Name: generation of a human ipsc-based blood-brain barrier chip
Uploaded: 2020-03-02T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of a Human iPSC-Based Blood-Brain Barrier Chip at JoVE.com

Nos gustaría dar las gracias a la Dra. Soshana Svendsen por su edición crítica. Este trabajo fue apoyado por la beca 1621/18 de la Fundación De ciencia de Israel, el Ministerio de Ciencia y Tecnología (MOST), Israel 3-15647, la subvención del Instituto de Medicina Regenerativa de California ID DISC1-08800, la Fundación de la Familia Sherman, la concesión NIH-NINDS 1UG3NS105703, y la subvención de la Asociación de ALS 18-SI-389. AH fue financiado por la Fundación Wallenberg (número de subvención 2015.0178).

1. Generación de células progenitoras neuronales derivadas de iPSC (iNPC)
<ol><li>Producir EZ-esferas a partir de colonias iPSC como se describe a continuación y como se publicó anteriormente20,21,22.<ol>
<li>Cultivo de colonias iPSC para confluencia en 6 placas de pozores recubiertos con matriz de membrana de sótano (0,5 mg/placa) en mTESR1 u otros medios comerciales (ver Tabla de Materiales).</li>
		<li...

<ol>
	<li>Pardridge, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+endogenous+transporters+as+therapeutic+targets:+a+new+model+for+small+molecule+CNS+drug+discovery.">Blood-brain barrier endogenous transporters as therapeutic targets: a new model for small molecule CNS drug discovery.</a> Expert Opinion on Therapeutic Targets. 19 (8), 1059-1072 (2015).</li><li>Gastfriend, B. D., Palecek, S. P., Shusta, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+blood-brain+barrier:+beyond+the+endothelial+cells.">Modeling the blood-brain barrier: beyond the endothelial cells.</a> Current Opinion in Biomedical Engineering. 5, 6-12 (2018).</li><li>Jamieson, J. J., Linville, R. M., Ding, Y. Y., Gerecht, S., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+iPSC-derived+pericytes+on+barrier+function+of+iPSC-derived+brain+microvascular+endothelial+cells+in+2D+and+3D.">Role of iPSC-derived pericytes on barrier function of iPSC-derived brain microvascular endothelial cells in 2D and 3D.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 16 (1), 15 (2019).</li><li>El-Habashy, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+treatment+strategies+for+brain+tumors+and+metastases.">Novel treatment strategies for brain tumors and metastases.</a> Pharmaceutical Patent Analyst. 3 (3), 279-296 (2014).</li><li>Lim, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntington's+disease+iPSC-derived+brain+microvascular+endothelial+cells+reveal+WNT-mediated+angiogenic+and+blood-brain+barrier+deficits.">Huntington's disease iPSC-derived brain microvascular endothelial cells reveal WNT-mediated angiogenic and blood-brain barrier deficits.</a> Cell Reports. 19 (7), 1365-1377 (2017).</li><li>Dumitrescu, A. M., Liao, X. H., Weiss, R. E., Millen, K., Refetoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+thyroid+hormone+deprivation+and+excess+in+monocarboxylate+transporter+(mct)+8-deficient+mice.">Tissue-specific thyroid hormone deprivation and excess in monocarboxylate transporter (mct) 8-deficient mice.</a> Endocrinology. 147 (9), 4036-4043 (2006).</li><li>Spencer, J. I., Bell, J. S., DeLuca, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+pathology+in+multiple+sclerosis:+reframing+pathogenesis+around+the+blood-brain+barrier.">Vascular pathology in multiple sclerosis: reframing pathogenesis around the blood-brain barrier.</a> Journal of Neurology and Neurosurgical Psychiatry. 89 (1), 42-52 (2018).</li><li>Yamazaki, Y., Kanekiyo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+dysfunction+and+the+pathogenesis+of+Alzheimer's+disease.">Blood-brain barrier dysfunction and the pathogenesis of Alzheimer's disease.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (9), 1965 (2017).</li><li>Ben-Zvi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mfsd2a+is+critical+for+the+formation+and+function+of+the+blood-brain+barrier.">Mfsd2a is critical for the formation and function of the blood-brain barrier.</a> Nature. 509 (7501), 507 (2014).</li><li>Heng, M. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BBB+on+chip:+microfluidic+platform+to+mechanically+and+biochemically+modulate+blood-brain+barrier+function.">BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function.</a> Biomedical Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).</li><li>Prabhakarpandian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+tumor+networks+for+screening+drug+delivery+systems.">Synthetic tumor networks for screening drug delivery systems.</a> Journal of controlled release. 201, 49-55 (2015).</li><li>Delsing, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barrier+properties+and+transcriptome+expression+in+human+iPSC-derived+models+of+the+blood-brain+barrier.">Barrier properties and transcriptome expression in human iPSC-derived models of the blood-brain barrier.</a> Stem Cells. 36 (12), 1816-1827 (2018).</li><li>Park, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-enhanced+Blood-Brain+Barrier+Chip+recapitulates+human+barrier+function+and+shuttling+of+drugs+and+antibodies.">Hypoxia-enhanced Blood-Brain Barrier Chip recapitulates human barrier function and shuttling of drugs and antibodies.</a> Nature Communications. 10 (1), 2621 (2019).</li><li>Vatine, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPSC-Derived+Blood-Brain+Barrier+Chips+Enable+Disease+Modeling+and+Personalized+Medicine+Applications.">Human iPSC-Derived Blood-Brain Barrier Chips Enable Disease Modeling and Personalized Medicine Applications.</a> Cell Stem Cell. 24 (6), 995-1005 (2019).</li><li>Henry, O. Y. F., Villenave, R., Cronce, M. J., Leineweber, W. D., Benz, M. A., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organs-on-chips+with+integrated+electrodes+for+trans-epithelial+electrical+resistance+(TEER)+measurements+of+human+epithelial+barrier+function.">Organs-on-chips with integrated electrodes for trans-epithelial electrical resistance (TEER) measurements of human epithelial barrier function.</a> Lab on a Chip. 17 (13), 2264-2271 (2017).</li><li>Sances, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPSC-derived+endothelial+cells+and+microengineered+organ+chip+enhance+neuronal+development.">Human iPSC-derived endothelial cells and microengineered organ chip enhance neuronal development.</a> Stem Cell Reports. 10 (4), 1222-1236 (2018).</li><li>Workman, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+utilization+of+induced+pluripotent+stem+cell&#8211;derived+human+intestinal+organoids+using+microengineered+chips.">Enhanced utilization of induced pluripotent stem cell&#8211;derived human intestinal organoids using microengineered chips.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 669-677 (2018).</li><li>Ebert, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EZ+spheres:+a+stable+and+expandable+culture+system+for+the+generation+of+pre-rosette+multipotent+stem+cells+from+human+ESCs+and+iPSCs.">EZ spheres: a stable and expandable culture system for the generation of pre-rosette multipotent stem cells from human ESCs and iPSCs.</a> Stem Cell Research. 10 (3), 417-427 (2013).</li><li>Shelley, B. C., Gowing, G., Svendsen, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cGMP-applicable+expansion+method+for+aggregates+of+human+neural+stem+and+progenitor+cells+derived+from+pluripotent+stem+cells+or+fetal+brain+tissue.">A cGMP-applicable expansion method for aggregates of human neural stem and progenitor cells derived from pluripotent stem cells or fetal brain tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), e51219 (2014).</li><li>Vatine, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+psychomotor+retardation+using+iPSCs+from+MCT8-deficient+patients+indicates+a+prominent+role+for+the+blood-brain+barrier.">Modeling psychomotor retardation using iPSCs from MCT8-deficient patients indicates a prominent role for the blood-brain barrier.</a> Cell Stem Cell. 20 (6), 831-843 (2017).</li><li>Svendsen, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+the+rapid+and+long+term+growth+of+human+neural+precursor+cells.">A new method for the rapid and long term growth of human neural precursor cells.</a> Journal of Neuroscience Methods. 85 (2), 141-152 (1998).</li><li>Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+retinoic+acid-enhanced,+multicellular+human+blood-brain+barrier+model+derived+from+stem+cell+sources.">A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources.</a> Scientific Reports. 4, 4160 (2014).</li><li>Canfield, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+isogenic+blood-brain+barrier+model+comprising+brain+endothelial+cells,+astrocytes,+and+neurons+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">An isogenic blood-brain barrier model comprising brain endothelial cells, astrocytes, and neurons derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Journal of Neurochemistry. 140 (6), 874-888 (2017).</li><li>Jamieson, J. J., Gerecht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chipping+Away+at+Blood-Brain-Barrier+Modeling.">Chipping Away at Blood-Brain-Barrier Modeling.</a> Cell stem cell. 24 (6), 831-832 (2019).</li><li>Faal, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Mesoderm+and+Neural+Crest-Derived+Pericytes+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells+to+Study+Blood-Brain+Barrier+Interactions.">Induction of Mesoderm and Neural Crest-Derived Pericytes from Human Pluripotent Stem Cells to Study Blood-Brain Barrier Interactions.</a> Stem Cell Reports. 12 (3), 451-460 (2019).</li><li>Lippmann, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+blood-brain+barrier+endothelial+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 30 (8), 783 (2012).</li><li>Qian, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+blood-brain+barrier+endothelial+cells.">Directed differentiation of human pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells.</a> Science Advances. 3 (11), 1701679 (2017).</li><li>Neal, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified,+Fully+Defined+Differentiation+Scheme+for+Producing+Blood-Brain+Barrier+Endothelial+Cells+from+Human+iPSCs.">A Simplified, Fully Defined Differentiation Scheme for Producing Blood-Brain Barrier Endothelial Cells from Human iPSCs.</a> Stem Cell Reports. 12 (6), 1380-1388 (2019).</li><li>Wevers, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+perfused+human+blood-brain+barrier+on-a-chip+for+high-throughput+assessment+of+barrier+function+and+antibody+transport.">A perfused human blood-brain barrier on-a-chip for high-throughput assessment of barrier function and antibody transport.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 15 (1), 23 (2018).</li><li>Huh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabrication+of+human+organs-on-chips.">Microfabrication of human organs-on-chips.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2135 (2013).</li><li>Huh, D., Matthews, B. D., Mammoto, A., Montoya-Zavala, M., Hsin, H. Y., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+organ-level+lung+functions+on+a+chip.">Reconstituting organ-level lung functions on a chip.</a> Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).</li></ol>

La combinación de la tecnología de órgano en chip y las células derivadas de iPSC en la NVU es prometedora para el modelado preciso del BBB humano. Aquí, proporcionamos un protocolo detallado para la aplicación simple y robusta del chip BBB16basado recientemente en iPSC. En la Figura 3se muestra una descripción general y una sincronización del paradigma de sembración. Para obtener y mantener funciones de barrera adecuadas para el modelado BBB, es fundamental ...

El BBB es una barrera altamente selectiva que separa el SNC de la sangre circulante. Protege las funciones cerebrales críticas de sustancias, factores y xenobióticos potencialmente disruptivos, al tiempo que permite la afluencia de nutrientes y otros metabolitos necesarios para mantener la homeostasis cerebral1. El BBB es un NVU multicelular en el que los procesos pericitados, los pies de los pies finales de la astrocitos y los neuronales contactan directamente con las células endoteliales microvasculares cerebrales (BMEC). Estas interacciones permiten a los BMEC formar propiedades de barrera especializadas que son soportadas por cruces apretados y adheridos2,3. La formación de esta barrera limita el paso paracelular de moléculas, pero contiene transportadores polarizados para transportar activamente moléculas al SNC o de vuelta a la sangre1. Debido a estas propiedades únicas de barrera, el BBB constituye un obstáculo importante para la entrega de biofarmacéuticos en el cerebro, y se estima que menos del 5% de las moléculas pequeñas aprobadas por la FDA pueden llegar al SNC4.
Los modelos animales se han utilizado ampliamente para estudiar la penetración bBB y los mecanismos moleculares involucrados en el desarrollo de BBB5. Mientras que los modelos animales representan fielmente el complejo entorno multicelular in vivo, las diferencias en la expresión y la actividad de los transportadores BBB, así como la especificidad del sustrato entre especies a menudo impiden la extrapolación precisa de los datos de los animales a los seres humanos6. Por lo tanto, los modelos basados en humanos son críticos para estudiar el BBB humano y para su uso en el desarrollo de fármacos diseñados para atacar el SNC. Esta necesidad se hace aún más evidente con el creciente dominio de los medicamentos biológicos específicos para el ser humano en el campo del desarrollo farmacéutico. La acumulación de evidencia sugiere que un BBB comprometido está asociado con una serie de trastornos graves del SNC, incluyendo tumores cerebrales y enfermedades neurológicas7,8,9. Los modelos humanos que reflejan fielmente estas enfermedades tienen el potencial de identificar dos vías novedosas que podrían ser dirigidas al desarrollo de fármacos y 2) predecir la penetración del SNC, reduciendo así el tiempo y los recursos en los estudios preclínicos y posiblemente disminuyendo la tasa de fracaso en los ensayos clínicos.
Los modelos in vitro se han implementado ampliamente para estudiar las interacciones entre los BMEC y otras células de la NVU y realizar pantallas para posibles fármacos permeables a BBB10. Para recrear aspectos clave del BBB humano, los modelos in vitro deben mostrar propiedades fisiológicamente relevantes (es decir, baja permeabilidad paracelular y resistencia eléctrica transendotelial fisiológicamente relevante [TEER] a través de la monocapa endotelial). Además, el perfil molecular de un sistema in vitro debe incluir la expresión de sistemas de transporte funcional representativos. Típicamente, los modelos in vitro se componen de células endoteliales que se cultivan co-cultivo en una membrana semipermeable con combinaciones de otras células NVU para mejorar las propiedades BBB11. Este enfoque permite una evaluación simple y relativamente rápida de la funcionalidad de barrera y la permeabilidad de las moléculas. Estos modelos BBB basados en células se pueden establecer con fuentes celulares animales o humanas, incluyendo células aisladas de escisiones quirúrgicas o líneas BMEC inmortalizadas.
Recientemente, se introdujeron protocolos para diferenciar células pluripotentes humanas en BMECs como una fuente atractiva para los modelos BBB humanos in vitro12,13. Los BMEC derivados de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) son altamente escalables, demuestran características morfológicas y funcionales cruciales del BBB humano y llevan la genética del paciente. En el cultivo, los iBMEC forman una monocapa que expresa marcadores de unión apretados y muestra complejos de unión estrecha in vivo-como. Estas células también expresan marcadores BBB, incluyendo el transportador de glucosa BBB, transportador de glucosa 1 (GLUT1). Es importante destacar, y a diferencia de otras fuentes celulares alternativas para los MCC humanos, los iBMEC adquieren propiedades de barrera con valores tan altos como los medidos in vivo14,polarizan a lo largo del eje basolateral y expresan bombas de eflujo funcional. Además, el uso de iPSCs de diversas asignaturas tanto 1) acoge con beneplácito la oportunidad de probar aspectos de la BBB de manera personalizada y 2) proporciona una fuente flexible para generar tipos de células adicionales de la NVU. La generación de estas células a partir de una fuente celular isogénica para crear chips BBB personalizados también ayudaría a comprender las diferencias interindividuales en las respuestas a los medicamentos, que es una causa importante de resistencia o respuesta comprometida al tratamiento observado en estudios clínicos.
El uso de iBMECs como monocapas en un plato o en una plaquita transwell semi permeable representa un enfoque potente para el modelado BBB. Estos sistemas tienden a ser robustos, reproducibles y rentables. Además, los análisis funcionales como el TEER y la permeabilidad son relativamente fáciles de realizar. Sin embargo, los sistemas bidimensionales (2D) no recapitulan la naturaleza 3D del tejido in vivo, y carecen de las fuerzas fisiológicas de tensión de cizallamiento proporcionadas por la sangre circulante y las células sanguíneas. Esto limita la capacidad del endotelio vascular en estos modelos para desarrollar y mantener propiedades y funciones intrínsecas de BBB.
Los sistemas microingenieros forrados por células vivas se han implementado para modelar diversas funcionalidades de órganos en un concepto llamado órgano en chip. Al recrear arquitectura multicelular in vivo-como, interfaces tejido-tejido, microambientes fisicoquímicos y perfusión vascular, estas plataformas microingeniería generan niveles de funcionalidad de tejido y órgano sin ser posible con sistemas de cultivo 2D convencionales. También permiten una alta resolución, imágenes en tiempo real y análisis de perfiles bioquímicos, genéticos y metabólicos similares a las células vivas en el contexto del tejido in vivo y los órganos. Sin embargo, un desafío particular del órgano en chip es que el diseño, la fabricación y la aplicación de estos chips microingenieros requieren experiencia especializada en ingeniería que generalmente carece de laboratorios académicos orientados biológicamente.
Recientemente hemos combinado las tecnologías iPSC y organ-on-chip para generar un chip BBB personalizado modelo15,16. Con el fin de superar los desafíos tecnológicos descritos, el Chip-S1 disponible comercialmente se utiliza junto con el módulo de cultivo, un instrumento diseñado para automatizar el mantenimiento de los chips de una manera simple y robusta (Emulate Inc.). El chip BBB recrea interacciones entre células neuronales y endoteliales y logra valores TEER fisiológicamente relevantes, que se miden mediante chips de órgano hechos a medida con electrodos de oro integrados17. Además, el chip BBB muestra baja permeabilidad paracelular, responde a señales inflamatorias a nivel de órganos, expresa bombas de eflujo activo y exhibe transporte predictivo de biomarcadores solubles y biofarmacéuticos. En particular, los chips BBB generados a partir de varios individuos capturan las diferencias funcionales esperadas entre individuos sanos y pacientes con enfermedades neurológicas15.
El protocolo detallado a continuación describe un método confiable, eficiente y reproducible para la generación de chips BBB basados en iPSC humanos en condiciones de flujo dinámico. Se proporciona orientación sobre el tipo de ensayos y análisis de punto final que se pueden realizar directamente en el chip BBB o a partir de efluentes de muestreo. Por lo tanto, el protocolo demuestra el espectro de técnicas que se pueden aplicar para evaluar las propiedades y respuestas biológicas y funcionales en un modelo relevante para el ser humano.
Aquí se proporciona una breve descripción del chip BBB basado en iPSC. Los iPSC humanos se diferencian y propagan inicialmente en matraces de cultivo de tejidos como agregados flotantes libres de progenitores neuronales, llamados esferas EZ. El canal superior del Chip-S116,18,19 está sembrado con esferras EZ disociadas que forman el "lado cerebral" del chip, ya que las células se diferencian durante 7 días en un cultivo mixto de células progenitoras neuronales (iNCAP), iAstrocytes e iNeurons. Los iPSC humanos también se diferencian en placas de cultivo de tejidos en iBMECs. El canal inferior del chip se sembra con iBMECs para formar el "lado de la sangre" a medida que se desarrollan para formar un tubo endotelial (Figura 1). La membrana recubierta de matriz extracelular porosa (ECM) que separa los canales superior e inferior 1) permite la formación de interacciones de célula a célula entre los canales y 2) permite al usuario ejecutar ensayos de permeabilidad y células de imagen en cualquiera de los canales utilizando un microscopio de luz convencional.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SCR005</td>
			<td>Dissociation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bfgf</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chip-S1</td>
			<td>Emulate Inc</td>
			<td>Chip-S1</td>
			<td>Organ-Chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D3571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran-FITC</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>46944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM: F12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31330038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emulate Reagent 1 (ER-1)</td>
			<td>Emulate Inc</td>
			<td>ER-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emulate Reagent 2 (ER-2)</td>
			<td>Emulate Inc</td>
			<td>ER-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP)</td>
			<td>Dako</td>
			<td>Z0334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GLUT-1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MA5-11315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050038</td>
			<td>Glutamine supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hBDNF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOSR</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>Basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>StemCell Technologies, Inc.</td>
			<td>85851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA</td>
			<td>Biological industries</td>
			<td>01-340-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nestin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NutriStem</td>
			<td>Biological industries</td>
			<td>05-100-1A</td>
			<td>Alternate media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PECAM-1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platelet-poor plasma-derived bovine serum (PPP)</td>
			<td>Biomedical Technologies</td>
			<td>J64483AB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid (RA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S100&#946;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZO-1 Monoclonal Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>33-9100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;III-tubulin (Tuj1&#945;)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>31350010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of a human ipsc-based blood-brain barrier chip

La barrera hematoencefálica (BBB) está formada por unidades neurovasculares (NFI) que protegen el sistema nervioso central (SNC) de una serie de factores que se encuentran en la sangre que pueden alterar la delicada función cerebral. Como tal, el BBB es un obstáculo importante para la entrega de terapias al SNC. La acumulación de evidencia sugiere que el BBB desempeña un papel clave en la aparición y progresión de las enfermedades neurológicas. Por lo tanto, existe una enorme necesidad de un modelo BBB que pueda predecir la penetración de fármacos dirigidos al SNC, así como dilucidar el papel de la BBB en la salud y la enfermedad.
Recientemente hemos combinado tecnologías de células madre pluripotentes (iPSC) de órgano en chip para generar un chip BBB totalmente personalizado para los seres humanos. Esta novedosa plataforma muestra propiedades celulares, moleculares y fisiológicas que son adecuadas para la predicción del transporte de fármacos y moléculas a través de la BBB humana. Además, utilizando chips BBB específicos del paciente, hemos generado modelos de enfermedad neurológica y demostrado el potencial para aplicaciones de medicina predictiva personalizada. Aquí se proporciona un protocolo detallado que demuestra cómo generar chips BBB derivados de iPSC, comenzando con la diferenciación de las células endoteliales microvasculares cerebrales derivadas de iPSC (iBMECs) y dando como resultado cultivos neuronales mixtos que contienen progenitores neuronales, neuronas diferenciadas y astrocitos. También se describe un procedimiento para la sembración de células en el chip del órgano y el cultivo de los chips BBB bajo flujo laminar controlado. Por último, se proporcionan descripciones detalladas de los análisis de chip BBB, incluidos los ensayos de permeabilidad paracelulares para evaluar la permeabilidad de fármacos y moléculas, así como métodos inmunocitoquímicos para determinar la composición de los tipos de células dentro del chip.

La Figura 6A,B,C representa un chip BBB sembrado con esferas EZ en el canal superior del "lado del cerebro" y iBMECs en el canal inferior del "lado de la sangre". los iBMECs fueron cabezas de cabeza primero y se les permitió fijarse durante la noche, después de lo cual las esferas EZ fueron sembradas. Las fichas se cultivaron en condiciones estáticas con reemplazo diario de medios durante siete días. El chip BBB se fijó entonces usando 4% PFA en RT durante 10 min y lava...

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Generation of a Human iPSC-Based Blood-Brain Barrier Chip

La barrera hematoencefálica (BBB) es una unidad neurovascular multicelular que regula estrechamente la homeostasis cerebral. Mediante la combinación de iPSC shumanos y tecnologías de órgano en chip, hemos generado un chip BBB personalizado, adecuado para el modelado de enfermedades y predicciones de penetrabilidad de fármacos del SNC. Se describe un protocolo detallado para la generación y el funcionamiento del chip BBB.

Generación de un chip de barrera hematoencefálica basada en iPSC humana

The blood brain barrier (BBB) is formed by neurovascular units (NVUs) that shield the central nervous system (CNS) from a range of factors found in the ...

Este protocolo demostrará cómo se pueden sembrar células madre pluripotentes inducidas diferenciadas en un órgano en chip para generar una barrera hematoencefálica totalmente humana, personalizada y microfluídica, que se puede utilizar para predecir la permeabilidad de los fármacos del sistema nervioso central y para estudiar trastornos neurológicos. Usando un órgano en chip disponible comercialmente, demostraremos cómo cualquier laboratorio biológicamente orientado puede utilizar esta tecnología para generar una barrera hematoencefálica microfluída personalizada. La acumulación de evidencias sugiere que el BBB desempeña un papel en la enfermedad neurológica mediante la generación de chips BBB personalizados derivados de iPSC de individuos con una enfermedad neurológica genética.Será posible estudiar el papel del BBB en la salud y la enfermedad. Este método también puede ser útil para las empresas farmacéuticas, que pueden utilizar esta plataforma humana BBB para detectar la penetrabilidad de los fármacos neurológicos candidatos en el cerebro humano. La aplicación de tecnologías de órgano en chip generalmente requiere habilidades de ingeniería especializadas.El uso de plataformas disponibles comercialmente permite la aplicación de esta tecnología en cualquier laboratorio de orientación biológica. Para empezar, lleve el plato que contiene las virutas preparadas al gabinete de bioseguridad. Con una pipeta P200, lave suavemente ambos canales añadiendo 200 microlitros de medio de diferenciación neuronal en la entrada y tirando del líquido de la salida.Evitando el contacto con los puertos, aspirar cuidadosamente el exceso de gotas de medios de la superficie del chip. Agitar suavemente la suspensión celular para garantizar una suspensión celular homogénea. Para sembrar las células progenitoras neurales derivadas de iPSC en el canal superior para generar el lado cerebral, agregue una punta P200 que contenga de 30 a 100 microlitros de suspensión celular a la concentración de una por 10 a las seis células por mililitro a la entrada del canal superior, y libere suavemente la punta de la pipeta.Tome una pipeta P200 vacía, presione el émbolo, inserte en la salida del canal superior y tire cuidadosamente de la suspensión de una sola celda a través de la punta. Transfiera el chip al microscopio para comprobar la densidad de siembra y la distribución homogénea de las células dentro del canal superior. Después de confirmar la densidad celular con una cobertura del 20%, coloque inmediatamente las virutas en la incubadora durante dos horas a 37 grados centígrados.Después de eso, lave las células que no se adhieren añadiendo un medio de diferenciación neuronal fresco en la entrada y tirando del líquido a través de la pipeta de la salida. Mantener las células en condiciones estáticas a 37 grados Celsius con un reemplazo medio de diferenciación neuronal diaria. Después de que los iNPC se hayan adherido o en un día posterior a la siembra, lleve el plato que contiene las virutas preparadas al gabinete de bioseguridad.Lave suavemente el canal inferior con 200 microlitros de medio celular endotelial. Evitando el contacto con los puertos, aspirar cuidadosamente gotas de exceso de medio celular endotelial de la superficie del chip, asegurándose de dejar el medio en ambos canales. Agitar suavemente la suspensión celular para garantizar una suspensión celular homogénea.Con una pipeta P200, extraiga de 30 a 100 microlitros de la suspensión de células endoteliales microvasculares cerebrales derivadas del iPSC a una concentración de 14 a 20 veces 10 a las seis células por mililitro, y coloque la punta en la entrada del canal inferior. El paso más crítico para lograr las propiedades de barrera funcional es la siembra de células endoteliales microvasculares cerebrales. Es crucial sembrar células a la densidad adecuada para evitar la formación de burbujas para verificar la distribución homogénea dentro del chip del órgano.Presione el émbolo en una pipeta P200 con una punta vacía, insértelo en la salida del canal inferior y suelte lentamente el émbolo de la pipeta para tirar cuidadosamente de la suspensión de una sola célula a través del canal inferior. Aspirar el exceso de suspensión celular de la superficie de la viruta. Evite el contacto directo con los puertos de entrada y salida para asegurarse de que no se aspira ninguna suspensión celular fuera de los canales.Transfiera el chip al microscopio para comprobar la densidad de siembra. El canal inferior se llena de celdas sin huecos observables en el medio. Después de confirmar la densidad celular correcta, sembrar las células en los chips restantes.Para unir las células a la membrana porosa, que se encuentra en la parte superior del canal inferior, invierta cada chip y déjelas reposar en una base de viruta. Coloque un pequeño reservorio que contenga DPBS estéril dentro de la placa de 150 milímetros para proporcionar humedad a las células. Incubar las virutas a 37 grados centígrados durante aproximadamente tres horas o hasta que las células del canal inferior se hayan adherido.Una vez que las células endoteliales microvasculares cerebrales derivadas del iPSC se hayan unido, voltee las virutas de nuevo a una posición vertical para permitir la fijación de la célula a la parte inferior del canal inferior. 48 horas después de la siembra de las células endoteliales microvasculares cerebrales derivadas de iPSC, equilibrar la temperatura del medio celular endotelial calentando en un baño de agua de 37 grados Celsius durante una hora. A continuación, desgasar el medio por incubación bajo un sistema de filtración impulsado por vacío durante 15 minutos.A continuación, desinfecte el exterior del embalaje del módulo portátil y las bandejas con 70% de etanol, limpie y transfieralos al gabinete de bioseguridad. Abra el paquete y coloque los módulos en la bandeja Orient ellos con los depósitos hacia la parte posterior de la bandeja. Pipetear tres mililitros de los medios preequilibrados y calientes a cada depósito de entrada.Agregue el medio de cultivo celular endotelial al depósito de entrada del canal inferior y al medio de diferenciación neuronal al depósito de entrada del canal superior del canal superior. A continuación, pipetear 300 microlitros de los medios preequilibrados y calientes a cada depósito de salida, directamente sobre cada puerto de salida. Coloque hasta seis módulos portátiles en cada bandeja.Lleve las bandejas a la incubadora y deslícela completamente en el módulo de cultivo con la manija de la bandeja hacia afuera. Seleccione y ejecute el ciclo principal en el módulo de referencia cultural. Cierre la puerta de la incubadora y permita que el módulo de cultivo se deba a los módulos portátiles durante aproximadamente un minuto.El ciclo de cebado se completa cuando la barra de estado está lista. Retire la bandeja del módulo de cultivo y lléela al gabinete de bioseguridad. Inspeccione la parte inferior de cada módulo portátil en el gabinete de bioseguridad para verificar que los módulos portátiles se prepararon correctamente.Busque la presencia de pequeñas gotas en los cuatro puertos. Si cualquier módulo portátil no muestra gotas, vuelva a ejecutar el ciclo primo en esos módulos. Si algún medio goteaba sobre la bandeja, que ocurre con más frecuencia por los puertos de salida, limpie la bandeja con 70% de etanol.A continuación, lave suavemente ambos canales de cada chip con un medio de cultivo cálido y equilibrado específico de la célula para eliminar las posibles burbujas en el canal, y coloque pequeñas gotas de medios en la parte superior de cada puerto de entrada y salida. Inserte las virutas con soportes en los módulos portátiles y coloque hasta seis en cada bandeja. Inserte las bandejas en el módulo de referencia cultural.Programe las condiciones apropiadas de cultivo de chips de órgano, como el caudal y el estiramiento, en el módulo de cultivo. Tan pronto como se completa el ciclo de regulación, que tarda aproximadamente dos horas, comienzan las condiciones programadas. Después de eso, el módulo de cultivo comienza a fluir en las condiciones de cultivo de chip de órgano preestablecidas.La inmunocitoquímica en el chip de barrera hematoencefálica basado en iPSC siete días después de la siembra muestra las esferas EZ diferenciadas en una población mixta de células neuronales en el canal del lado del cerebro superior, incluyendo astrocitos beta-positivos S100, células progenitoras neuronales nestin positivas, así como astrocitos positivos GFAP, y neuronas beta III con exiullo positivo. Células endoteliales microvasculares cerebrales derivadas de IPSC sembradas en el canal lateral de la sangre inferior expresadas GLUT-1 y PECAM-1. La evaluación de la permeabilidad del chip de barrera hematoencefálica demuestra que el chip de órgano sembrado con células endoteliales microvasculares cerebrales derivadas de iPSC y esferas EZ tenía una barrera ajustada en comparación con los chips de órganos sembrados con células endoteliales microvasculares cerebrales derivadas de iPSC solamente.Los chips de órganos sembrados con esferas EZ por sí solos no mostraban ninguna propiedad de barrera. Desde el tratamiento superficial inicial del canal hasta el cambio de medio cada día, evite la formación de burbujas en el canal. A lo largo del paso en el protocolo en el que el reactivo de activación de la superficie, la matriz extracelular o el medio que contiene celdas deben insertarse a través de los canales, es extremadamente importante verificar cuidadosamente que no se encuentre ninguna burbuja.El ensayo de permeabilidad se puede realizar para evaluar la penetrabilidad cerebral humana de los fármacos candidatos. Este enfoque puede servir para probar posibles terapias. La aplicación del chip BBB basado en iPSC permite estudiar el papel del BBB en diversas enfermedades neurológicas.En el futuro, dicha plataforma puede ser útil para aplicaciones de medicina predictiva y personalizada.

generation-of-a-human-ipsc-based-blood-brain-barrier-chip

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Human Adipose Stem Cells through Dedifferentiation of Mature Adipocytes in Ceiling Cultures

Mature adipocytes have been shown to reverse their phenotype into fibroblast-like cells in vitro through a technique called ceiling culture. Mature adipocytes can also be isolated from fresh adipose tissue for depot-specific characterization of their function and metabolic properties. Here, we describe a well-established protocol to isolate mature adipocytes from adipose tissues using collagenase digestion, and subsequent steps to perform ceiling cultures. Briefly, adipose tissues are incubated in a Krebs-Ringer-Henseleit buffer containing collagenase to disrupt tissue matrix. Floating mature adipocytes are collected on the top surface of the buffer. Mature cells are plated in a T25-flask completely filled with media and incubated upside down for a week. An alternative 6-well plate culture approach allows the characterization of adipocytes undergoing dedifferentiation. Adipocyte morphology drastically changes over time of culture. Immunofluorescence can be easily performed on slides cultivated in 6-well plates as demonstrated by FABP4 immunofluorescence staining. FABP4 protein is present in mature adipocytes but down-regulated through dedifferentiation of fat cells. Mature adipocyte dedifferentiation may represent a new avenue for cell therapy and tissue engineering.

Mature adipocytes may represent an abundant source of stem cells through dedifferentiation, which leads to a homogenous population of fibroblast-like cells. Collagenase digestion is used to isolate mature adipocytes from human fat. The goal of our protocol is to obtain multipotent, dedifferentiated fat cells from human mature adipocytes.

Generación de células madre adiposas Humano a través Desdiferenciación de adipocitos maduros en culturas de techo

Mature adipocytes have been shown to reverse their phenotype into fibroblast-like cells in vitro through a technique called ceiling culture. Mature ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function and physiology of their in vivo tissue counterparts. This is exemplified by organotypic skin cultures which faithfully recapitulates the epidermal differentiation and stratification program. Primary human epidermal keratinocytes are genetically manipulable through retroviruses where genes can be easily overexpressed or knocked down. These genetically modified keratinocytes can then be used to regenerate human epidermis in organotypic skin cultures providing a powerful model to study genetic pathways impacting epidermal growth, differentiation, and disease progression. The protocols presented here describe methods to prepare devitalized human dermis as well as to genetically manipulate primary human keratinocytes in order to generate organotypic skin cultures. Regenerated human skin can be used in downstream applications such as gene expression profiling, immunostaining, and chromatin immunoprecipitations followed by high throughput sequencing. Thus, generation of these genetically modified organotypic skin cultures will allow the determination of genes that are critical for maintaining skin homeostasis.

The goal of this paper is to provide a comprehensive and detailed protocol on how to generate genetically modified human organotypic skin from epidermal keratinocytes and devitalized human dermis.

Generación de Genéticamente Modificados cultivos de piel organotípicos Uso Desvitalizada Dermis Humana

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets of patients with metastatic melanoma. Major obstacles of this approach are the reduced viability of transferred T cells, caused by telomere shortening, and the limited number of TILs obtained from patients. Less-differentiated T cells with long telomeres would be an ideal T cell subset for adoptive T cell therapy;however, generating large numbers of these less-differentiated T cells is problematic. This limitation of adoptive T cell therapy can be theoretically overcome by using induced pluripotent stem cells (iPSCs) that self-renew, maintain pluripotency, have elongated telomeres, and provide an unlimited source of autologous T cells for immunotherapy. Here, we present a protocol to generate iPSCs using Sendai virus vectors for the transduction of reprogramming factors into TILs. This protocol generates fully reprogrammed, vector-free clones. These TIL-derived iPSCs might be able to generate less-differentiated patient- and tumor-specific T cells for adoptive T cell therapy.

The goal of this protocol is to show the protocol for reprogramming melanoma tumor-infiltrating lymphocytes into induced pluripotent stem cells.

Generación de células madre pluripotentes inducidas a partir de melanoma humano linfocitos infiltrantes de tumores,

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the human body. The differentiation of hPSCs to human hepatocyte-like cells (HLCs) has been extensively studied, and efficient differentiation protocols have been established. The combination of extracellular matrix and biological stimuli, including growth factors, cytokines, and small molecules, have made it possible to generate HLCs that resemble primary human hepatocytes. However, the majority of procedures still employ undefined components, giving rise to batch-to-batch variation. This serves as a significant barrier to the application of the technology. To tackle this issue, we developed a defined system for hepatocyte differentiation using human recombinant laminins as extracellular matrices in combination with a serum-free differentiation process. Highly efficient hepatocyte specification was achieved, with demonstrated improvements in both HLC function and phenotype. Importantly, this system is easy to scale up using research and GMP-grade hPSC lines&#160;promising advances in cell-based modelling and therapies.

The method presented here describes a scalable and good manufacturing practice (GMP)-ready differentiation system to generate human hepatocyte-like cells from pluripotent stem cells. It serves as a cost-effective and standardized system to generate human hepatocyte-like cells for basic and applied human liver research.

Definido y escalable Generación de células hepatocitos como las de las células madre pluripotentes

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that limits the translation of basic brain research into clinical application. While induced pluripotent stem cells (iPSCs) have replaced the ethically questionable human embryonic stem cells, iPSC-based neuronal differentiation studies remain descriptive at the cellular level but fail to adequately provide the details that could be derived from a complex, 3D human brain tissue. 
This gap is now filled through the application of iPSC-derived, 3D brain organoids, "Brains in a dish," that model many features of complex human brain development. Here, a method for generating iPSC-derived, 3D brain organoids is described. The organoids can help with modeling autosomal recessive primary microcephaly (MCPH), a rare human neurodevelopmental disorder. A widely accepted explanation for the brain malformation in MCPH is a depletion of the neural stem cell pool during the early stages of human brain development, a developmental defect that is difficult to recreate or prove in vitro. 
To study MCPH, we generated iPSCs from patient-derived fibroblasts carrying a mutation in the centrosomal protein CPAP. By analyzing the ventricular zone of microcephaly 3D brain organoids, we showed the premature differentiation of neural progenitors. These 3D brain organoids are a powerful in vitro system that will be instrumental in modeling congenital brain disorders induced by neurotoxic chemicals, neurotrophic viral infections, or inherited genetic mutations.

Modeling human brain development has been hindered due to the unprecedented complexity of neural epithelial tissue. Here, a method for the robust generation of brain organoids to delineate early events of human brain development and to model microcephaly in vitro is described.

Generación de derivados de IPSC organoides cerebro humano para modelar los trastornos del neurodesarrollo temprano

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. In addition, keratinocytes play an essential role in the initiation, maintenance, and regulation of epidermal immune responses by being part of the innate immune system responding to antigenic stimuli in a fast, nonspecific manner. Here, we describe a protocol for isolation of primary human keratinocytes from adult skin, and demonstrate that these cells respond to calcium-induced terminal differentiation, as measured by an increased expression of the differentiation marker involucrin. In addition, we show that the isolated keratinocytes are responsive to IL-1&#946;-induced activation of intracellular signaling pathways as measured by the activation of the p38 MAPK pathway. Taken together, we describe a method for isolation and culturing of primary human keratinocytes from adult skin. Because the keratinocytes are the predominant cell type in the epidermis, this method is useful to study molecular mechanisms in cutaneous biology in vitro.

The human skin acts as a first line of defense against the external environment. We present a method for isolating primary human keratinocytes from adult skin. These isolated keratinocytes are useful in numerous experimental setups, and are a highly suitable model for studying molecular mechanisms in cutaneous biology in vitro.

Generación y cultivo de Keratinocytes humanos primarios de piel adulto

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. ...

Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted in sophisticated in vitro models of the intestinal mucosa. Leveraging these emerging model systems will require adaptation of tools and techniques developed for 2D culture systems and animals. Here, we describe a technique for measuring epithelial barrier permeability in human intestinal organoids in real-time. This is accomplished by microinjection of fluorescently-labeled dextran and imaging on an inverted microscope fitted with epifluorescent filters. Real-time measurement of the barrier permeability in intestinal organoids facilitates the generation of high-resolution temporal data in human intestinal epithelial tissue, although this technique can also be applied to fixed timepoint imaging approaches. This protocol is readily adaptable for the measurement of epithelial barrier permeability following exposure to pharmacologic agents, bacterial products or toxins, or live microorganisms. With minor modifications, this protocol can also serve as a general primer on microinjection of intestinal organoids and users may choose to supplement this protocol with additional or alternative downstream applications following microinjection.

This protocol describes the measurement of epithelial barrier permeability in real-time following pharmacologic treatment in human intestinal organoids using fluorescent microscopy and live cell microscopy.

Medición en tiempo real de la permeabilidad de la barrera epitelial en organoides Intestinal humano

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give rise to multiple cell types, including the myotome (MYO), sclerotome (SCL), dermatome (D), and syndetome (SYN), which in turn develop into skeletal muscle, axial skeleton, dorsal dermis, and axial tendon/ligament, respectively. Therefore, the generation of SMs and their derivatives from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is critical to obtain pluripotent stem cells (PSCs) for application in regenerative medicine and for disease research in the field of orthopedic surgery. Although the induction protocols for MYO and SCL from PSCs have been previously reported by several researchers, no study has yet demonstrated the induction of SYN and D from iPSCs. Therefore, efficient induction of fully competent SMs remains a major challenge. Here, we recapitulate human SM patterning with human iPSCs in vitro by mimicking the signaling environment during chick/mouse SM development, and report on methods of systematic induction of SM derivatives (MYO, SCL, D, and SYN) from human iPSCs under chemically defined conditions through the presomitic mesoderm (PSM) and SM states. Knowledge regarding chick/mouse&#160;SM development was successfully applied to the induction of SMs with human iPSCs. This method could be a novel tool for studying human somitogenesis and patterning without the use of embryos and for cell-based therapy and disease modeling.

We present here a protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into each somite derivative (myotome, sclerotome, dermatome, and syndetome) in chemically defined conditions, which has applications in future disease modeling and cell-based therapies in orthopedic surgery.

En la generación de Vitro del Somite derivados humanos inducida por células madre pluripotentes

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous system and protects neural tissue from toxins and pathogens. Defects in the formation of this barrier have been correlated with neuropathies, and the breakdown of this barrier has been observed in many neurodegenerative diseases. Therefore, it is critical to identify the genes that regulate the formation and maintenance of the blood-brain barrier to identify potential therapeutic targets. In order to understand the exact roles these genes play in neural development, it is necessary to assay the effects of altered gene expression on the integrity of the blood-brain barrier. Many of the molecules that function in the establishment of the blood-brain barrier have been found to be conserved across eukaryotic species, including the fruit fly, Drosophila melanogaster. Fruit flies have proven to be an excellent model system for examining the molecular mechanisms regulating nervous system development and function. This protocol describes a step-by-step procedure to assay for blood-brain barrier integrity during the embryonic and larval stages of D. melanogaster development.

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Blood-brain barrier integrity is critical for nervous system function. In Drosophila melanogaster, the blood-brain barrier is formed by glial cells during late embryogenesis. This protocol describes methods to assay for blood-brain barrier formation and maintenance in D. melanogaster embryos and third instar larvae.

Ensayo para la integridad de la barrera hematoencefálica en Drosophila melanogaster

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous ...

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can also become diseased and cause morbidity and even death. Model systems to study human endometrial biology have been limited to in vitro culture systems of single cell types. In addition, the epithelial cells, one of the major cell types of the endometrium, do not propagate well or retain their physiological traits in culture, and thus our understanding of endometrial biology remains limited. We have generated, for the first time, endometrial organoids that consist of both epithelial and stromal cells of the human endometrium. These organoids do not require any exogenous scaffold materials and specifically organize so that epithelial cells encompass the spheroid-like structure and become polarized with stromal cells in the center that produce and secrete collagen. Estrogen, progesterone and androgen receptors are expressed in the epithelial and stromal cells and treatment with physiological levels of estrogen and testosterone promote the organization of the organoids. This new model system can be used to study normal endometrial biology and disease in ways that were not possible before.

A protocol to generate human primary endometrial organoids that consist of epithelial and stromal cells and retain characteristics of the native endometrial tissue is presented. This protocol describes methods from uterine tissue acquisition to the histologic processing of endometrial organoids.

Generación de organoides endometriales primarios humanos multicelulares

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...