brikke, og la dem hvile i en chip vugge. Plasser et lite reservoar som inneholder sterile DPBS inne i 150-millimeters parabolen for å gi fuktighet til cellene. Inkuber sjetongene ved 37 grader Celsius i omtrent tre timer eller til celler i bunnkanalen har festet seg.Når de iPSC-avledede mikrovaskulære hjernecellene har festet seg, vender du sjetongene tilbake til en oppreist stilling for å tillate celletilbehør til den nederste delen av bunnkanalen. 48 timer etter såing av iPSC-avledede hjerne mikrovaskulære endotelceller, likevekt temperaturen på endotelcellemediet ved oppvarming i et 37-graders Celsius vannbad i en time. Deretter degas mediet ved inkubasjon under et vakuumdrevet filtreringssystem i 15 minutter.Deretter renser du utsiden av den bærbare modulemballasjen og skuffene med 70% etanol, tørk og overfører dem til biosikkerhetsskapet. Åpne pakken, og plasser modulene i skuffen Orienter dem med reservoarene mot baksiden av skuffen. Pipette tre milliliter av pre-equilibrated, varmt medium til hvert innløp reservoar.Legg endotelcellekulturmedium til innløpsreservoaret på bunnkanalen og nevrale differensieringsmediet til toppkanalinntaksreservoaret på toppkanalen. Deretter pipette 300 mikroliter av pre-likevektet, varmt medium til hvert utløp reservoar, rett over hver utløpsport. Plasser opptil seks bærbare moduler på hver skuff.Ta skuffene til inkubatoren, og skyv helt inn i kulturmodulen med skuffhåndtaket vendt utover. Velg og kjør hovedsyklusen på kulturmodulen. Lukk inkubatordøren, og la kulturmodulen prime de bærbare modulene i omtrent ett minutt.Grunningssyklusen fullføres når statuslinjen leser klar. Fjern brettet fra kulturmodulen, og ta den med til biosikkerhetsskapet. Inspiser undersiden av hver bærbare modul i biosikkerhetskabinettet for å kontrollere at de bærbare modulene ble primet.Se etter tilstedeværelsen av små dråper på alle fire porter. Hvis en bærbar modul ikke viser dråper, kjører du prime syklusen på disse modulene. Hvis noe papir dryppet på skuffen, som forekommer oftere av utløpsportene, rengjør du skuffen med 70% etanol.Deretter vasker du forsiktig begge kanalene på hver brikke med varmt, likevektscellespesifikt kulturmedium for å fjerne eventuelle bobler i kanalen, og legg små dråper med medier på toppen av hver innløps- og utløpsport. Sett sjetongene med bærere inn i de bærbare modulene, og legg opptil seks på hver skuff. Sett skuffene inn i kulturmodulen.Programmer de aktuelle organbrikkekulturforholdene, for eksempel strømningshastighet og stretch, på kulturmodulen. Så snart reguleringssyklusen er fullført, noe som tar omtrent to timer, starter de programmerte forholdene. Etter det begynner kulturmodulen å strømme på de forhåndsinnstilte organbrikkekulturforholdene.Immunocytochemistry på iPSC-baserte blod-hjerne barrier chip syv dager etter seeding viser EZ sfærer differensiert i en blandet nevrale cellepopulasjon i den øverste hjernen sidekanal, inkludert S100 beta-positive astrocytter, Nestin-positive nevrale stamceller, samt GFAP-positive astrocytter, og beta III tubulin-positive nevroner. IPSC-avledede mikrovaskulære hjerneludokulære endotelceller seeded i den nederste blodsidekanalen uttrykte GLUT-1 og PECAM-1. Evaluering av blod-hjerne barriere chip permeabilitet viser at organbrikken seeded med iPSC-avledet hjerne mikrovaskulære endotelceller og EZ kuler hadde en stram barriere sammenlignet med organchips seeded med iPSC-avledede hjernen mikrovaskulære endotelceller alene.Organchips seeded med EZ kuler alene viste ingen barriere egenskaper. Fra den første overflatebehandlingen av kanalen til medium-vekslingen hver dag, unngå bobledannelse i kanalen. Gjennom hele trinnet i protokollen der overflateaktiveringsreagens, ekstracellulær matrise eller celleholdig medium må settes inn gjennom kanalene, er det ekstremt viktig å nøye kontrollere at ingen boble er funnet.Permeabilitetsanalysen kan utføres for å vurdere den menneskelige hjerneens penetrerbarhet av kandidatmedisiner. Denne tilnærmingen kan tjene for testing av potensielle terapeutiske midler. Anvendelsen av den iPSC-baserte BBB-brikken gjør det mulig å studere BBB-rollen i ulike nevrologiske sykdommer.I fremtiden kan en slik plattform være nyttig for prediktive, personlige medisinapplikasjoner.

generation-of-a-human-ipsc-based-blood-brain-barrier-chip

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Human Adipose Stem Cells through Dedifferentiation of Mature Adipocytes in Ceiling Cultures

Mature adipocytes have been shown to reverse their phenotype into fibroblast-like cells in vitro through a technique called ceiling culture. Mature adipocytes can also be isolated from fresh adipose tissue for depot-specific characterization of their function and metabolic properties. Here, we describe a well-established protocol to isolate mature adipocytes from adipose tissues using collagenase digestion, and subsequent steps to perform ceiling cultures. Briefly, adipose tissues are incubated in a Krebs-Ringer-Henseleit buffer containing collagenase to disrupt tissue matrix. Floating mature adipocytes are collected on the top surface of the buffer. Mature cells are plated in a T25-flask completely filled with media and incubated upside down for a week. An alternative 6-well plate culture approach allows the characterization of adipocytes undergoing dedifferentiation. Adipocyte morphology drastically changes over time of culture. Immunofluorescence can be easily performed on slides cultivated in 6-well plates as demonstrated by FABP4 immunofluorescence staining. FABP4 protein is present in mature adipocytes but down-regulated through dedifferentiation of fat cells. Mature adipocyte dedifferentiation may represent a new avenue for cell therapy and tissue engineering.

Mature adipocytes may represent an abundant source of stem cells through dedifferentiation, which leads to a homogenous population of fibroblast-like cells. Collagenase digestion is used to isolate mature adipocytes from human fat. The goal of our protocol is to obtain multipotent, dedifferentiated fat cells from human mature adipocytes.

Generation of Human adipose stamceller gjennom Dedifferentiation av Mature Adipocytter i Ceiling kulturer

Mature adipocytes have been shown to reverse their phenotype into fibroblast-like cells in vitro through a technique called ceiling culture. Mature ...

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function and physiology of their in vivo tissue counterparts. This is exemplified by organotypic skin cultures which faithfully recapitulates the epidermal differentiation and stratification program. Primary human epidermal keratinocytes are genetically manipulable through retroviruses where genes can be easily overexpressed or knocked down. These genetically modified keratinocytes can then be used to regenerate human epidermis in organotypic skin cultures providing a powerful model to study genetic pathways impacting epidermal growth, differentiation, and disease progression. The protocols presented here describe methods to prepare devitalized human dermis as well as to genetically manipulate primary human keratinocytes in order to generate organotypic skin cultures. Regenerated human skin can be used in downstream applications such as gene expression profiling, immunostaining, and chromatin immunoprecipitations followed by high throughput sequencing. Thus, generation of these genetically modified organotypic skin cultures will allow the determination of genes that are critical for maintaining skin homeostasis.

The goal of this paper is to provide a comprehensive and detailed protocol on how to generate genetically modified human organotypic skin from epidermal keratinocytes and devitalized human dermis.

Generering av genmodifiserte organotypiske Skin kulturer Bruke devitalized Menneskelig Dermis

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets of patients with metastatic melanoma. Major obstacles of this approach are the reduced viability of transferred T cells, caused by telomere shortening, and the limited number of TILs obtained from patients. Less-differentiated T cells with long telomeres would be an ideal T cell subset for adoptive T cell therapy;however, generating large numbers of these less-differentiated T cells is problematic. This limitation of adoptive T cell therapy can be theoretically overcome by using induced pluripotent stem cells (iPSCs) that self-renew, maintain pluripotency, have elongated telomeres, and provide an unlimited source of autologous T cells for immunotherapy. Here, we present a protocol to generate iPSCs using Sendai virus vectors for the transduction of reprogramming factors into TILs. This protocol generates fully reprogrammed, vector-free clones. These TIL-derived iPSCs might be able to generate less-differentiated patient- and tumor-specific T cells for adoptive T cell therapy.

The goal of this protocol is to show the protocol for reprogramming melanoma tumor-infiltrating lymphocytes into induced pluripotent stem cells.

Generering av Induced Pluripotent stamceller fra humane melanom Tumor-infiltrerende lymfocytter

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the human body. The differentiation of hPSCs to human hepatocyte-like cells (HLCs) has been extensively studied, and efficient differentiation protocols have been established. The combination of extracellular matrix and biological stimuli, including growth factors, cytokines, and small molecules, have made it possible to generate HLCs that resemble primary human hepatocytes. However, the majority of procedures still employ undefined components, giving rise to batch-to-batch variation. This serves as a significant barrier to the application of the technology. To tackle this issue, we developed a defined system for hepatocyte differentiation using human recombinant laminins as extracellular matrices in combination with a serum-free differentiation process. Highly efficient hepatocyte specification was achieved, with demonstrated improvements in both HLC function and phenotype. Importantly, this system is easy to scale up using research and GMP-grade hPSC lines&#160;promising advances in cell-based modelling and therapies.

The method presented here describes a scalable and good manufacturing practice (GMP)-ready differentiation system to generate human hepatocyte-like cells from pluripotent stem cells. It serves as a cost-effective and standardized system to generate human hepatocyte-like cells for basic and applied human liver research.

Definert og Scalable Generation of hepatocytter lignende celler fra menneskelige Pluripotent stamceller

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that limits the translation of basic brain research into clinical application. While induced pluripotent stem cells (iPSCs) have replaced the ethically questionable human embryonic stem cells, iPSC-based neuronal differentiation studies remain descriptive at the cellular level but fail to adequately provide the details that could be derived from a complex, 3D human brain tissue. 
This gap is now filled through the application of iPSC-derived, 3D brain organoids, "Brains in a dish," that model many features of complex human brain development. Here, a method for generating iPSC-derived, 3D brain organoids is described. The organoids can help with modeling autosomal recessive primary microcephaly (MCPH), a rare human neurodevelopmental disorder. A widely accepted explanation for the brain malformation in MCPH is a depletion of the neural stem cell pool during the early stages of human brain development, a developmental defect that is difficult to recreate or prove in vitro. 
To study MCPH, we generated iPSCs from patient-derived fibroblasts carrying a mutation in the centrosomal protein CPAP. By analyzing the ventricular zone of microcephaly 3D brain organoids, we showed the premature differentiation of neural progenitors. These 3D brain organoids are a powerful in vitro system that will be instrumental in modeling congenital brain disorders induced by neurotoxic chemicals, neurotrophic viral infections, or inherited genetic mutations.

Modeling human brain development has been hindered due to the unprecedented complexity of neural epithelial tissue. Here, a method for the robust generation of brain organoids to delineate early events of human brain development and to model microcephaly in vitro is described.

Generering av IPSC-avledet menneskelige hjerne Organoids til Model Tidlig nevrologiske lidelser

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. In addition, keratinocytes play an essential role in the initiation, maintenance, and regulation of epidermal immune responses by being part of the innate immune system responding to antigenic stimuli in a fast, nonspecific manner. Here, we describe a protocol for isolation of primary human keratinocytes from adult skin, and demonstrate that these cells respond to calcium-induced terminal differentiation, as measured by an increased expression of the differentiation marker involucrin. In addition, we show that the isolated keratinocytes are responsive to IL-1&#946;-induced activation of intracellular signaling pathways as measured by the activation of the p38 MAPK pathway. Taken together, we describe a method for isolation and culturing of primary human keratinocytes from adult skin. Because the keratinocytes are the predominant cell type in the epidermis, this method is useful to study molecular mechanisms in cutaneous biology in vitro.

The human skin acts as a first line of defense against the external environment. We present a method for isolating primary human keratinocytes from adult skin. These isolated keratinocytes are useful in numerous experimental setups, and are a highly suitable model for studying molecular mechanisms in cutaneous biology in vitro.

Generasjon og dyrking av primære menneskelige keratinocytter fra voksen hud

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. ...

Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted in sophisticated in vitro models of the intestinal mucosa. Leveraging these emerging model systems will require adaptation of tools and techniques developed for 2D culture systems and animals. Here, we describe a technique for measuring epithelial barrier permeability in human intestinal organoids in real-time. This is accomplished by microinjection of fluorescently-labeled dextran and imaging on an inverted microscope fitted with epifluorescent filters. Real-time measurement of the barrier permeability in intestinal organoids facilitates the generation of high-resolution temporal data in human intestinal epithelial tissue, although this technique can also be applied to fixed timepoint imaging approaches. This protocol is readily adaptable for the measurement of epithelial barrier permeability following exposure to pharmacologic agents, bacterial products or toxins, or live microorganisms. With minor modifications, this protocol can also serve as a general primer on microinjection of intestinal organoids and users may choose to supplement this protocol with additional or alternative downstream applications following microinjection.

This protocol describes the measurement of epithelial barrier permeability in real-time following pharmacologic treatment in human intestinal organoids using fluorescent microscopy and live cell microscopy.

Sanntids måling av epitelial barriere permeabilitet i menneskelig Intestinal Organoids

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give rise to multiple cell types, including the myotome (MYO), sclerotome (SCL), dermatome (D), and syndetome (SYN), which in turn develop into skeletal muscle, axial skeleton, dorsal dermis, and axial tendon/ligament, respectively. Therefore, the generation of SMs and their derivatives from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is critical to obtain pluripotent stem cells (PSCs) for application in regenerative medicine and for disease research in the field of orthopedic surgery. Although the induction protocols for MYO and SCL from PSCs have been previously reported by several researchers, no study has yet demonstrated the induction of SYN and D from iPSCs. Therefore, efficient induction of fully competent SMs remains a major challenge. Here, we recapitulate human SM patterning with human iPSCs in vitro by mimicking the signaling environment during chick/mouse SM development, and report on methods of systematic induction of SM derivatives (MYO, SCL, D, and SYN) from human iPSCs under chemically defined conditions through the presomitic mesoderm (PSM) and SM states. Knowledge regarding chick/mouse&#160;SM development was successfully applied to the induction of SMs with human iPSCs. This method could be a novel tool for studying human somitogenesis and patterning without the use of embryos and for cell-based therapy and disease modeling.

We present here a protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into each somite derivative (myotome, sclerotome, dermatome, and syndetome) in chemically defined conditions, which has applications in future disease modeling and cell-based therapies in orthopedic surgery.

I Vitro generasjon av Somite derivater fra menneske indusert stamceller Pluripotent

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous system and protects neural tissue from toxins and pathogens. Defects in the formation of this barrier have been correlated with neuropathies, and the breakdown of this barrier has been observed in many neurodegenerative diseases. Therefore, it is critical to identify the genes that regulate the formation and maintenance of the blood-brain barrier to identify potential therapeutic targets. In order to understand the exact roles these genes play in neural development, it is necessary to assay the effects of altered gene expression on the integrity of the blood-brain barrier. Many of the molecules that function in the establishment of the blood-brain barrier have been found to be conserved across eukaryotic species, including the fruit fly, Drosophila melanogaster. Fruit flies have proven to be an excellent model system for examining the molecular mechanisms regulating nervous system development and function. This protocol describes a step-by-step procedure to assay for blood-brain barrier integrity during the embryonic and larval stages of D. melanogaster development.

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Blood-brain barrier integrity is critical for nervous system function. In Drosophila melanogaster, the blood-brain barrier is formed by glial cells during late embryogenesis. This protocol describes methods to assay for blood-brain barrier formation and maintenance in D. melanogaster embryos and third instar larvae.

Analysen for Blood-Brain Barrier integritet i Drosophila melanogaster

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous ...

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can also become diseased and cause morbidity and even death. Model systems to study human endometrial biology have been limited to in vitro culture systems of single cell types. In addition, the epithelial cells, one of the major cell types of the endometrium, do not propagate well or retain their physiological traits in culture, and thus our understanding of endometrial biology remains limited. We have generated, for the first time, endometrial organoids that consist of both epithelial and stromal cells of the human endometrium. These organoids do not require any exogenous scaffold materials and specifically organize so that epithelial cells encompass the spheroid-like structure and become polarized with stromal cells in the center that produce and secrete collagen. Estrogen, progesterone and androgen receptors are expressed in the epithelial and stromal cells and treatment with physiological levels of estrogen and testosterone promote the organization of the organoids. This new model system can be used to study normal endometrial biology and disease in ways that were not possible before.

A protocol to generate human primary endometrial organoids that consist of epithelial and stromal cells and retain characteristics of the native endometrial tissue is presented. This protocol describes methods from uterine tissue acquisition to the histologic processing of endometrial organoids.

Generering av flercellede Human Primary livmor Organoids

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...