Name: generation of a human ipsc-based blood-brain barrier chip
Uploaded: 2020-03-02T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of a Human iPSC-Based Blood-Brain Barrier Chip at JoVE.com

Gostaríamos de agradecer à Dra. Este trabalho foi apoiado pela Fundação israelista de Ciência1 1621/18, pelo Ministério da Ciência e Tecnologia (MOST), Israel 3-15647, pelo Instituto de Medicina Regenerativa da Califórnia, o ID DISC1-08800, a Sherman Family Foundation, nih-NINDS grant 1UG3NS105703, e a Associação ALS conceder 18-SI-389. AH foi financiada pela Wallenberg Foundation (grant number 2015.0178).

1. Geração de células progenitoras neurais derivadas do IPSC (iNPCs)
<ol><li>Produzir ez-esferas de colônias do IPSC como descrito abaixo e como publicado anteriormente20,21,22.<ol>
<li>Colônias culturais do IPSC à confluência na membrana do porão revestida 6 placas de poço (0,5 mg/placa) em mTESR1 ou outros meios comerciais (ver Tabela de Materiais).</li>
		<li>Remova o meio iPSC e substitua por 2 mL...

<ol>
	<li>Pardridge, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+endogenous+transporters+as+therapeutic+targets:+a+new+model+for+small+molecule+CNS+drug+discovery.">Blood-brain barrier endogenous transporters as therapeutic targets: a new model for small molecule CNS drug discovery.</a> Expert Opinion on Therapeutic Targets. 19 (8), 1059-1072 (2015).</li><li>Gastfriend, B. D., Palecek, S. P., Shusta, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+blood-brain+barrier:+beyond+the+endothelial+cells.">Modeling the blood-brain barrier: beyond the endothelial cells.</a> Current Opinion in Biomedical Engineering. 5, 6-12 (2018).</li><li>Jamieson, J. J., Linville, R. M., Ding, Y. Y., Gerecht, S., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+iPSC-derived+pericytes+on+barrier+function+of+iPSC-derived+brain+microvascular+endothelial+cells+in+2D+and+3D.">Role of iPSC-derived pericytes on barrier function of iPSC-derived brain microvascular endothelial cells in 2D and 3D.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 16 (1), 15 (2019).</li><li>El-Habashy, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+treatment+strategies+for+brain+tumors+and+metastases.">Novel treatment strategies for brain tumors and metastases.</a> Pharmaceutical Patent Analyst. 3 (3), 279-296 (2014).</li><li>Lim, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntington's+disease+iPSC-derived+brain+microvascular+endothelial+cells+reveal+WNT-mediated+angiogenic+and+blood-brain+barrier+deficits.">Huntington's disease iPSC-derived brain microvascular endothelial cells reveal WNT-mediated angiogenic and blood-brain barrier deficits.</a> Cell Reports. 19 (7), 1365-1377 (2017).</li><li>Dumitrescu, A. M., Liao, X. H., Weiss, R. E., Millen, K., Refetoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+thyroid+hormone+deprivation+and+excess+in+monocarboxylate+transporter+(mct)+8-deficient+mice.">Tissue-specific thyroid hormone deprivation and excess in monocarboxylate transporter (mct) 8-deficient mice.</a> Endocrinology. 147 (9), 4036-4043 (2006).</li><li>Spencer, J. I., Bell, J. S., DeLuca, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+pathology+in+multiple+sclerosis:+reframing+pathogenesis+around+the+blood-brain+barrier.">Vascular pathology in multiple sclerosis: reframing pathogenesis around the blood-brain barrier.</a> Journal of Neurology and Neurosurgical Psychiatry. 89 (1), 42-52 (2018).</li><li>Yamazaki, Y., Kanekiyo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+dysfunction+and+the+pathogenesis+of+Alzheimer's+disease.">Blood-brain barrier dysfunction and the pathogenesis of Alzheimer's disease.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (9), 1965 (2017).</li><li>Ben-Zvi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mfsd2a+is+critical+for+the+formation+and+function+of+the+blood-brain+barrier.">Mfsd2a is critical for the formation and function of the blood-brain barrier.</a> Nature. 509 (7501), 507 (2014).</li><li>Heng, M. Y., Detloff, P. J., Albin, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rodent+genetic+models+of+Huntington+disease.">Rodent genetic models of Huntington disease.</a> Neurobiology of Disease. 32 (1), 1-9 (2008).</li><li>Ho, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALS+disrupts+spinal+motor+neuron+maturation+and+aging+pathways+within+gene+co-expression+networks.">ALS disrupts spinal motor neuron maturation and aging pathways within gene co-expression networks.</a> Nature Neuroscience. 19 (9), 1256 (2016).</li><li>Griep, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BBB+on+chip:+microfluidic+platform+to+mechanically+and+biochemically+modulate+blood-brain+barrier+function.">BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function.</a> Biomedical Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).</li><li>Prabhakarpandian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+tumor+networks+for+screening+drug+delivery+systems.">Synthetic tumor networks for screening drug delivery systems.</a> Journal of controlled release. 201, 49-55 (2015).</li><li>Delsing, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barrier+properties+and+transcriptome+expression+in+human+iPSC-derived+models+of+the+blood-brain+barrier.">Barrier properties and transcriptome expression in human iPSC-derived models of the blood-brain barrier.</a> Stem Cells. 36 (12), 1816-1827 (2018).</li><li>Park, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-enhanced+Blood-Brain+Barrier+Chip+recapitulates+human+barrier+function+and+shuttling+of+drugs+and+antibodies.">Hypoxia-enhanced Blood-Brain Barrier Chip recapitulates human barrier function and shuttling of drugs and antibodies.</a> Nature Communications. 10 (1), 2621 (2019).</li><li>Vatine, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPSC-Derived+Blood-Brain+Barrier+Chips+Enable+Disease+Modeling+and+Personalized+Medicine+Applications.">Human iPSC-Derived Blood-Brain Barrier Chips Enable Disease Modeling and Personalized Medicine Applications.</a> Cell Stem Cell. 24 (6), 995-1005 (2019).</li><li>Henry, O. Y. F., Villenave, R., Cronce, M. J., Leineweber, W. D., Benz, M. A., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organs-on-chips+with+integrated+electrodes+for+trans-epithelial+electrical+resistance+(TEER)+measurements+of+human+epithelial+barrier+function.">Organs-on-chips with integrated electrodes for trans-epithelial electrical resistance (TEER) measurements of human epithelial barrier function.</a> Lab on a Chip. 17 (13), 2264-2271 (2017).</li><li>Sances, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPSC-derived+endothelial+cells+and+microengineered+organ+chip+enhance+neuronal+development.">Human iPSC-derived endothelial cells and microengineered organ chip enhance neuronal development.</a> Stem Cell Reports. 10 (4), 1222-1236 (2018).</li><li>Workman, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+utilization+of+induced+pluripotent+stem+cell&#8211;derived+human+intestinal+organoids+using+microengineered+chips.">Enhanced utilization of induced pluripotent stem cell&#8211;derived human intestinal organoids using microengineered chips.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 669-677 (2018).</li><li>Ebert, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EZ+spheres:+a+stable+and+expandable+culture+system+for+the+generation+of+pre-rosette+multipotent+stem+cells+from+human+ESCs+and+iPSCs.">EZ spheres: a stable and expandable culture system for the generation of pre-rosette multipotent stem cells from human ESCs and iPSCs.</a> Stem Cell Research. 10 (3), 417-427 (2013).</li><li>Shelley, B. C., Gowing, G., Svendsen, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cGMP-applicable+expansion+method+for+aggregates+of+human+neural+stem+and+progenitor+cells+derived+from+pluripotent+stem+cells+or+fetal+brain+tissue.">A cGMP-applicable expansion method for aggregates of human neural stem and progenitor cells derived from pluripotent stem cells or fetal brain tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), e51219 (2014).</li><li>Vatine, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+psychomotor+retardation+using+iPSCs+from+MCT8-deficient+patients+indicates+a+prominent+role+for+the+blood-brain+barrier.">Modeling psychomotor retardation using iPSCs from MCT8-deficient patients indicates a prominent role for the blood-brain barrier.</a> Cell Stem Cell. 20 (6), 831-843 (2017).</li><li>Svendsen, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+the+rapid+and+long+term+growth+of+human+neural+precursor+cells.">A new method for the rapid and long term growth of human neural precursor cells.</a> Journal of Neuroscience Methods. 85 (2), 141-152 (1998).</li><li>Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+retinoic+acid-enhanced,+multicellular+human+blood-brain+barrier+model+derived+from+stem+cell+sources.">A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources.</a> Scientific Reports. 4, 4160 (2014).</li><li>Canfield, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+isogenic+blood-brain+barrier+model+comprising+brain+endothelial+cells,+astrocytes,+and+neurons+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">An isogenic blood-brain barrier model comprising brain endothelial cells, astrocytes, and neurons derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Journal of Neurochemistry. 140 (6), 874-888 (2017).</li><li>Jamieson, J. J., Gerecht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chipping+Away+at+Blood-Brain-Barrier+Modeling.">Chipping Away at Blood-Brain-Barrier Modeling.</a> Cell stem cell. 24 (6), 831-832 (2019).</li><li>Faal, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Mesoderm+and+Neural+Crest-Derived+Pericytes+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells+to+Study+Blood-Brain+Barrier+Interactions.">Induction of Mesoderm and Neural Crest-Derived Pericytes from Human Pluripotent Stem Cells to Study Blood-Brain Barrier Interactions.</a> Stem Cell Reports. 12 (3), 451-460 (2019).</li><li>Lippmann, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+blood-brain+barrier+endothelial+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 30 (8), 783 (2012).</li><li>Qian, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+blood-brain+barrier+endothelial+cells.">Directed differentiation of human pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells.</a> Science Advances. 3 (11), 1701679 (2017).</li><li>Neal, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified,+Fully+Defined+Differentiation+Scheme+for+Producing+Blood-Brain+Barrier+Endothelial+Cells+from+Human+iPSCs.">A Simplified, Fully Defined Differentiation Scheme for Producing Blood-Brain Barrier Endothelial Cells from Human iPSCs.</a> Stem Cell Reports. 12 (6), 1380-1388 (2019).</li><li>Wevers, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+perfused+human+blood-brain+barrier+on-a-chip+for+high-throughput+assessment+of+barrier+function+and+antibody+transport.">A perfused human blood-brain barrier on-a-chip for high-throughput assessment of barrier function and antibody transport.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 15 (1), 23 (2018).</li><li>Huh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabrication+of+human+organs-on-chips.">Microfabrication of human organs-on-chips.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2135 (2013).</li><li>Huh, D., Matthews, B. D., Mammoto, A., Montoya-Zavala, M., Hsin, H. Y., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+organ-level+lung+functions+on+a+chip.">Reconstituting organ-level lung functions on a chip.</a> Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).</li></ol>

A combinação de tecnologia organ-on-chip e células derivadas do IPSC no NVU mantém a promessa de modelagem precisa do BBB humano. Aqui, fornecemos um protocolo detalhado para aplicação simples e robusta do recém-publicado chip BBB16. Uma visão geral e um tempo do paradigma de semeade é mostrado na Figura 3. Para obter e manter funções de barreira adequadas para a modelagem BBB, gerar uma monocamada homogênea do iBMEC e manter sua integridade são fundament...

O BBB é uma barreira altamente seletiva que separa o CNS do sangue circulante. Protege funções cerebrais críticas de substâncias, fatores e xenobióticos potencialmente disruptivos, ao mesmo tempo em que permite o fluxo de nutrientes e outros metabólitos necessários para manter a homeostase cerebral1. O BBB é um NVU multicelular no qual pericytes, pés de ponta astrócitos e processos neuronais entram diretamente em contato com células endoteliais do cérebro (BMECs). Essas interações permitem que os BMECs formem propriedades de barreira especializadas que são suportadas por junções apertadas e aderentes2,3. A formação dessa barreira limita a passagem paracelular das moléculas, mas contém transportadores polarizados para transportar ativamente moléculas para o CNS ou voltar para o sangue1. Devido a essas propriedades de barreira únicas, o BBB constitui um grande obstáculo para a entrega de biofarmacêuticos no cérebro, e estima-se que menos de 5% das pequenas moléculas aprovadas pela FDA podem chegar ao CNS4.
Modelos animais têm sido amplamente utilizados para estudar a penetração do BBB e os mecanismos moleculares envolvidos no desenvolvimento do BBB5. Enquanto os modelos animais representam fielmente o complexo multicelular no ambiente vivo, diferenças de expressão e atividade dos transportadores do BBB, bem como especificidade de substrato entre espécies muitas vezes impedem a extrapolação precisa de dados animais para humanos6. Assim, os modelos de base humana são fundamentais para estudar o BBB humano e para uso no desenvolvimento de medicamentos projetados para atingir o CNS. Essa necessidade torna-se ainda mais evidente com o crescente domínio de medicamentos biológicos e específicos do homem no campo do desenvolvimento farmacêutico. O acúmulo de evidências sugere que um BBB comprometido está associado a uma série de distúrbios graves da SNC, incluindo tumores cerebrais e doenças neurológicas7,8,9. Modelos humanos que refletem fielmente essas doenças têm o potencial de ambos 1) identificar novos caminhos que poderiam ser direcionados para o desenvolvimento de medicamentos e 2) prever a penetração do CNS, reduzindo assim o tempo e os recursos em estudos pré-clínicos e possivelmente diminuindo a taxa de falha nos ensaios clínicos.
Modelos in vitro têm sido amplamente implementados para estudar interações entre BMECs e outras células do NVU e realizar telas para possíveis drogas permeáveis bbb10. Para recriar aspectos-chave do BBB humano, os modelos in vitro devem apresentar propriedades fisiologicamente relevantes (ou seja, baixa permeabilidade paracelular e resistência elétrica tranportelial fisiologicamente relevante [TEER] em toda a monocamada endotelial). Além disso, o perfil molecular de um sistema in vitro deve incluir a expressão de sistemas de transporte funcional representativos. Normalmente, os modelos in vitro são compostos de células endoteliais que são co-cultivadas em uma membrana semipermeável com combinações de outras células NVU para melhorar as propriedades DO BBB11. Essa abordagem permite uma avaliação simples e relativamente rápida da funcionalidade da barreira e permeabilidade das moléculas. Tais modelos BBB baseados em células podem ser estabelecidos com fontes de células animais ou humanas, incluindo células isoladas de excisões cirúrgicas ou linhas BMEC imortalizadas.
Recentemente, protocolos para diferenciar células pluripotentes humanas em BMECs foram introduzidos como uma fonte atraente para os modelos BBB12,13. As BMECs derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) são altamente escaláveis, demonstram características morfológicas e funcionais cruciais do BBB humano e carregam a genética do paciente. Na cultura, os iBMECs formam um monocamada que expressa marcadores de junção apertados e exibe em complexos de junção apertados como vivo. Essas células também expressam marcadores BBB, incluindo o transportador de glicose BBB, transporte de glicose 1 (GLUT1). É importante ressaltar, e ao contrário de outras fontes alternativas de células para BMECs humanos, os iBMECs adquirem propriedades de barreira com valores tão altos quanto os medidos no vivo14,polarizam ao longo do eixo basolateral e expressam bombas de efflux funcionais. Além disso, o uso de iPSCs de diversos assuntos, ambos 1) saúda a oportunidade de testar aspectos do BBB de forma personalizada e 2) fornece uma fonte flexível para gerar tipos celulares adicionais do NVU. Gerar essas células a partir de uma fonte de célula sogênica para criar chips BBB personalizados também ajudaria na compreensão das diferenças interindividuais nas respostas medicamentosas, que é uma das principais causas de resistência ou resposta comprometida ao tratamento observado em estudos clínicos.
O uso de iBMECs como monocamadas em um prato ou em uma inserção transwell semi-permeável representa uma abordagem poderosa para a modelagem BBB. Esses sistemas tendem a ser robustos, reprodutíveis e econômicos. Além disso, análises funcionais como TEER e permeabilidade são relativamente simples de realizar. No entanto, os sistemas bidimensionais (2D) não conseguem recapitular a natureza 3D do tecido vivo, e eles não têm as forças de estresse fisiológicos fornecidas pelo sangue e células sanguíneas circulantes. Isso limita a capacidade do endotelo vascular nesses modelos de desenvolver e manter propriedades e funções intrínsecas do BBB.
Sistemas microengenheiros forrados por células vivas foram implementados para modelar várias funcionalidades de órgãos em um conceito chamado organ-on-chips. Ao recriar em arquitetura multicelular semelhante ao vivo, interfaces teciduais, microambientes físicoquímicos e perfusão vascular, essas plataformas microprojetadas geram níveis de funcionalidade tecidual e órgão sem possível com sistemas convencionais de cultura 2D. Também permitem alta resolução, imagem em tempo real e análise de perfis bioquímicos, genéticos e metabólicos semelhantes às células vivas no contexto in vivo de tecido e órgão. No entanto, um desafio particular do órgão-on-chip é que o design, fabricação e aplicação desses chips microengenheiros exigem experiência sapateira especializada que geralmente não tem em laboratórios acadêmicos biologicamente orientados.
Recentemente, combinamos tecnologias iPSC e organ-on-chip para gerar um modelo personalizado de chips BBB15,16. Para superar os desafios tecnológicos descritos, o Chip-S1 disponível comercialmente é usado em conjunto com o módulo cultural, um instrumento projetado para automatizar a manutenção dos chips de forma simples e robusta (Emulate Inc.). O chip BBB recria interações entre células neurais e endoteliais e alcança valores TEER fisiologicamente relevantes, que é medido por chips de órgãofeitos feitos medida com eletrodos de ouro integrados17. Além disso, o chip BBB exibe baixa permeabilidade paracelular, responde a sinais inflamatórios no nível do órgão, expressa bombas de efflux ativas e exibe transporte preditivo de biomarcadores solúveis e biofarmacêuticos. Notavelmente, os chips BBB gerados a partir de diversos indivíduos capturam as diferenças funcionais esperadas entre indivíduos saudáveis e pacientes com doenças neurológicas15.
O protocolo detalhado abaixo descreve um método confiável, eficiente e reprodutível para a geração de chips BBB humanos baseados em iPSC em condições dinâmicas de fluxo. A orientação é fornecida sobre o tipo de ensaios e análises de endpoint que podem ser realizadas diretamente no chip BBB ou a partir de efluentes amostrais. Assim, o protocolo demonstra o espectro de técnicas que podem ser aplicadas para avaliação de propriedades biológicas e funcionais e respostas em um modelo humano-relevante.
Uma breve descrição do chip BBB baseado no IPSC é fornecida aqui. Os iPSCs humanos são inicialmente diferenciados e propagados em frascos de cultura tecidual como agregados flutuantes livres de progenitores neurais, denominados EZ-spheres. O canal superior do Chip-S116,18,19 é semeado com esferas de EZ dissociadas que formam o "lado cerebral" do chip, pois as células se diferenciam ao longo de 7 dias em uma cultura mista de células progenitoras neurais (iNPCs), iAstrocitos e iNeurons. Os iPSCs humanos também são diferenciados em placas de cultura tecidual em iBMECs. O canal inferior do chip é semeado com iBMECs para formar o "lado sanguíneo" à medida que se desenvolvem para formar um tubo endotelial(Figura 1). A membrana porosa extracelular (ECM) revestida que separa os canais superior e inferior 1) permite a formação de interações celular-celular entre canais e 2) permite que o usuário execute ensaios de permeabilidade e células de imagem em ambos os canais usando um microscópio de luz convencional.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SCR005</td>
			<td>Dissociation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bfgf</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chip-S1</td>
			<td>Emulate Inc</td>
			<td>Chip-S1</td>
			<td>Organ-Chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D3571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran-FITC</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>46944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM: F12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31330038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emulate Reagent 1 (ER-1)</td>
			<td>Emulate Inc</td>
			<td>ER-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emulate Reagent 2 (ER-2)</td>
			<td>Emulate Inc</td>
			<td>ER-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP)</td>
			<td>Dako</td>
			<td>Z0334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GLUT-1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MA5-11315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050038</td>
			<td>Glutamine supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hBDNF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOSR</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>Basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>StemCell Technologies, Inc.</td>
			<td>85851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA</td>
			<td>Biological industries</td>
			<td>01-340-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nestin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NutriStem</td>
			<td>Biological industries</td>
			<td>05-100-1A</td>
			<td>Alternate media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PECAM-1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platelet-poor plasma-derived bovine serum (PPP)</td>
			<td>Biomedical Technologies</td>
			<td>J64483AB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid (RA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S100&#946;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZO-1 Monoclonal Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>33-9100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;III-tubulin (Tuj1&#945;)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>31350010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of a human ipsc-based blood-brain barrier chip

A barreira hematoencefálica (BBB) é formada por unidades neurovasculares (ULS) que protegem o sistema nervoso central (SNC) de uma série de fatores encontrados no sangue que podem interromper a delicada função cerebral. Como tal, o BBB é um grande obstáculo para a entrega terapêutica ao CNS. A acumulação de evidências sugere que o BBB desempenha um papel fundamental no início e progressão de doenças neurológicas. Assim, há uma necessidade tremenda de um modelo BBB que possa prever a penetração de medicamentos direcionados ao CNS, bem como elucidar o papel do BBB na saúde e na doença.
Recentemente combinamos tecnologias de células-tronco pluripotentes e induzidas para gerar um chip BBB totalmente personalizado para humanos. Esta nova plataforma exibe propriedades celulares, moleculares e fisiológicas adequadas para a previsão do transporte de drogas e moléculas através do BBB humano. Além disso, utilizando chips BBB específicos do paciente, geramos modelos de doença neurológica e demonstramos o potencial de aplicações preditivas personalizadas. Fornecido aqui está um protocolo detalhado demonstrando como gerar chips BBB derivados do IPSC, começando com diferenciação de células endoteliais microvasculares cerebrais derivadas do IPSC (iBMECs) e resultando em culturas neurais mistas contendo progenitores neurais, neurônios diferenciados, e astrócitos. Também é descrito um procedimento para semeader células no chip de órgão e culização dos chips BBB fluxo de laminar controlado. Por fim, são fornecidas descrições detalhadas das análises de chips BBB, incluindo ensaios de permeabilidade paracelular para avaliação da permeabilidade de medicamentos e moléculas, bem como métodos imunocitoquímicos para determinar a composição dos tipos celulares dentro do chip.

A Figura 6A,B,C representa um chip BBB semeado com ez-spheres no canal superior do "lado cerebral" e iBMECs no canal inferior "lado do sangue". os iBMECs foram semeados primeiro e autorizados a anexar durante a noite, após o qual as esferas ez foram semeadas. Os chips foram então cultivados em condições estáticas com substituição diária da mídia por sete dias. O chip BBB foi então fixado utilizando 4% de PFA na RT por 10 min e lavado 3x com DPBS. A imunocitoquímic...

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Generation of a Human iPSC-Based Blood-Brain Barrier Chip

A barreira hematoencefálica (BBB) é uma unidade neurovascular multicelular que regula fortemente a homeostase cerebral. Ao combinar iPSCs humanos e tecnologias de organ-on-chip, geramos um chip BBB personalizado, adequado para modelagem de doenças e previsões de penetrabilidade de medicamentos CNS. Um protocolo detalhado é descrito para a geração e operação do chip BBB.

Geração de um chip de barreira hematoencefálica baseada no iPSC humano

The blood brain barrier (BBB) is formed by neurovascular units (NVUs) that shield the central nervous system (CNS) from a range of factors found in the ...

Este protocolo demonstrará como células-tronco pluripotentes induzidas diferenciadas podem ser semeadas em um órgão-on-chip para gerar uma barreira hematoencefálica totalmente humana, personalizada e microfluidica, que pode ser usada para prever a permeabilidade do sistema nervoso central e estudar distúrbios neurológicos. Usando um órgão-on-chip comercialmente disponível, vamos demonstrar como qualquer laboratório biologicamente orientado pode usar essa tecnologia para gerar uma barreira sangue-cérebro-cérebro personalizada e microfluida. Evidências acumuladas sugerem que o BBB desempenha um papel na doença neurológica, gerando chips BBB personalizados derivados de iPSCs de indivíduos com uma doença neurológica genética.Será possível estudar o papel do BBB na saúde e na doença. Este método também pode ser útil para empresas farmacêuticas, que podem usar esta plataforma BBB humana para testar a penetrabilidade de drogas neurológicas candidatas no cérebro humano. A aplicação de tecnologias organ-on-chip geralmente requer habilidades de engenharia especializadas.O uso de plataformas disponíveis comercialmente permite a aplicação dessa tecnologia em qualquer laboratório biologicamente orientado. Para começar, leve o prato contendo os chips preparados para o armário de biossegurança. Usando uma pipeta P200, lave suavemente ambos os canais adicionando 200 microliters de meio de diferenciação neural na entrada e puxando o líquido da tomada.Evitando o contato com as portas, aspire cuidadosamente gotículas de mídia em excesso da superfície do chip. Agitar suavemente a suspensão da célula para garantir uma suspensão celular homogênea. Para semear as células progenitoras neurais derivadas do iPSC no canal superior para gerar o lado cerebral, adicione uma ponta P200 contendo 30 a 100 microliters de suspensão celular na concentração de uma vez 10 às seis células por mililitro até a entrada do canal superior, e solte suavemente a ponta da pipeta.Pegue uma pipeta P200 vazia, pressione o êmbolo, insira na saída superior do canal e puxe cuidadosamente a suspensão de uma célula pela ponta. Transfira o chip para o microscópio para verificar a densidade de semeadura e a distribuição homogênea das células dentro do canal superior. Depois de confirmar a densidade celular com 20%, coloque imediatamente os chips na incubadora por duas horas a 37 graus Celsius.Depois disso, lave as células que não se prendem adicionando um meio de diferenciação neural fresco na entrada e puxando o líquido através da pipeta da tomada. Mantenha as células em condições estáticas a 37 graus Celsius com uma reposição média de diferenciação neural diária. Depois que os iNPCs tiverem anexado ou em um dia subsequente após a semeadura, leve o prato contendo os chips preparados para o armário de biossegurança.Lave suavemente o canal inferior com 200 microliters de meio celular endotelial. Evitando o contato com as portas, aspira cuidadosamente gotículas de excesso de célula endotelial média da superfície do chip, certificando-se de deixar o meio em ambos os canais. Agitar suavemente a suspensão da célula para garantir uma suspensão celular homogênea.Usando uma pipeta P200, elasve 30 a 100 microliters da suspensão celular microvascular microvascular derivada do iPSC na concentração de 14 a 20 vezes 10 às seis células por mililitro, e coloque a ponta na entrada do canal inferior. O passo mais crítico para alcançar propriedades de barreira funcional é a semeadura de células endoteliais microvasculares cerebrais. É crucial que as células de sementes em densidade adequada evitem a formação de bolhas para verificar a distribuição homogênea dentro do chip de órgão.Pressione o êmbolo em uma pipeta P200 com uma ponta vazia, insira na saída inferior do canal e solte lentamente o êmbolo da pipeta para puxar cuidadosamente a suspensão de célula única através do canal inferior. Aspire a suspensão do excesso de células da superfície do chip. Evite contato direto com as portas de entrada e saída para garantir que nenhuma suspensão celular seja aspirada fora dos canais.Transfira o chip para o microscópio para verificar a densidade de semeadura. O canal inferior está cheio de células sem lacunas observáveis no meio. Depois de confirmar a densidade celular correta, semeou as células nos chips restantes.Para fixar as células na membrana porosa, que está localizada em cima do canal inferior, inverta cada chip e deixe descansar em um berço de chip. Coloque um pequeno reservatório contendo DPBS estéreis dentro da antena de 150 milímetros para fornecer umidade para as células. Incubar os chips a 37 graus Celsius por aproximadamente três horas ou até que as células do canal inferior tenham sido anexadas.Uma vez que as células endoteliais microvasculares cerebrais derivadas do iPSC tenham sido anexadas, gire os chips de volta para uma posição vertical para permitir o apego celular à parte inferior do canal inferior. 48 horas após a semeadura das células microvasculares microvasculares cerebrais derivadas do iPSC, equilibram a temperatura do meio das células endoteliais aquecendo-se em um banho de água Celsius de 37 graus por uma hora. Em seguida, desgas o meio por incubação sob um sistema de filtragem movido a vácuo por 15 minutos.Em seguida, higienize o exterior da embalagem do módulo portátil e bandejas com 70% de etanol, limpe e transfira para o armário de biossegurança. Abra a embalagem e coloque os módulos na bandeja Oriente-os com os reservatórios em direção à parte de trás da bandeja. Pipeta três mililitros da mídia pré-equilibrada e quente para cada reservatório de entrada.Adicione o meio de cultura celular endotelial ao reservatório de entrada do canal inferior e meio de diferenciação neural ao reservatório de entrada do canal superior do canal superior. Em seguida, pipeta 300 microliters da mídia pré-equilibrada e quente para cada reservatório de tomada, diretamente sobre cada porta de tomada. Coloque até seis módulos portáteis em cada bandeja.Leve as bandejas para a incubadora e deslize completamente para dentro do módulo de cultura com a alça da bandeja voltada para fora. Selecione e execute o ciclo primo no módulo de cultura. Feche a porta da incubadora e permita que o módulo de cultura forque os módulos portáteis por cerca de um minuto.O ciclo de escoramento é concluído quando a barra de status estiver pronta. Remova a bandeja do módulo de cultura e leve-a para o armário de biossegurança. Inspecione a parte inferior de cada módulo portátil no gabinete de biossegurança para verificar se os módulos portáteis foram preparados com sucesso.Procure a presença de pequenas gotículas em todas as quatro portas. Se algum módulo portátil não mostrar gotículas, reprise o ciclo primo nesses módulos. Se alguma mídia escorrer sobre a bandeja, que ocorre com mais frequência pelos portos de saída, limpe a bandeja com 70% de etanol.Em seguida, lave suavemente ambos os canais de cada chip com meio de cultura quente e equilibrado específico para remover quaisquer possíveis bolhas no canal e coloque pequenas gotículas de mídia na parte superior de cada porta de entrada e saída. Insira os chips com as transportadoras nos módulos portáteis e coloque até seis em cada bandeja. Insira as bandejas no módulo de cultura.Programe as condições adequadas de cultura do chip de órgão, como vazão e alongamento, no módulo de cultura. Assim que o ciclo de regulação estiver concluído, que leva aproximadamente duas horas, as condições programadas começam. Depois disso, o módulo de cultura começa a fluir nas condições de cultura de chip de órgão predefinido.A imunocitoquímica no chip de barreira hematoencefálica baseado em iPSC sete dias após a semeadura mostra as esferas de EZ diferenciadas em uma população de células neurais mistas no canal superior do cérebro, incluindo astrócitos beta-positivos S100, células progenitoras neurais positivas nestin, bem como astrócitos positivos GFAP, e neurônios beta III tubulin-positivos. Células endoteliais microvasculares microvasculares derivadas do IPSC semeadas no canal do lado do sangue inferior expressaram GLUT-1 e PECAM-1. A avaliação da permeabilidade do chip de barreira hematoencefálica demonstra que o chip de órgão semeado com células microvasculares cerebrais derivadas do iPSC e esferas EZ tinha uma barreira apertada em comparação com chips de órgão semeados apenas com células microvasculares microvasculares cerebrais derivadas do iPSC.Os chips de órgão semeados apenas com esferas EZ não apresentaram nenhuma propriedade de barreira. Desde o tratamento superficial inicial do canal até a troca média todos os dias, evite a formação de bolhas no canal. Ao longo da etapa do protocolo em que reagente de ativação de superfície, matriz extracelular ou meio contendo células precisam ser inseridos através dos canais, é extremamente importante verificar cuidadosamente se nenhuma bolha é encontrada.O ensaio de permeabilidade pode ser realizado para avaliar a penetrabilidade cerebral humana das drogas candidatas. Essa abordagem pode servir para testar possíveis terapêuticas. A aplicação do chip BBB baseado em iPSC permite estudar o papel do BBB em diversas doenças neurológicas.No futuro, essa plataforma pode ser útil para aplicações preditivas e personalizadas de medicamentos.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Human Adipose Stem Cells through Dedifferentiation of Mature Adipocytes in Ceiling Cultures

Mature adipocytes have been shown to reverse their phenotype into fibroblast-like cells in vitro through a technique called ceiling culture. Mature adipocytes can also be isolated from fresh adipose tissue for depot-specific characterization of their function and metabolic properties. Here, we describe a well-established protocol to isolate mature adipocytes from adipose tissues using collagenase digestion, and subsequent steps to perform ceiling cultures. Briefly, adipose tissues are incubated in a Krebs-Ringer-Henseleit buffer containing collagenase to disrupt tissue matrix. Floating mature adipocytes are collected on the top surface of the buffer. Mature cells are plated in a T25-flask completely filled with media and incubated upside down for a week. An alternative 6-well plate culture approach allows the characterization of adipocytes undergoing dedifferentiation. Adipocyte morphology drastically changes over time of culture. Immunofluorescence can be easily performed on slides cultivated in 6-well plates as demonstrated by FABP4 immunofluorescence staining. FABP4 protein is present in mature adipocytes but down-regulated through dedifferentiation of fat cells. Mature adipocyte dedifferentiation may represent a new avenue for cell therapy and tissue engineering.

Mature adipocytes may represent an abundant source of stem cells through dedifferentiation, which leads to a homogenous population of fibroblast-like cells. Collagenase digestion is used to isolate mature adipocytes from human fat. The goal of our protocol is to obtain multipotent, dedifferentiated fat cells from human mature adipocytes.

Geração de adiposo humano Stem Cells através Dedifferentiation de adipócitos maduros em Culturas de teto

Mature adipocytes have been shown to reverse their phenotype into fibroblast-like cells in vitro through a technique called ceiling culture. Mature ...

Biologia do Desenvolvimento

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function and physiology of their in vivo tissue counterparts. This is exemplified by organotypic skin cultures which faithfully recapitulates the epidermal differentiation and stratification program. Primary human epidermal keratinocytes are genetically manipulable through retroviruses where genes can be easily overexpressed or knocked down. These genetically modified keratinocytes can then be used to regenerate human epidermis in organotypic skin cultures providing a powerful model to study genetic pathways impacting epidermal growth, differentiation, and disease progression. The protocols presented here describe methods to prepare devitalized human dermis as well as to genetically manipulate primary human keratinocytes in order to generate organotypic skin cultures. Regenerated human skin can be used in downstream applications such as gene expression profiling, immunostaining, and chromatin immunoprecipitations followed by high throughput sequencing. Thus, generation of these genetically modified organotypic skin cultures will allow the determination of genes that are critical for maintaining skin homeostasis.

The goal of this paper is to provide a comprehensive and detailed protocol on how to generate genetically modified human organotypic skin from epidermal keratinocytes and devitalized human dermis.

Geração de Culturas Geneticamente Modificados Pele organotï¿½icas Usando desvitalizado derme humana

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets of patients with metastatic melanoma. Major obstacles of this approach are the reduced viability of transferred T cells, caused by telomere shortening, and the limited number of TILs obtained from patients. Less-differentiated T cells with long telomeres would be an ideal T cell subset for adoptive T cell therapy;however, generating large numbers of these less-differentiated T cells is problematic. This limitation of adoptive T cell therapy can be theoretically overcome by using induced pluripotent stem cells (iPSCs) that self-renew, maintain pluripotency, have elongated telomeres, and provide an unlimited source of autologous T cells for immunotherapy. Here, we present a protocol to generate iPSCs using Sendai virus vectors for the transduction of reprogramming factors into TILs. This protocol generates fully reprogrammed, vector-free clones. These TIL-derived iPSCs might be able to generate less-differentiated patient- and tumor-specific T cells for adoptive T cell therapy.

The goal of this protocol is to show the protocol for reprogramming melanoma tumor-infiltrating lymphocytes into induced pluripotent stem cells.

Geração de células-tronco pluripotentes induzidas a partir de melanoma humano linfócitos tumor infiltrantes

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the human body. The differentiation of hPSCs to human hepatocyte-like cells (HLCs) has been extensively studied, and efficient differentiation protocols have been established. The combination of extracellular matrix and biological stimuli, including growth factors, cytokines, and small molecules, have made it possible to generate HLCs that resemble primary human hepatocytes. However, the majority of procedures still employ undefined components, giving rise to batch-to-batch variation. This serves as a significant barrier to the application of the technology. To tackle this issue, we developed a defined system for hepatocyte differentiation using human recombinant laminins as extracellular matrices in combination with a serum-free differentiation process. Highly efficient hepatocyte specification was achieved, with demonstrated improvements in both HLC function and phenotype. Importantly, this system is easy to scale up using research and GMP-grade hPSC lines&#160;promising advances in cell-based modelling and therapies.

The method presented here describes a scalable and good manufacturing practice (GMP)-ready differentiation system to generate human hepatocyte-like cells from pluripotent stem cells. It serves as a cost-effective and standardized system to generate human hepatocyte-like cells for basic and applied human liver research.

Definido e Geração de Scalable de células de hepatócitos-like de células-tronco pluripotentes humanas

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that limits the translation of basic brain research into clinical application. While induced pluripotent stem cells (iPSCs) have replaced the ethically questionable human embryonic stem cells, iPSC-based neuronal differentiation studies remain descriptive at the cellular level but fail to adequately provide the details that could be derived from a complex, 3D human brain tissue. 
This gap is now filled through the application of iPSC-derived, 3D brain organoids, "Brains in a dish," that model many features of complex human brain development. Here, a method for generating iPSC-derived, 3D brain organoids is described. The organoids can help with modeling autosomal recessive primary microcephaly (MCPH), a rare human neurodevelopmental disorder. A widely accepted explanation for the brain malformation in MCPH is a depletion of the neural stem cell pool during the early stages of human brain development, a developmental defect that is difficult to recreate or prove in vitro. 
To study MCPH, we generated iPSCs from patient-derived fibroblasts carrying a mutation in the centrosomal protein CPAP. By analyzing the ventricular zone of microcephaly 3D brain organoids, we showed the premature differentiation of neural progenitors. These 3D brain organoids are a powerful in vitro system that will be instrumental in modeling congenital brain disorders induced by neurotoxic chemicals, neurotrophic viral infections, or inherited genetic mutations.

Modeling human brain development has been hindered due to the unprecedented complexity of neural epithelial tissue. Here, a method for the robust generation of brain organoids to delineate early events of human brain development and to model microcephaly in vitro is described.

Geração de iPSC-derivado do cérebro Organóides Humanos para modelar alterações precoces do desenvolvimento neurológico

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. In addition, keratinocytes play an essential role in the initiation, maintenance, and regulation of epidermal immune responses by being part of the innate immune system responding to antigenic stimuli in a fast, nonspecific manner. Here, we describe a protocol for isolation of primary human keratinocytes from adult skin, and demonstrate that these cells respond to calcium-induced terminal differentiation, as measured by an increased expression of the differentiation marker involucrin. In addition, we show that the isolated keratinocytes are responsive to IL-1&#946;-induced activation of intracellular signaling pathways as measured by the activation of the p38 MAPK pathway. Taken together, we describe a method for isolation and culturing of primary human keratinocytes from adult skin. Because the keratinocytes are the predominant cell type in the epidermis, this method is useful to study molecular mechanisms in cutaneous biology in vitro.

The human skin acts as a first line of defense against the external environment. We present a method for isolating primary human keratinocytes from adult skin. These isolated keratinocytes are useful in numerous experimental setups, and are a highly suitable model for studying molecular mechanisms in cutaneous biology in vitro.

Geração e cultivo de queratinócitos humanos primários da pele de adulto

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. ...

Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted in sophisticated in vitro models of the intestinal mucosa. Leveraging these emerging model systems will require adaptation of tools and techniques developed for 2D culture systems and animals. Here, we describe a technique for measuring epithelial barrier permeability in human intestinal organoids in real-time. This is accomplished by microinjection of fluorescently-labeled dextran and imaging on an inverted microscope fitted with epifluorescent filters. Real-time measurement of the barrier permeability in intestinal organoids facilitates the generation of high-resolution temporal data in human intestinal epithelial tissue, although this technique can also be applied to fixed timepoint imaging approaches. This protocol is readily adaptable for the measurement of epithelial barrier permeability following exposure to pharmacologic agents, bacterial products or toxins, or live microorganisms. With minor modifications, this protocol can also serve as a general primer on microinjection of intestinal organoids and users may choose to supplement this protocol with additional or alternative downstream applications following microinjection.

This protocol describes the measurement of epithelial barrier permeability in real-time following pharmacologic treatment in human intestinal organoids using fluorescent microscopy and live cell microscopy.

Medição em tempo real da permeabilidade da barreira epitelial no Organoids Intestinal humana

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give rise to multiple cell types, including the myotome (MYO), sclerotome (SCL), dermatome (D), and syndetome (SYN), which in turn develop into skeletal muscle, axial skeleton, dorsal dermis, and axial tendon/ligament, respectively. Therefore, the generation of SMs and their derivatives from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is critical to obtain pluripotent stem cells (PSCs) for application in regenerative medicine and for disease research in the field of orthopedic surgery. Although the induction protocols for MYO and SCL from PSCs have been previously reported by several researchers, no study has yet demonstrated the induction of SYN and D from iPSCs. Therefore, efficient induction of fully competent SMs remains a major challenge. Here, we recapitulate human SM patterning with human iPSCs in vitro by mimicking the signaling environment during chick/mouse SM development, and report on methods of systematic induction of SM derivatives (MYO, SCL, D, and SYN) from human iPSCs under chemically defined conditions through the presomitic mesoderm (PSM) and SM states. Knowledge regarding chick/mouse&#160;SM development was successfully applied to the induction of SMs with human iPSCs. This method could be a novel tool for studying human somitogenesis and patterning without the use of embryos and for cell-based therapy and disease modeling.

We present here a protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into each somite derivative (myotome, sclerotome, dermatome, and syndetome) in chemically defined conditions, which has applications in future disease modeling and cell-based therapies in orthopedic surgery.

Na geração de Vitro do Somite derivados de humanos induzida por células tronco pluripotentes

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous system and protects neural tissue from toxins and pathogens. Defects in the formation of this barrier have been correlated with neuropathies, and the breakdown of this barrier has been observed in many neurodegenerative diseases. Therefore, it is critical to identify the genes that regulate the formation and maintenance of the blood-brain barrier to identify potential therapeutic targets. In order to understand the exact roles these genes play in neural development, it is necessary to assay the effects of altered gene expression on the integrity of the blood-brain barrier. Many of the molecules that function in the establishment of the blood-brain barrier have been found to be conserved across eukaryotic species, including the fruit fly, Drosophila melanogaster. Fruit flies have proven to be an excellent model system for examining the molecular mechanisms regulating nervous system development and function. This protocol describes a step-by-step procedure to assay for blood-brain barrier integrity during the embryonic and larval stages of D. melanogaster development.

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Blood-brain barrier integrity is critical for nervous system function. In Drosophila melanogaster, the blood-brain barrier is formed by glial cells during late embryogenesis. This protocol describes methods to assay for blood-brain barrier formation and maintenance in D. melanogaster embryos and third instar larvae.

Ensaio para a integridade da barreira hematoencefálica na Drosophila melanogaster

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous ...

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can also become diseased and cause morbidity and even death. Model systems to study human endometrial biology have been limited to in vitro culture systems of single cell types. In addition, the epithelial cells, one of the major cell types of the endometrium, do not propagate well or retain their physiological traits in culture, and thus our understanding of endometrial biology remains limited. We have generated, for the first time, endometrial organoids that consist of both epithelial and stromal cells of the human endometrium. These organoids do not require any exogenous scaffold materials and specifically organize so that epithelial cells encompass the spheroid-like structure and become polarized with stromal cells in the center that produce and secrete collagen. Estrogen, progesterone and androgen receptors are expressed in the epithelial and stromal cells and treatment with physiological levels of estrogen and testosterone promote the organization of the organoids. This new model system can be used to study normal endometrial biology and disease in ways that were not possible before.

A protocol to generate human primary endometrial organoids that consist of epithelial and stromal cells and retain characteristics of the native endometrial tissue is presented. This protocol describes methods from uterine tissue acquisition to the histologic processing of endometrial organoids.

Geração de organóides endometriais primários humanos multicelulares

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...