Name: generation of a human ipsc-based blood-brain barrier chip
Uploaded: 2020-03-02T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of a Human iPSC-Based Blood-Brain Barrier Chip at JoVE.com

Мы хотели бы поблагодарить д-ра Сошану Свендсен за критический монтаж. Эта работа была поддержана ГрантОм Израильского научного фонда 1621/18, Министерством науки и техники (MOST), Израилем 3-15647, Калифорнийским институтом регенеративной медицины, грантом ID DISC1-08800, Фондом семьи Шерманов, грантом NIH-NINDS 1UG3NS105703 и грантом Ассоциации ALS 18-SI-389. AH финансировался Фондом Валленберга (грант No 2015.0178).

1. Поколение клеток нейро-прародителя, полученных iPSC(iNPCs)
<ol><li>Продукция эквалайзера из колоний iPSC, как описано ниже и как ранее опубликовано20,21,22.<ol>
<li>Культура iPSC колоний для слияния на подвале мембраны матрицы покрытием 6 хорошо пласти...

<ol>
	<li>Pardridge, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+endogenous+transporters+as+therapeutic+targets:+a+new+model+for+small+molecule+CNS+drug+discovery.">Blood-brain barrier endogenous transporters as therapeutic targets: a new model for small molecule CNS drug discovery.</a> Expert Opinion on Therapeutic Targets. 19 (8), 1059-1072 (2015).</li><li>Gastfriend, B. D., Palecek, S. P., Shusta, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+blood-brain+barrier:+beyond+the+endothelial+cells.">Modeling the blood-brain barrier: beyond the endothelial cells.</a> Current Opinion in Biomedical Engineering. 5, 6-12 (2018).</li><li>Jamieson, J. J., Linville, R. M., Ding, Y. Y., Gerecht, S., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+iPSC-derived+pericytes+on+barrier+function+of+iPSC-derived+brain+microvascular+endothelial+cells+in+2D+and+3D.">Role of iPSC-derived pericytes on barrier function of iPSC-derived brain microvascular endothelial cells in 2D and 3D.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 16 (1), 15 (2019).</li><li>El-Habashy, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+treatment+strategies+for+brain+tumors+and+metastases.">Novel treatment strategies for brain tumors and metastases.</a> Pharmaceutical Patent Analyst. 3 (3), 279-296 (2014).</li><li>Lim, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntington's+disease+iPSC-derived+brain+microvascular+endothelial+cells+reveal+WNT-mediated+angiogenic+and+blood-brain+barrier+deficits.">Huntington's disease iPSC-derived brain microvascular endothelial cells reveal WNT-mediated angiogenic and blood-brain barrier deficits.</a> Cell Reports. 19 (7), 1365-1377 (2017).</li><li>Dumitrescu, A. M., Liao, X. H., Weiss, R. E., Millen, K., Refetoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+thyroid+hormone+deprivation+and+excess+in+monocarboxylate+transporter+(mct)+8-deficient+mice.">Tissue-specific thyroid hormone deprivation and excess in monocarboxylate transporter (mct) 8-deficient mice.</a> Endocrinology. 147 (9), 4036-4043 (2006).</li><li>Spencer, J. I., Bell, J. S., DeLuca, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+pathology+in+multiple+sclerosis:+reframing+pathogenesis+around+the+blood-brain+barrier.">Vascular pathology in multiple sclerosis: reframing pathogenesis around the blood-brain barrier.</a> Journal of Neurology and Neurosurgical Psychiatry. 89 (1), 42-52 (2018).</li><li>Yamazaki, Y., Kanekiyo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+dysfunction+and+the+pathogenesis+of+Alzheimer's+disease.">Blood-brain barrier dysfunction and the pathogenesis of Alzheimer's disease.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (9), 1965 (2017).</li><li>Ben-Zvi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mfsd2a+is+critical+for+the+formation+and+function+of+the+blood-brain+barrier.">Mfsd2a is critical for the formation and function of the blood-brain barrier.</a> Nature. 509 (7501), 507 (2014).</li><li>Heng, M. Y., Detloff, P. J., Albin, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rodent+genetic+models+of+Huntington+disease.">Rodent genetic models of Huntington disease.</a> Neurobiology of Disease. 32 (1), 1-9 (2008).</li><li>Ho, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALS+disrupts+spinal+motor+neuron+maturation+and+aging+pathways+within+gene+co-expression+networks.">ALS disrupts spinal motor neuron maturation and aging pathways within gene co-expression networks.</a> Nature Neuroscience. 19 (9), 1256 (2016).</li><li>Griep, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BBB+on+chip:+microfluidic+platform+to+mechanically+and+biochemically+modulate+blood-brain+barrier+function.">BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function.</a> Biomedical Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).</li><li>Prabhakarpandian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+tumor+networks+for+screening+drug+delivery+systems.">Synthetic tumor networks for screening drug delivery systems.</a> Journal of controlled release. 201, 49-55 (2015).</li><li>Delsing, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barrier+properties+and+transcriptome+expression+in+human+iPSC-derived+models+of+the+blood-brain+barrier.">Barrier properties and transcriptome expression in human iPSC-derived models of the blood-brain barrier.</a> Stem Cells. 36 (12), 1816-1827 (2018).</li><li>Park, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-enhanced+Blood-Brain+Barrier+Chip+recapitulates+human+barrier+function+and+shuttling+of+drugs+and+antibodies.">Hypoxia-enhanced Blood-Brain Barrier Chip recapitulates human barrier function and shuttling of drugs and antibodies.</a> Nature Communications. 10 (1), 2621 (2019).</li><li>Vatine, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPSC-Derived+Blood-Brain+Barrier+Chips+Enable+Disease+Modeling+and+Personalized+Medicine+Applications.">Human iPSC-Derived Blood-Brain Barrier Chips Enable Disease Modeling and Personalized Medicine Applications.</a> Cell Stem Cell. 24 (6), 995-1005 (2019).</li><li>Henry, O. Y. F., Villenave, R., Cronce, M. J., Leineweber, W. D., Benz, M. A., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organs-on-chips+with+integrated+electrodes+for+trans-epithelial+electrical+resistance+(TEER)+measurements+of+human+epithelial+barrier+function.">Organs-on-chips with integrated electrodes for trans-epithelial electrical resistance (TEER) measurements of human epithelial barrier function.</a> Lab on a Chip. 17 (13), 2264-2271 (2017).</li><li>Sances, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPSC-derived+endothelial+cells+and+microengineered+organ+chip+enhance+neuronal+development.">Human iPSC-derived endothelial cells and microengineered organ chip enhance neuronal development.</a> Stem Cell Reports. 10 (4), 1222-1236 (2018).</li><li>Workman, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+utilization+of+induced+pluripotent+stem+cell&#8211;derived+human+intestinal+organoids+using+microengineered+chips.">Enhanced utilization of induced pluripotent stem cell&#8211;derived human intestinal organoids using microengineered chips.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 669-677 (2018).</li><li>Ebert, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EZ+spheres:+a+stable+and+expandable+culture+system+for+the+generation+of+pre-rosette+multipotent+stem+cells+from+human+ESCs+and+iPSCs.">EZ spheres: a stable and expandable culture system for the generation of pre-rosette multipotent stem cells from human ESCs and iPSCs.</a> Stem Cell Research. 10 (3), 417-427 (2013).</li><li>Shelley, B. C., Gowing, G., Svendsen, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cGMP-applicable+expansion+method+for+aggregates+of+human+neural+stem+and+progenitor+cells+derived+from+pluripotent+stem+cells+or+fetal+brain+tissue.">A cGMP-applicable expansion method for aggregates of human neural stem and progenitor cells derived from pluripotent stem cells or fetal brain tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), e51219 (2014).</li><li>Vatine, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+psychomotor+retardation+using+iPSCs+from+MCT8-deficient+patients+indicates+a+prominent+role+for+the+blood-brain+barrier.">Modeling psychomotor retardation using iPSCs from MCT8-deficient patients indicates a prominent role for the blood-brain barrier.</a> Cell Stem Cell. 20 (6), 831-843 (2017).</li><li>Svendsen, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+the+rapid+and+long+term+growth+of+human+neural+precursor+cells.">A new method for the rapid and long term growth of human neural precursor cells.</a> Journal of Neuroscience Methods. 85 (2), 141-152 (1998).</li><li>Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+retinoic+acid-enhanced,+multicellular+human+blood-brain+barrier+model+derived+from+stem+cell+sources.">A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources.</a> Scientific Reports. 4, 4160 (2014).</li><li>Canfield, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+isogenic+blood-brain+barrier+model+comprising+brain+endothelial+cells,+astrocytes,+and+neurons+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">An isogenic blood-brain barrier model comprising brain endothelial cells, astrocytes, and neurons derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Journal of Neurochemistry. 140 (6), 874-888 (2017).</li><li>Jamieson, J. J., Gerecht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chipping+Away+at+Blood-Brain-Barrier+Modeling.">Chipping Away at Blood-Brain-Barrier Modeling.</a> Cell stem cell. 24 (6), 831-832 (2019).</li><li>Faal, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Mesoderm+and+Neural+Crest-Derived+Pericytes+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells+to+Study+Blood-Brain+Barrier+Interactions.">Induction of Mesoderm and Neural Crest-Derived Pericytes from Human Pluripotent Stem Cells to Study Blood-Brain Barrier Interactions.</a> Stem Cell Reports. 12 (3), 451-460 (2019).</li><li>Lippmann, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+blood-brain+barrier+endothelial+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 30 (8), 783 (2012).</li><li>Qian, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+blood-brain+barrier+endothelial+cells.">Directed differentiation of human pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells.</a> Science Advances. 3 (11), 1701679 (2017).</li><li>Neal, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified,+Fully+Defined+Differentiation+Scheme+for+Producing+Blood-Brain+Barrier+Endothelial+Cells+from+Human+iPSCs.">A Simplified, Fully Defined Differentiation Scheme for Producing Blood-Brain Barrier Endothelial Cells from Human iPSCs.</a> Stem Cell Reports. 12 (6), 1380-1388 (2019).</li><li>Wevers, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+perfused+human+blood-brain+barrier+on-a-chip+for+high-throughput+assessment+of+barrier+function+and+antibody+transport.">A perfused human blood-brain barrier on-a-chip for high-throughput assessment of barrier function and antibody transport.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 15 (1), 23 (2018).</li><li>Huh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabrication+of+human+organs-on-chips.">Microfabrication of human organs-on-chips.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2135 (2013).</li><li>Huh, D., Matthews, B. D., Mammoto, A., Montoya-Zavala, M., Hsin, H. Y., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+organ-level+lung+functions+on+a+chip.">Reconstituting organ-level lung functions on a chip.</a> Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).</li></ol>

Сочетание технологии органа на чипе и iPSC-клеток в NVU обещает точное моделирование человека BBB. Здесь мы предоставляем подробный протокол для простого и надежного применения недавно опубликованного чипа BBB-16 на основе iPSC. Обзор и сроки парадигмы посева показаны на <strong class="xfig...

BBB является очень селективным барьером, который отделяет ЦНС от циркулирующей крови. Он защищает критические функции мозга от потенциально разрушительных веществ, факторов и ксенобиотики, а также позволяет приток питательных веществ и других метаболитов, необходимых для поддержания гомеостаза мозга1. BBB является многоклеточным NVU, в котором перициты, астроциты endfeet, и нейронные процессы непосредственно контакт мозга микрососудистых эндотелиальных клеток (BMECs). Эти взаимодействия позволяют BMECs формировать специализированные барьерные свойства, которые поддерживаются плотными и придерживает соединения2,3. Формирование этого барьера ограничивает параклеточный проход молекул, но содержит поляризованные транспортеры для активного переноса молекул в ЦНС или обратно в кровь1. Из-за этих уникальных барьерных свойств, BBB представляет собой серьезное препятствие для доставки биофармацевтических препаратов в мозг, и, по оценкам, менее 5% FDA утвержденных малых молекул может достичь ЦНС4.
Модели животных широко используются для изучения пенетранса BBB и молекулярных механизмов, участвующих в разработке BBB5. В то время как модели животных точно представляют собой сложную многоклеточную среду in vivo, различия в экспрессии и активности перевозчиков BBB, а также субстрата специфики между видами часто исключают точную экстраполяцию данных о животных на людей6. Таким образом, модели на основе человека имеют решающее значение для изучения БББ человека и для использования в разработке препаратов, предназначенных для целевой ЦНС. Эта необходимость становится еще более очевидной в связи с растущим доминированием биологических, специфических для человека препаратов в области фармацевтического развития. Накопление доказательств свидетельствует о том, что скомпрометированный BBB связан с рядом тяжелых заболеваний ЦНС, включая опухоли головного мозга и неврологические заболевания7,8,9. Человеческие модели, верой он ко мне, отражающие эти заболевания, могут идентифицировать как 1) определить новые пути, которые могут быть направлены на разработку лекарств, и 2) предсказывают пенетранс ЦНС, тем самым сокращая время и ресурсы в доклинических исследованиях и, возможно, уменьшая частоту отказов в клинических испытаниях.
Модели In vitro были широко реализованы для изучения взаимодействия между BMECs и другими клетками НВУ и проведения экранов для перспективных BBB-проницаемых препаратов10. Чтобы воссоздать ключевые аспекты человеческого BBB, модели in vitro должны отображать физиологически значимые свойства (т.е. низкую парацеллюлярную проницаемость и физиологически релевантную трансэндотелиальную электрическую устойчивость (TEER) через эндотелиальный монослой). Кроме того, молекулярный профиль системы in vitro должен включать экспрессию репрезентативных функциональных транспортных систем. Как правило, модели in vitro состоят из эндотелиальных клеток, которые совместно культивируются на полупроницаемой мембране с комбинациями других клеток НВУ для повышения свойств BBB11. Такой подход позволяет просто и относительно быстро оценить барьерную функциональность и проницаемость молекул. Такие модели BBB на основе клеток на основе клеток могут быть установлены с помощью животных или человеческих клеточных источников, включая клетки, изолированные от хирургических иссечений или увековеченные линии BMEC.
Недавно, протоколы для дифференцировать человека плюрипотентных клеток в BMECs были введены в качестве привлекательного источника для in vitro человека BBB модели12,13. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC) полученные BMECs (iBMECs) являются высоко масштабируемыми, демонстрируют критические морфологические и функциональные характеристики человека BBB, и нести генетику пациента. В культуре iBMECs образуют монослой, который выражает плотные маркеры соединения и отображает в виво-подобных плотных комплексах соединения. Эти клетки также выражают маркеры BBB, в том числе транспортер глюкозы BBB, транспортер глюкозы 1 (GLUT1). Важно, и в отличие от других альтернативных источников клеток для человека BMECs, iBMECs приобрести барьерные свойства со значениями выше, чем те, измеряется в vivo14, поляризуйте вдоль базолатеральной оси, и выразить функциональные насосы efflux. Кроме того, использование iPSCs от различных предметов, как 1) приветствует возможность проверить аспекты BBB в персонализированной медицинской основе и 2) обеспечивает гибкий источник для генерации дополнительных типов клеток НВУ. Создание этих клеток из изогенного источника клеток для создания персонализированных чипов BBB также поможет в понимании межиндивидуальных различий в ответных мерах на наркотики, что является основной причиной устойчивости или скомпрометированной реакции на лечение, наблюдаемое в клинических исследованиях.
Использование iBMECs в качестве монослойных в блюде или на полупроницаемой вставке transwell представляет собой мощный подход для моделирования BBB. Эти системы, как правило, являются надежными, воспроизводимыми и рентабельными. Кроме того, функциональные анализы, такие как TEER и проницаемость относительно просты в выполнении. Тем не менее, двумерные (2D) системы не в состоянии резюмировать 3D характер ткани in vivo, и они не имеют физиологических сил сдвига стресса, предоставляемых циркулирующих крови и клеток крови. Это ограничивает способность сосудистого эндотелия в этих моделях развивать и поддерживать внутренние свойства и функции BBB.
Микроинженерные системы, выложенные живыми клетками, были внедрены для моделирования различных функциональных возможностей органов в концепции, называемой органом на чипах. Воссоздавая виво-подобную многоклеточную архитектуру, интерфейсы тканей и тканей, физико-химическую микросреду и сосудистую перфузию, эти микроинженерные платформы генерируют уровни ткани и функциональности органов, которые невозможны с обычные 2D системы культуры. Они также позволяют высокое разрешение, в режиме реального времени изображения, а также анализ биохимических, генетических и метаболических профилей похож на живые клетки в ткани in vivo и органа контексте. Тем не менее, особая проблема органа на чипе заключается в том, что проектирование, изготовление и применение этих микроинженерных чипов требует специализированных инженерных знаний, которые, как правило, не хватает в биологически ориентированных научных лабораторий.
Недавно мы объединили технологии iPSC и орган-на-чипе для создания персонализированной модели чипов BBB15,16. Для преодоления описанных технологических проблем коммерчески доступный Chip-S1 используется вместе с модулем культуры, инструментом, предназначенным для автоматизации обслуживания чипов простым и надежным способом (Emulate Inc.). Чип BBB воссоздает взаимодействия между нервными и эндотелиальными клетками и достигает физиологически значимых значений TEER, которые измеряются пользовательскими чипами органов с интегрированными золотыми электродами17. Кроме того, чип BBB отображает низкую параклеетальную проницаемость, реагирует на воспалительные сигналы на уровне органов, выражает активные насосы efflux и демонстрирует прогностический перенос растворимых биомаркеров и биофармацевтических препаратов. Примечательно, что чипы BBB, генерируемые из нескольких особей, фиксируют ожидаемые функциональные различия между здоровыми людьми и пациентами с неврологическими заболеваниями15.
В описанном ниже протоколе описывается надежный, эффективный и воспроизводимый метод генерации чипов BBB на основе iPSC в условиях динамического потока. Руководство предоставляется по типу анализов и анализа конечных точек, которые могут быть выполнены непосредственно в чипе BBB или из отбора сточных вод. Таким образом, протокол демонстрирует спектр методов, которые могут быть применены для оценки биологических и функциональных свойств и реакций в модели, соответствующей человеку.
Краткое описание чипа BBB на основе iPSC приведено здесь. IPSCs человека первоначально дифференцированы и распространяются в флягах культуры ткани как свободно плавающие агрегаты нейронных прародителей, называемых эквалайзер-сферы. Верхний канал Chip-S116,18,19 посеян с разрозненные эквалайзер-сферы, которые образуют "мозговой стороне" чипа, как клетки дифференцировать в течение 7 дней в смешанной культуре нейронных клеток-прародителей (iNPCs), iAstrocytes, и iNeurons. IPSCs человека также дифференцированы в плитах культуры ткани в iBMECs. Нижний канал чипа посеян с iBMECs для формирования "кровь стороны", как они развиваются, чтобы сформировать эндотелиальную трубку (Рисунок 1). Пористая внеклеточная матрица (ECM) с покрытием мембрана, которая отделяет верхний и нижний каналы 1) позволяет образованию клеток к клетке взаимодействия между каналами и 2) позволяет пользователю запускать проницаемость анализов и изображений клеток в любом канале с помощью обычного светового микроскопа.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SCR005</td>
			<td>Dissociation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bfgf</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chip-S1</td>
			<td>Emulate Inc</td>
			<td>Chip-S1</td>
			<td>Organ-Chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D3571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran-FITC</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>46944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM: F12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31330038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emulate Reagent 1 (ER-1)</td>
			<td>Emulate Inc</td>
			<td>ER-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emulate Reagent 2 (ER-2)</td>
			<td>Emulate Inc</td>
			<td>ER-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP)</td>
			<td>Dako</td>
			<td>Z0334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GLUT-1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MA5-11315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050038</td>
			<td>Glutamine supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hBDNF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOSR</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>Basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>StemCell Technologies, Inc.</td>
			<td>85851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA</td>
			<td>Biological industries</td>
			<td>01-340-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nestin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NutriStem</td>
			<td>Biological industries</td>
			<td>05-100-1A</td>
			<td>Alternate media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PECAM-1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platelet-poor plasma-derived bovine serum (PPP)</td>
			<td>Biomedical Technologies</td>
			<td>J64483AB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid (RA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S100&#946;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZO-1 Monoclonal Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>33-9100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;III-tubulin (Tuj1&#945;)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>31350010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of a human ipsc-based blood-brain barrier chip

Гематоэнцефалический барьер (BBB) формируется нервно-сосудистыми подразделениями (НВУ), которые защищают центральную нервную систему (ЦНС) от целого ряда факторов, обнаруженных в крови, которые могут нарушить тонкую функцию мозга. Таким образом, BBB является основным препятствием для доставки терапевтических препаратов для ЦНС. Накопленные данные свидетельствуют о том, что BBB играет ключевую роль в начале и прогрессировании неврологических заболеваний. Таким образом, существует огромная потребность в модели BBB, которая может предсказать проникновение cnS-целевых препаратов, а также прояснить роль BBB в области здравоохранения и болезней.
Недавно мы объединили технологии органов на чипе и индуцированных стволовых клеток (iPSC) для создания чипа BBB, полностью персонализированного для человека. Эта новая платформа отображает клеточные, молекулярные и физиологические свойства, которые подходят для прогнозирования транспортировки лекарств и молекул через человека BBB. Кроме того, используя специфические для пациента чипы BBB, мы создали модели неврологических заболеваний и продемонстрировали потенциал для персонализированного применения прогностической медицины. Приведенный здесь подробный протокол, демонстрирующий, как генерировать микросхемы BBB, полученные из iPSC, начиная с дифференциации микрососудистых эндотелиальных клеток мозга, полученных iPSC (iBMECs) и в результате смешанных нейронных культур, содержащих нейронных прародителей, дифференцированных нейронов и астроцитов. Также описана процедура посева клеток в органный чип и культивирование чипов BBB под контролируемым ламинарным потоком. Наконец, приводятся подробные описания анализа чипов BBB, включая параклеточные анализы проницаемости для оценки проницаемости препарата и молекулы, а также иммуноцитохимические методы для определения состава типов клеток в чипе.

Рисунок 6A,B,C представляет собой чип BBB, посеянный с эквалайзерами на верхнем канале «мозговой стороны» и iBMECs на «кровавом канале». iBMECs были посеяны первым и позволили прикрепить ночь, после чего эквалайзеры были посеяны. Чипы были затем культивировались в стати?...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of a Human iPSC-Based Blood-Brain Barrier Chip at JoVE.com

Generation of a Human iPSC-Based Blood-Brain Barrier Chip

Гематоэнцефалический барьер (BBB) является многоклеточным нервно-сосудистым подразделением, плотно регулирующим гомеостаз мозга. Объединив iPSCs человека и технологии органа на чипе, мы создали персонализированный чип BBB, пригодный для моделирования заболеваний и прогнозов проницаемости лекарств CnS. Подробный протокол описан для генерации и эксплуатации чипа BBB.

Поколение человека iPSC основе крови мозга барьер чип

The blood brain barrier (BBB) is formed by neurovascular units (NVUs) that shield the central nervous system (CNS) from a range of factors found in the ...

Этот протокол продемонстрирует, как дифференцированные индуцированные плюрипотентные стволовые клетки могут быть посеяны на орган-на-чипе для создания полностью человеческого, персонализированного, микрофлюидного геммозео-мозгового барьера, который может быть использован для прогнозирования проницаемости препарата центральной нервной системы и изучения неврологических расстройств. Используя коммерчески доступный орган-на-чипе, мы продемонстрируем, как любая биологически ориентированная лаборатория может использовать эту технологию для создания персонализированного, микрофлюидного гемового барьера на чипе. Накопление фактических данных свидетельствует о том, что BBB играет определенную роль в неврологических заболеваний путем создания персонализированных чипов BBB, полученных из iPSCs лиц с генетическим неврологическим заболеванием.Можно будет изучить роль BBB в здоровье и болезни. Этот метод также может быть полезен для фармацевтических компаний, которые могут использовать эту человеческую платформу BBB для проверки на пригодность неврологических препаратов-кандидатов в человеческий мозг. Применение технологий орган-на-чипе обычно требует специальных инженерных навыков.Использование коммерчески доступных платформ позволяет использовать эту технологию в любой биологически ориентированной лаборатории. Для начала возьмите блюдо, содержащее подготовленные чипсы, в шкаф для биобезопасности. Используя пипетку P200, аккуратно промыть оба канала, добавив 200 микролитров нервной дифференциации среды в вход и потянув жидкость из розетки.Избегая контакта с портами, тщательно аспирировать избыток капель мультимедиа с поверхности чипа. Аккуратно агитировать подвеску клетки, чтобы обеспечить однородную подвесную клетку. Чтобы посеять iPSC-производные нейронные клетки-предшественники в верхний канал для генерации стороны мозга, добавьте наконечник P200, содержащий от 30 до 100 микролитров клеточной подвески в концентрации от 1 раза 10 до шести клеток на миллилитр в верхний вход канала, и осторожно отпустите кончик из пипетки.Возьмите пустую трубу P200, угнетайте поршень, вставьте в розетку верхнего канала и осторожно потяните одноклеточную подвеску через кончик. Перенесите чип в микроскоп, чтобы проверить плотность посева и однородное распределение клеток в верхнем канале. После подтверждения плотности клеток при 20%-ном покрытии, сразу же поместите чипы в инкубатор на два часа при 37 градусах по Цельсию.После этого смойте клетки, которые не прикрепляются, добавляя свежую нейронную дифференциацию среды в вход и потянув жидкость через пипетку из розетки. Держите клетки в статических условиях на 37 градусов по Цельсию с ежедневной нейронной дифференциации средней замены. После того, как iNPCs прикрепили или на следующий день после посева, принести блюдо, содержащее подготовленные чипсы в шкаф биобезопасности.Аккуратно промыть нижний канал с помощью 200 микролитров эндотелиальной клеточной среды. Избегая контакта с портами, тщательно аспирируют капли избыточной эндотелиальной клеточной среды с поверхности чипа, убедившись, что оставить средний в обоих каналах. Аккуратно агитировать подвеску клетки, чтобы обеспечить однородную подвесную клетку.Используя пипетку P200, нарисуйте от 30 до 100 микролитров микрососудистой эндотелиальной клеточной подвески мозга iPSC при концентрации от 14 до 20 раз от 10 до шести клеток на миллилитр, и поместите кончик в вход нижнего канала. Наиболее важным шагом для достижения функциональных барьерных свойств является посев микрососудистых эндотелиальных клеток мозга. Очень важно, чтобы семенные клетки при надлежащей плотности, чтобы избежать образования пузырьков для проверки однородного распределения в орган чип.Угнетайте поршень на пипетке P200 с помощью пустого наконечника, вставьте в розетку нижнего канала и медленно отпустите поршень пипетки, чтобы тщательно вытащить одноклеточную подвеску через нижний канал. Аспирировать лишнюю подвеску ячейки с поверхности чипа. Избегайте прямого контакта с портами входов и выходов, чтобы гарантировать, что подвеска ячейки не будет аспирирована из каналов.Перенесите чип в микроскоп, чтобы проверить плотность посева. Нижний канал заполнен ячейками без наблюдаемых зазоров между ними. После подтверждения правильной плотности клеток, семян клеток в оставшихся чипов.Чтобы прикрепить клетки к пористой мембране, которая находится в верхней части нижнего канала, инвертировать каждый чип, и дайте им отдохнуть в колыбели чипа. Поместите небольшой резервуар, содержащий стерильные DPBS внутри 150-миллиметрового блюда, чтобы обеспечить влажность для клеток. Инкубировать чипы при 37 градусах по Цельсию в течение примерно трех часов или до тех пор, пока клетки в нижнем канале не будут прикреплены.После того, как iPSC-производные мозга микрососудистых эндотелиальных клеток прилагаются, флип чипы обратно в вертикальное положение, чтобы клетки крепления к нижней части нижнего канала. 48 часов после посева микрососудистых эндотелиальных клеток мозга, полученных iPSC, эквилибрировать температуру эндотелиальной клеточной среды путем потепления в 37-градусной водяной бане по Цельсию в течение одного часа. Затем дегазация среды путем инкубации под вакуумной системой фильтрации в течение 15 минут.Далее, дезинфицировать внешний вид портативного модуля упаковки и лотки с 70%этанола, протрите, и передать их в шкаф биобезопасности. Откройте пакет, и поместите модули в лоток Ориентировать их с резервуарами к задней части лотка. Pipette три миллилитров предварительно equilibrated, теплые средства массовой информации для каждого входного резервуара.Добавьте эндотелианную среду клеточной культуры к входу в резервуар нижнего канала и среду нейронной дифференциации к верхнему резервуару входного канала верхнего канала. Затем пипетки 300 микролитров предварительно equilibrated, теплые средства массовой информации для каждого резервуара розетки, непосредственно над каждым выходом порта. Поместите до шести портативных модулей на каждый лоток.Принесите лотки к инкубатору и сползите полностью в модуль культуры с ручкой лотка, обращенной наружу. Выберите и запустите главный цикл на модуле культуры. Закройте дверь инкубатора и позвольте модулю культуры проработать портативные модули примерно на одну минуту.Цикл грунтовки завершается, когда бар состояния читается готовым. Снимите лоток с модуля культуры и поднесите его в шкаф для биобезопасности. Осмотрите нижнюю часть каждого портативного модуля в кабинете биобезопасности, чтобы убедиться, что портативные модули были успешно загрунтована.Ищите наличие мелких капель во всех четырех портах. Если какой-либо портативный модуль не показывает капель, повторять простой цикл на этих модулях. Если какие-либо средства массовой информации капали на лоток, который чаще всего происходит в портах розетки, очистить лоток с 70% этанола.Далее, аккуратно мыть оба канала каждого чипа с теплой, equilibrated ячейки конкретных культур среды для удаления любых возможных пузырьков в канале, и место небольших капель средств массовой информации в верхней части каждого входного и выходного порта. Вставьте чипы с носителями в портативные модули и поместите до шести на каждый лоток. Вставьте лотки в модуль культуры.Запрограммировать соответствующие условия культуры чипа органа, такие как скорость потока и растяжение, на модуле культуры. Как только цикл регулирования завершен, что занимает около двух часов, начинаются запрограммированные условия. После этого культурный модуль начинает поступать в условиях культуры заданного органа.Иммуноцитохимия на чипе гемато-мозгового барьера на основе iPSC через семь дней после посева показывает, что сферы эквалайзера дифференцированы в смешанную популяцию нервных клеток в верхнем боковом канале мозга, включая бета-положительные астроциты S100, нестин-положительные нейронные клетки-предшественники, а также GFAP-положительные астроциты и бета III тубулин-положительные нейроны. IPSC-производные микрососудистые эндотелиальные клетки мозга, посеянные в нижнем боковом канале крови, выразили GLUT-1 и PECAM-1. Оценка проницаемости чипа гемового барьера показывает, что чип органа, посеянный с микрососудистыми эндотелиальными клетками мозга и сферами эквалайзера, имел жесткий барьер по сравнению с органными чипами, посеянными только с микрососудистыми эндотелиальными клетками мозга, полученными iPSC.Органные чипы, посеянные только с сферами эквалайзера, не отображал никаких барьерных свойств. От первоначальной обработки поверхности канала до среднего переключения каждый день, избегайте образования пузырьков в канале. На протяжении всего шага в протоколе, в котором реагент активации поверхности, внеклеточная матрица, или ячейка-содержащая среда должна быть вставлена через каналы, крайне важно тщательно проверить, что пузырь не найден.Анализ проницаемости может быть выполнен для оценки проницаемости человеческого мозга препаратов-кандидатов. Такой подход может служить для тестирования потенциальных терапевтических средств. Применение чипа BBB на основе iPSC позволяет изучить роль BBB в различных неврологических заболеваниях.В будущем такая платформа может быть полезна для прогностический, персонализированный приложений медицины.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Human Adipose Stem Cells through Dedifferentiation of Mature Adipocytes in Ceiling Cultures

Генерация жировой стволовых клеток через дедифференцировка зрелые адипоциты в потолочных культур

Mature adipocytes have been shown to reverse their phenotype into fibroblast-like cells in vitro through a technique called ceiling culture. Mature ...

Generation of Integration-free Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Hair-derived Keratinocytes

Генерация Интеграция-свободный человек индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, используя волос производный Кератиноциты

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using ...

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

Генерация генетически модифицированных культур Органотипической кожи Использование нежизнеспособных Human дермы

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

Генерация индуцированные плюрипотентные стволовые клетки от меланомы человека Опухоль-инфильтрации лимфоцитами

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Определено и масштабируемая Генерация гепатоцитов-подобных клеток из человеческих плюрипотентные стволовые клетки

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

Генерация IPSC, полученные из органоидов человеческого мозга Модели раннего развития нервной системы Расстройства

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin

Поколение и культивирование первичных человеческие кератиноциты от взрослых кожи

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. ...

Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids

Реальном времени измерения проницаемости эпителиальных барьер в человека кишечные Organoids

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted ...

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Анализ на кроветчебно-мозговой барьер целостности в Drosophila меланогастер

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous ...

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

Поколение многоклеточных органов эндометрия человека

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...