Name: generation of a human ipsc-based blood-brain barrier chip
Uploaded: 2020-03-02T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of a Human iPSC-Based Blood-Brain Barrier Chip at JoVE.com

Vi vill tacka dr Soshana Svendsen för kritisk redigering. Detta arbete stöddes av Israel Science Foundation bidrag 1621/18, ministeriet för vetenskap och teknik (MOST), Israel 3-15647, California Institute for Regenerative Medicine bevilja ID DISC1-08800, Sherman Family Foundation, NIH-NINDS bevilja 1UG3NS105703, och ALS Association bevilja 18-SI-389. AH finansierades av Wallenberg Foundation (bidragsnummer 2015.0178).

1. Generering av iPSC-härledda neurala stamceller (iNPCs)
<ol><li>Producera EZ-sfärer från iPSC kolonier som beskrivs nedan och som tidigarepublicerats 20,21,22.<ol>
<li>Kultur iPSC kolonier till sammanflödet på källaren membran matrix-belagda 6 brunn plattor (0,5 mg/tallrik) i mTESR1 eller andra kommersiella medier (se Materialtabell).</li>
		<li>Ta bort iPSC medium och byt ut med 2 ml EZ-sfärmedium [E...

<ol>
	<li>Pardridge, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+endogenous+transporters+as+therapeutic+targets:+a+new+model+for+small+molecule+CNS+drug+discovery.">Blood-brain barrier endogenous transporters as therapeutic targets: a new model for small molecule CNS drug discovery.</a> Expert Opinion on Therapeutic Targets. 19 (8), 1059-1072 (2015).</li><li>Gastfriend, B. D., Palecek, S. P., Shusta, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+blood-brain+barrier:+beyond+the+endothelial+cells.">Modeling the blood-brain barrier: beyond the endothelial cells.</a> Current Opinion in Biomedical Engineering. 5, 6-12 (2018).</li><li>Jamieson, J. J., Linville, R. M., Ding, Y. Y., Gerecht, S., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+iPSC-derived+pericytes+on+barrier+function+of+iPSC-derived+brain+microvascular+endothelial+cells+in+2D+and+3D.">Role of iPSC-derived pericytes on barrier function of iPSC-derived brain microvascular endothelial cells in 2D and 3D.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 16 (1), 15 (2019).</li><li>El-Habashy, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+treatment+strategies+for+brain+tumors+and+metastases.">Novel treatment strategies for brain tumors and metastases.</a> Pharmaceutical Patent Analyst. 3 (3), 279-296 (2014).</li><li>Lim, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntington's+disease+iPSC-derived+brain+microvascular+endothelial+cells+reveal+WNT-mediated+angiogenic+and+blood-brain+barrier+deficits.">Huntington's disease iPSC-derived brain microvascular endothelial cells reveal WNT-mediated angiogenic and blood-brain barrier deficits.</a> Cell Reports. 19 (7), 1365-1377 (2017).</li><li>Dumitrescu, A. M., Liao, X. H., Weiss, R. E., Millen, K., Refetoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+thyroid+hormone+deprivation+and+excess+in+monocarboxylate+transporter+(mct)+8-deficient+mice.">Tissue-specific thyroid hormone deprivation and excess in monocarboxylate transporter (mct) 8-deficient mice.</a> Endocrinology. 147 (9), 4036-4043 (2006).</li><li>Spencer, J. I., Bell, J. S., DeLuca, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+pathology+in+multiple+sclerosis:+reframing+pathogenesis+around+the+blood-brain+barrier.">Vascular pathology in multiple sclerosis: reframing pathogenesis around the blood-brain barrier.</a> Journal of Neurology and Neurosurgical Psychiatry. 89 (1), 42-52 (2018).</li><li>Yamazaki, Y., Kanekiyo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+dysfunction+and+the+pathogenesis+of+Alzheimer's+disease.">Blood-brain barrier dysfunction and the pathogenesis of Alzheimer's disease.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (9), 1965 (2017).</li><li>Ben-Zvi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mfsd2a+is+critical+for+the+formation+and+function+of+the+blood-brain+barrier.">Mfsd2a is critical for the formation and function of the blood-brain barrier.</a> Nature. 509 (7501), 507 (2014).</li><li>Heng, M. Y., Detloff, P. J., Albin, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rodent+genetic+models+of+Huntington+disease.">Rodent genetic models of Huntington disease.</a> Neurobiology of Disease. 32 (1), 1-9 (2008).</li><li>Ho, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALS+disrupts+spinal+motor+neuron+maturation+and+aging+pathways+within+gene+co-expression+networks.">ALS disrupts spinal motor neuron maturation and aging pathways within gene co-expression networks.</a> Nature Neuroscience. 19 (9), 1256 (2016).</li><li>Griep, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BBB+on+chip:+microfluidic+platform+to+mechanically+and+biochemically+modulate+blood-brain+barrier+function.">BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function.</a> Biomedical Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).</li><li>Prabhakarpandian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+tumor+networks+for+screening+drug+delivery+systems.">Synthetic tumor networks for screening drug delivery systems.</a> Journal of controlled release. 201, 49-55 (2015).</li><li>Delsing, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barrier+properties+and+transcriptome+expression+in+human+iPSC-derived+models+of+the+blood-brain+barrier.">Barrier properties and transcriptome expression in human iPSC-derived models of the blood-brain barrier.</a> Stem Cells. 36 (12), 1816-1827 (2018).</li><li>Park, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-enhanced+Blood-Brain+Barrier+Chip+recapitulates+human+barrier+function+and+shuttling+of+drugs+and+antibodies.">Hypoxia-enhanced Blood-Brain Barrier Chip recapitulates human barrier function and shuttling of drugs and antibodies.</a> Nature Communications. 10 (1), 2621 (2019).</li><li>Vatine, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPSC-Derived+Blood-Brain+Barrier+Chips+Enable+Disease+Modeling+and+Personalized+Medicine+Applications.">Human iPSC-Derived Blood-Brain Barrier Chips Enable Disease Modeling and Personalized Medicine Applications.</a> Cell Stem Cell. 24 (6), 995-1005 (2019).</li><li>Henry, O. Y. F., Villenave, R., Cronce, M. J., Leineweber, W. D., Benz, M. A., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organs-on-chips+with+integrated+electrodes+for+trans-epithelial+electrical+resistance+(TEER)+measurements+of+human+epithelial+barrier+function.">Organs-on-chips with integrated electrodes for trans-epithelial electrical resistance (TEER) measurements of human epithelial barrier function.</a> Lab on a Chip. 17 (13), 2264-2271 (2017).</li><li>Sances, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPSC-derived+endothelial+cells+and+microengineered+organ+chip+enhance+neuronal+development.">Human iPSC-derived endothelial cells and microengineered organ chip enhance neuronal development.</a> Stem Cell Reports. 10 (4), 1222-1236 (2018).</li><li>Workman, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+utilization+of+induced+pluripotent+stem+cell&#8211;derived+human+intestinal+organoids+using+microengineered+chips.">Enhanced utilization of induced pluripotent stem cell&#8211;derived human intestinal organoids using microengineered chips.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 669-677 (2018).</li><li>Ebert, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EZ+spheres:+a+stable+and+expandable+culture+system+for+the+generation+of+pre-rosette+multipotent+stem+cells+from+human+ESCs+and+iPSCs.">EZ spheres: a stable and expandable culture system for the generation of pre-rosette multipotent stem cells from human ESCs and iPSCs.</a> Stem Cell Research. 10 (3), 417-427 (2013).</li><li>Shelley, B. C., Gowing, G., Svendsen, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cGMP-applicable+expansion+method+for+aggregates+of+human+neural+stem+and+progenitor+cells+derived+from+pluripotent+stem+cells+or+fetal+brain+tissue.">A cGMP-applicable expansion method for aggregates of human neural stem and progenitor cells derived from pluripotent stem cells or fetal brain tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), e51219 (2014).</li><li>Vatine, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+psychomotor+retardation+using+iPSCs+from+MCT8-deficient+patients+indicates+a+prominent+role+for+the+blood-brain+barrier.">Modeling psychomotor retardation using iPSCs from MCT8-deficient patients indicates a prominent role for the blood-brain barrier.</a> Cell Stem Cell. 20 (6), 831-843 (2017).</li><li>Svendsen, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+the+rapid+and+long+term+growth+of+human+neural+precursor+cells.">A new method for the rapid and long term growth of human neural precursor cells.</a> Journal of Neuroscience Methods. 85 (2), 141-152 (1998).</li><li>Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+retinoic+acid-enhanced,+multicellular+human+blood-brain+barrier+model+derived+from+stem+cell+sources.">A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources.</a> Scientific Reports. 4, 4160 (2014).</li><li>Canfield, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+isogenic+blood-brain+barrier+model+comprising+brain+endothelial+cells,+astrocytes,+and+neurons+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">An isogenic blood-brain barrier model comprising brain endothelial cells, astrocytes, and neurons derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Journal of Neurochemistry. 140 (6), 874-888 (2017).</li><li>Jamieson, J. J., Gerecht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chipping+Away+at+Blood-Brain-Barrier+Modeling.">Chipping Away at Blood-Brain-Barrier Modeling.</a> Cell stem cell. 24 (6), 831-832 (2019).</li><li>Faal, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Mesoderm+and+Neural+Crest-Derived+Pericytes+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells+to+Study+Blood-Brain+Barrier+Interactions.">Induction of Mesoderm and Neural Crest-Derived Pericytes from Human Pluripotent Stem Cells to Study Blood-Brain Barrier Interactions.</a> Stem Cell Reports. 12 (3), 451-460 (2019).</li><li>Lippmann, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+blood-brain+barrier+endothelial+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 30 (8), 783 (2012).</li><li>Qian, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+blood-brain+barrier+endothelial+cells.">Directed differentiation of human pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells.</a> Science Advances. 3 (11), 1701679 (2017).</li><li>Neal, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified,+Fully+Defined+Differentiation+Scheme+for+Producing+Blood-Brain+Barrier+Endothelial+Cells+from+Human+iPSCs.">A Simplified, Fully Defined Differentiation Scheme for Producing Blood-Brain Barrier Endothelial Cells from Human iPSCs.</a> Stem Cell Reports. 12 (6), 1380-1388 (2019).</li><li>Wevers, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+perfused+human+blood-brain+barrier+on-a-chip+for+high-throughput+assessment+of+barrier+function+and+antibody+transport.">A perfused human blood-brain barrier on-a-chip for high-throughput assessment of barrier function and antibody transport.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 15 (1), 23 (2018).</li><li>Huh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabrication+of+human+organs-on-chips.">Microfabrication of human organs-on-chips.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2135 (2013).</li><li>Huh, D., Matthews, B. D., Mammoto, A., Montoya-Zavala, M., Hsin, H. Y., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+organ-level+lung+functions+on+a+chip.">Reconstituting organ-level lung functions on a chip.</a> Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).</li></ol>

Kombinationen av organ-on-chip-teknik och iPSC-härledda celler i NVU håller löfte om korrekt modellering av den mänskliga BBB. Här ger vi ett detaljerat protokoll för enkel och robust tillämpning av den nyligen publicerade iPSC-baserade BBB chip16. En översikt och tidpunkt för sådd paradigm visas i figur 3. För att erhålla och underhålla barriärfunktioner som är lämpliga för BBB-modellering är det avgörande att generera ett homogent iBMEC-monoskikt ...

BBB är en mycket selektiv barriär som skiljer CNS från det cirkulerande blodet. Det skyddar kritiska hjärnfunktioner från potentiellt störande ämnen, faktorer och xenobiotika samtidigt som tillströmningen av näringsämnen och andra metaboliter som krävs för att upprätthålla hjärnan homeostas1. BBB är en multicellulära NVU där pericyter, astrocyter endfeet och neuronala processer direkt kontakt hjärnan mikrovaskulära endotelceller (BMECs). Dessa interaktioner gör det möjligt för BMECs att bilda specialiserade barriäregenskaper som stöds av snäva och vidhäftningar korsningar2,3. Bildandet av denna barriär begränsar den paracellulära passagen av molekyler, men den innehåller polariserade transportörer för att aktivt transportera molekyler till CNS eller tillbaka in i blodet1. På grund av dessa unika barriäregenskaper utgör BBB ett stort hinder för leverans av biofarmaceutiska läkemedel i hjärnan, och det uppskattas att mindre än 5% av FDA-godkända små molekyler kan nå CNS4.
Djurmodeller har använts i stor utsträckning för att studera BBB penetrance och de molekylära mekanismer som deltar i BBB utveckling5. Medan djurmodeller troget representerar den komplexa multicellulära in vivo-miljön, utesluter skillnader i uttryck och aktivitet av BBB-transportörer samt substratspecificitet mellan arter ofta korrekt extrapolering av djurdata till människor6. Således är människobaserade modeller avgörande för att studera den mänskliga BBB och för användning i utvecklingen av läkemedel som syftar till att rikta CNS. Detta behov blir ännu tydligare med den ökande dominansen av biologiska, människospecifika läkemedel på läkemedelsutvecklingsområdet. Ackumulerande bevis tyder på att en komprometterad BBB är associerad med ett antal allvarliga CNS störningar, inklusive hjärntumörer och neurologiska sjukdomar7,8,9. Mänskliga modeller återspeglar troget dessa sjukdomar har potential att både 1) identifiera nya vägar som kan riktas mot läkemedelsutveckling och 2) förutsäga CNS penetrance, vilket minskar tid och resurser i prekliniska studier och eventuellt minska felfrekvensen i kliniska prövningar.
In vitro-modeller har genomförts i stor utsträckning för att studera interaktioner mellan BMECs och andra celler i NVU och genomföra skärmar för potentiella BBB-genomsläppliga läkemedel10. För att återskapa viktiga aspekter av den mänskliga BBB måste in vitro-modeller visa fysiologiskt relevanta egenskaper (dvs. låg paracellulära permeabilitet och fysiologiskt relevant transendotelelektriskresistens [TEER] över endotelmonolayer). Dessutom måste den molekylära profilen för ett in vitro-system innehålla uttryck för representativa funktionella transportsystem. Typiskt, in vitro modeller består av endotelceller som är samodlade på ett semipermeable membran med kombinationer av andra NVU celler för att förbättra BBB egenskaper11. Detta tillvägagångssätt möjliggör enkel och relativt snabb bedömning av barriärfunktionalitet och molekylpermeabilitet. Sådana cellbaserade BBB-modeller kan upprättas med djur- eller mänskliga cellkällor, inklusive celler som isolerats från kirurgiska excisions eller förevigade BMEC-linjer.
Nyligen infördes protokoll för att differentiera mänskliga pluripotenta celler i BMECs som en attraktiv källa för in vitro mänskliga BBB modeller12,13. Inducerad pluripotent stamcells (iPSC)-härledda BMECs (iBMECs) är mycket skalbara, visar avgörande morfologiska och funktionella egenskaper hos den mänskliga BBB, och bär genetik en patient. I kulturen bildar iBMECs ett monolayer som uttrycker snäva kopplingsmarkörer och visar in vivo-liknande snäva kopplingskomplex. Dessa celler uttrycker också BBB-markörer, inklusive BBB glukostransportör, glukostransportör 1 (GLUT1). Viktigt, och till skillnad från andra alternativa cellkällor för mänskliga BMECs, iBMECs förvärva barriäregenskaper med värden så högt som de mätt in vivo14, polarisera längs basolateral axeln, och uttrycka funktionella efflux pumpar. Dessutom välkomnar användningen av iSP:er från olika ämnen båda 1) möjligheten att testa aspekter av BBB på ett personligt medicinsätt och 2) en flexibel källa för att generera ytterligare celltyper av NVU. Generera dessa celler från en isogenic cell källa för att skapa personliga BBB-chips skulle också bidra till att förstå mellan individuella skillnader i läkemedelssvar, vilket är en viktig orsak till resistens eller äventyras svar på behandling som observerats i kliniska studier.
Användning av iBMECs som monolayers i en maträtt eller på en halv permeable transwell infoga representerar en kraftfull metod för BBB modellering. Dessa system tenderar att vara robusta, reproducerbara och kostnadseffektiva. Dessutom är funktionella analyser som TEER och permeabilitet relativt enkla att utföra. Emellertid, tvådimensionella (2D) system misslyckas med att sammanfatta 3D-karaktären av in vivo vävnad, och de saknar fysiologiska skjuvning stresskrafter som cirkulerar blod och blodkroppar. Detta begränsar kärlens förmåga att utveckla och underhålla inneboende BBB-egenskaper och funktioner.
Mikrokonstruerade system kantade av levande celler har implementerats för att modellera olika organfunktioner i ett koncept som kallas organ-on-chips. Genom att återskapa in vivo-liknande multicellulär arkitektur, vävnadsvävnadsgränssnitt, fysicokemiska mikromiljöer och vaskulär perfusion, genererar dessa mikrokonstruerade plattformar nivåer av vävnads- och organfunktionalitet som inte är möjlig med konventionella 2D-kultursystem. De möjliggör också högupplöst, realtidsavbildning och analys av biokemiska, genetiska och metaboliska profiler som liknar levande celler i in vivovävnad och organsammanhang. Men en särskild utmaning av organ-on-chip är att design, tillverkning och tillämpning av dessa mikrokonstruerade chips kräver specialiserad teknisk expertis som vanligtvis saknas i biologiskt orienterade akademiska laboratorier.
Vi har nyligen kombinerat iPSC och organ-on-chip-teknik för att generera en personlig BBB chip modell15,16. För att övervinna de tekniska utmaningar som beskrivs används det kommersiellt tillgängliga Chip-S1 tillsammans med kulturmodulen, ett instrument som är utformat för att automatisera underhållet av chipsen på ett enkelt och robust sätt (Emulate Inc.). BBB-chippet återskapar interaktioner mellan neurala och endotelceller och uppnår fysiologiskt relevanta TEER-värden, som mäts av skräddarsydda organchips med integrerade guldelektroder17. Dessutom visar BBB-chipet låg paracellulära permeabilitet, svarar på inflammatoriska signaler på organnivå, uttrycker aktiva effluxpumpar och uppvisar prediktiva transporter av lösliga biomarkörer och biofarmaceutiska läkemedel. Noterbart är att BBB-chips som genereras från flera individer fångar de förväntade funktionella skillnaderna mellan friska individer och patienter med neurologiska sjukdomar15.
I protokollet nedan beskrivs en tillförlitlig, effektiv och reproducerbar metod för generering av mänskliga iPSC-baserade BBB-chips under dynamiska flödesförhållanden. Vägledning ges om vilken typ av analyser och slutpunktsanalyser som kan utföras direkt i BBB-chippet eller från provtagningsspillvatten. Således visar protokollet spektrumet av tekniker som kan tillämpas för att utvärdera biologiska och funktionella egenskaper och svar i en människa-relevant modell.
Här finns en kort beskrivning av det iPSC-baserade BBB-chippet. Mänskliga iPSCs differentieras ursprungligen och förökas i vävnadsodlingsflaskor som fritt flytande aggregat av neurala progenitorer, kallade EZ-sfärer. Den övre kanalen i Chip-S116,18,19 är sådd med separerade EZ-sfärer som bildar "hjärnan sidan" av chip, som celler skiljer över 7 dagar i en blandad kultur av neurala stamceller (iNPCs), iAstrocyter och iNeurons. Mänskliga iPSCs är också differentierade i vävnadsodlingplattor i iBMECs. Den nedre kanalen av chipet är seedade med iBMECs att bilda "blodsidan" som de utvecklas för att bilda en endotelrör(figur 1). Den porösa extracellulära matrisen (ECM)-belagda membran som separerar de övre och nedre kanalerna 1) tillåter bildandet av cell-till-cell interaktioner mellan kanaler och 2) gör det möjligt för användaren att köra permeabilitet analyser och bildceller i båda kanalerna med hjälp av ett konventionellt ljusmikroskop.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SCR005</td>
			<td>Dissociation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bfgf</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chip-S1</td>
			<td>Emulate Inc</td>
			<td>Chip-S1</td>
			<td>Organ-Chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D3571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran-FITC</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>46944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM: F12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31330038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emulate Reagent 1 (ER-1)</td>
			<td>Emulate Inc</td>
			<td>ER-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emulate Reagent 2 (ER-2)</td>
			<td>Emulate Inc</td>
			<td>ER-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP)</td>
			<td>Dako</td>
			<td>Z0334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GLUT-1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MA5-11315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050038</td>
			<td>Glutamine supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hBDNF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOSR</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>Basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>StemCell Technologies, Inc.</td>
			<td>85851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA</td>
			<td>Biological industries</td>
			<td>01-340-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nestin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NutriStem</td>
			<td>Biological industries</td>
			<td>05-100-1A</td>
			<td>Alternate media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PECAM-1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platelet-poor plasma-derived bovine serum (PPP)</td>
			<td>Biomedical Technologies</td>
			<td>J64483AB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid (RA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S100&#946;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZO-1 Monoclonal Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>33-9100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;III-tubulin (Tuj1&#945;)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>31350010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of a human ipsc-based blood-brain barrier chip

Blodhjärnbarriären (BBB) bildas av neurovaskulära enheter (NVUs) som skyddar det centrala nervsystemet (CNS) från en rad faktorer som finns i blodet som kan störa känslig hjärnfunktion. BBB är därför ett stort hinder för leverans av therapeutics till CNS. Ackumulerande bevis tyder på att BBB spelar en nyckelroll i uppkomsten och utvecklingen av neurologiska sjukdomar. Således finns det ett enormt behov av en BBB modell som kan förutsäga penetration av CNS-riktade läkemedel samt belysa BBB: s roll i hälsa och sjukdom.
Vi har nyligen kombinerat organ-on-chip och inducerad pluripotent stamcellsteknik (iPSC) för att generera ett BBB-chip helt personligt för människor. Denna nya plattform visar cellulära, molekylära och fysiologiska egenskaper som är lämpliga för förutsägelse av läkemedels- och molekyltransporter över den mänskliga BBB. Dessutom, med hjälp av patientspecifika BBB-chips, har vi genererat modeller av neurologisksjukdom och visat potentialen för personliga prediktiva läkemedel applikationer. Förutsatt här är ett detaljerat protokoll som visar hur man genererar iPSC-härledda BBB-chips, som börjar med differentiering av iPSC-härledda hjärnan mikrovaskulära endotelceller (iBMECs) och resulterar i blandade neurala kulturer som innehåller neurala progenitorer, differentierade nervceller och astrocyter. Också beskrivs är ett förfarande för sådd celler i organchip et och odling av BBB-flisunder kontrollerade laminarflöde. Slutligen ges detaljerade beskrivningar av BBB-spånanalyser, inklusive paracellulära permeabilitetsanalyser för bedömning av läkemedels- och molekylpermeabilitet samt immunocytokemiska metoder för att bestämma sammansättningen av celltyper inom chippet.

Figur 6A,B,C representerar en BBB chip seedade med EZ-sfärer på "hjärnan sidan" övre kanal och iBMECs på "blod sidan"" nedre kanalen. IBMECs varseedade först och tilläts fästa över natten, varefter EZ-sfärerna var seedade. Chips odlades sedan under statiska förhållanden med daglig media ersättning i sju dagar. BBB-chippet fastställdes sedan med 4% PFA på RT i 10 min och tvättades 3x med DPBS. Immunocytochemistry utfördes på BBB-chippet med 1) nestin som en ...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of a Human iPSC-Based Blood-Brain Barrier Chip at JoVE.com

Generation of a Human iPSC-Based Blood-Brain Barrier Chip

Blod - hjärnbarriären (BBB) är en multicellulär neurovaskulär enhet som i tät en tid reglerar hjärnans homeostas. Genom att kombinera humana iPSCs och organ-on-chip-teknik har vi genererat ett personligt BBB-chip, lämpligt för sjukdomsmodellering och CNS-läkemedelspenetrability förutsägelser. Ett detaljerat protokoll beskrivs för generering och drift av BBB-chippet.

Generation av en mänsklig iPSC-baserade Blod-Brain Barriär Chip

The blood brain barrier (BBB) is formed by neurovascular units (NVUs) that shield the central nervous system (CNS) from a range of factors found in the ...

Detta protokoll kommer att visa hur differentierade inducerade pluripotenta stamceller kan seedas på ett organ-on-chip för att generera en helt mänsklig, personlig, mikrofluidisk blod - hjärnbarriären, som kan användas för att förutsäga centrala nervsystemet läkemedelsgenomsläpplighet och att studera neurologiska sjukdomar. Med hjälp av en kommersiellt tillgänglig organ-on-chip, kommer vi att visa hur alla biologiskt orienterade lab kan använda denna teknik för att generera en personlig, mikrofluidic blod - hjärnbarriären-on-chip. Ackumulerande bevis tyder på att BBB spelar en roll i neurologisk sjukdom genom att generera personliga BBB chips som härrör från iPSCs av individer med en genetisk neurologisk sjukdom.Det kommer att vara möjligt att studera BBB:s roll i hälsa och sjukdom. Denna metod kan också vara användbar för läkemedelsföretag, som kan använda denna mänskliga BBB plattform för att skärmen för penebilitet av kandidat neurologiska läkemedel i den mänskliga hjärnan. Tillämpningen av organ-on-chip-teknik kräver vanligtvis specialiserade ingenjörskunskaper.Med hjälp av kommersiellt tillgängliga plattformar möjliggör tillämpningen av denna teknik i alla biologiskt orienterade lab. Till att börja med, ta skålen som innehåller de beredda chips till biosäkerhetsskåpet. Med hjälp av en P200-pipett tvättar du försiktigt båda kanalerna genom att tillsätta 200 mikroliter av neural differentieringsmedium i inloppet och dra vätskan från utloppet.Undvika kontakt med portarna, aspirera noggrant överskott mediadroppar från ytan av chipet. Agitera försiktigt cellupphängningen för att säkerställa en homogen cellupphängning. För att så de iPSC-härledda neurala stamcellerna i den övre kanalen för att generera hjärnsidan, tillsätt en P200-spets som innehåller 30 till 100 mikroliter cellfjädring i koncentrationen av en gång 10 till de sex cellerna per milliliter till den övre kanalens inlopp och försiktigt släppa spetsen från pipetten.Ta en tom P200-pipett, tryck ned kolven, sätt in i den övre kanalens utlopp och dra försiktigt encellsupphängningen genom spetsen. Överför chipet till mikroskopet för att kontrollera sådddensiteten och homogena fördelningen av celler inom den övre kanalen. Efter att ha bekräftat celltätheten vid 20%-täckning, placera omedelbart flisen i inkubatorn i två timmar vid 37 grader Celsius.Därefter tvättar du bort de celler som inte fäster genom att lägga till nytt neural differentieringsmedium i inloppet och dra vätskan via pipetten från utloppet. Håll cellerna under statiska förhållanden vid 37 grader Celsius med en daglig neural differentiering medium ersättning. När iNPCs har fäst eller på en efterföljande dag efter sådd, föra skålen som innehåller de beredda flisen till biosäkerhetsskåpet.Tvätta försiktigt bottenkanalen med 200 mikroliter av endotelcellsmedium. Undvika kontakt med portarna, försiktigt aspirera droppar av överskott endotelcellsmedium från ytan av chipet, se till att lämna medium i båda kanalerna. Agitera försiktigt cellupphängningen för att säkerställa en homogen cellupphängning.Med hjälp av en P200-pipett, dra upp 30 till 100 mikroliter av iPSC-härledda hjärnan mikrovaskulära endotelcell suspension i koncentration av 14 till 20 gånger 10 till de sex cellerna per milliliter, och placera spetsen i botten kanal inloppet. Det mest kritiska steget för att uppnå funktionella barriäregenskaper är sådd av hjärnans mikrovaskulära endotelceller. Det är avgörande att fröceller vid rätt densitet för att undvika bubbla bildning för att verifiera homogen fördelning inom organ chip.Tryck ned kolven på en P200-pipett med tom spets, sätt in i den nedersta kanalens utlopp och släpp långsamt pipettkolven för att försiktigt dra encellsupphängningen genom nedersta kanalen. Aspirera överskottet cell suspension från ytan av chipet. Undvik direktkontakt med in- och utloppsportarna för att säkerställa att ingen cellupphängning sugs ut ur kanalerna.Överför chipet till mikroskopet för att kontrollera såddtätheten. Den nedre kanalen är fylld med celler utan observerbara luckor däremellan. Efter att ha bekräftat rätt celltäthet, sår cellerna i de återstående spånen.Att fästa cellerna på det porösa membranet, som ligger ovanpå den nedre kanalen, invertera varje chip, och låt dem vila i en chipvagga. Placera en liten reservoar som innehåller sterila DPBS inuti 150-millimeters skålen för att ge fukt för cellerna. Inkubera spånorna i 37 grader Celsius i cirka tre timmar eller tills celler i den nedre kanalen har fäst.När iPSC-härledda hjärnan mikrovaskulära endotelceller har fäst, vänd marker tillbaka till en upprätt position för att tillåta cell fastsättning till den nedre delen av den nedre kanalen. 48 timmar efter sådd av iPSC-härledda hjärnan mikrovaskulära endotelceller, jämvikt temperaturen i endotelcellmediet genom uppvärmning i en 37-graders Celsius vattenbad i en timme. Sedan avgasar mediet genom inkubation under ett vakuumdrivet filtreringssystem i 15 minuter.Därefter sanera utsidan av den bärbara modulen förpackningar och brickor med 70%etanol, torka, och överföra dem till biosäkerhet skåpet. Öppna förpackningen, och placera modulerna i facket Orient dem med reservoarerna mot baksidan av facket. Pipett tre milliliter av den förjämnade, varma media till varje inloppsbehållare.Lägg endotel cell kultur medium till inloppsreservoaren av den nedre kanalen och neural differentiering medium till den övre kanalen inlopp reservoar av den övre kanalen. Därefter pipettera 300 mikroliter av den förjämnas, varma media till varje uttagsbehållare, direkt över varje uttagsport. Placera upp till sex bärbara moduler på varje fack.För brickor till inkubatorn, och skjut helt in i odlingsmodulen med brickhandtaget utåt. Välj och kör prime-cykeln på kulturmodulen. Stäng inkubatordörren, och låt kulturmodulen prime de bärbara modulerna i ungefär en minut.Priming cykeln är klar när statusfältet läser klart. Ta ut facket från odlingsmodulen, och ta med den till biosäkerhetsskåpet. Inspektera undersidan av varje bärbar modul i biosäkerhetsskåpet för att kontrollera att de bärbara modulerna var framgångsrikt primade.Leta efter förekomsten av små droppar vid alla fyra portarna. Om någon bärbar modul inte visar droppar, köra om den främsta cykeln på dessa moduler. Om något media droppade på brickan, som förekommer oftare av utloppsportarna, rengör du facket med 70%etanol.Därefter tvättar du försiktigt båda kanalerna på varje chip med varmt, ekvilovilligt cellspecifikt odlingsmedium för att ta bort eventuella bubblor i kanalen och placera små droppar med media på toppen av varje in- och utloppsport. Sätt in chipsen med bärarna i de bärbara modulerna, och placera upp till sex på varje bricka. Sätt in facken i kulturmodulen.Programmera lämpliga organ chip kultur förhållanden, såsom flödeshastighet och stretch, på kulturmodulen. Så snart den reglerar cykeln är klar, vilket tar ungefär två timmar, startar de programmerade förhållandena. Därefter börjar odlingsmodulen flöde vid de förinställda orgelchipskulturförhållandena.Immuncytokemi på iPSC-baserade blod - hjärnbarriären chip sju dagar efter sådd visar EZ sfärer differentieras till en blandad neurala cell befolkningen i den övre hjärnan sida kanal, inklusive S100 beta-positiva astrocyter, Nestin-positiva neurala stamceller, samt GFAP-positiva astrocyter, och beta III tubulin-positiva nervceller. IPSC-härledda hjärnan mikrovaskulära endotelceller seedade i botten blod sida kanal uttryckt GLUT-1 och PECAM-1. Utvärdering av blod - hjärnbarriären chip permeabilitet visar att organ chip seedade med iPSC-härledda hjärnan mikrovaskulära endotelceller och EZ sfärer hade en stram barriär jämfört med organ chips sådd med iPSC-härledda hjärnan mikrovaskulära endotelceller ensam.Organchips som var seedade med enbart EZ-sfärer visade inga barriäregenskaper. Från den initiala ytbehandlingen av kanalen till mediet som byter varje dag, undvik bubbla bildning i kanalen. Under hela steget i det protokoll i vilket ytaktiveringsreagens, extracellulär matris eller cellinnehållande medium behöver sättas in genom kanalerna, är det oerhört viktigt att noggrant kontrollera att ingen bubbla hittas.Permeabiliteten analysen kan utföras för att bedöma den mänskliga hjärnan peneetrability av kandidat droger. Detta tillvägagångssätt kan tjäna för att testa potentiella therapeutics. Tillämpningen av det iPSC-baserade BBB-chipet möjliggör studier av BBB:s roll vid olika neurologiska sjukdomar.I framtiden kan en sådan plattform vara användbar för prediktiva, personliga medicinapplikationer.

generation-of-a-human-ipsc-based-blood-brain-barrier-chip

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Human Adipose Stem Cells through Dedifferentiation of Mature Adipocytes in Ceiling Cultures

Mature adipocytes have been shown to reverse their phenotype into fibroblast-like cells in vitro through a technique called ceiling culture. Mature adipocytes can also be isolated from fresh adipose tissue for depot-specific characterization of their function and metabolic properties. Here, we describe a well-established protocol to isolate mature adipocytes from adipose tissues using collagenase digestion, and subsequent steps to perform ceiling cultures. Briefly, adipose tissues are incubated in a Krebs-Ringer-Henseleit buffer containing collagenase to disrupt tissue matrix. Floating mature adipocytes are collected on the top surface of the buffer. Mature cells are plated in a T25-flask completely filled with media and incubated upside down for a week. An alternative 6-well plate culture approach allows the characterization of adipocytes undergoing dedifferentiation. Adipocyte morphology drastically changes over time of culture. Immunofluorescence can be easily performed on slides cultivated in 6-well plates as demonstrated by FABP4 immunofluorescence staining. FABP4 protein is present in mature adipocytes but down-regulated through dedifferentiation of fat cells. Mature adipocyte dedifferentiation may represent a new avenue for cell therapy and tissue engineering.

Mature adipocytes may represent an abundant source of stem cells through dedifferentiation, which leads to a homogenous population of fibroblast-like cells. Collagenase digestion is used to isolate mature adipocytes from human fat. The goal of our protocol is to obtain multipotent, dedifferentiated fat cells from human mature adipocytes.

Generering av Human Fett stamceller genom dedifferentiering av mogna Adipocyter i Tak kulturer

Mature adipocytes have been shown to reverse their phenotype into fibroblast-like cells in vitro through a technique called ceiling culture. Mature ...

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function and physiology of their in vivo tissue counterparts. This is exemplified by organotypic skin cultures which faithfully recapitulates the epidermal differentiation and stratification program. Primary human epidermal keratinocytes are genetically manipulable through retroviruses where genes can be easily overexpressed or knocked down. These genetically modified keratinocytes can then be used to regenerate human epidermis in organotypic skin cultures providing a powerful model to study genetic pathways impacting epidermal growth, differentiation, and disease progression. The protocols presented here describe methods to prepare devitalized human dermis as well as to genetically manipulate primary human keratinocytes in order to generate organotypic skin cultures. Regenerated human skin can be used in downstream applications such as gene expression profiling, immunostaining, and chromatin immunoprecipitations followed by high throughput sequencing. Thus, generation of these genetically modified organotypic skin cultures will allow the determination of genes that are critical for maintaining skin homeostasis.

The goal of this paper is to provide a comprehensive and detailed protocol on how to generate genetically modified human organotypic skin from epidermal keratinocytes and devitalized human dermis.

Generation av genetiskt modifierade Organotypiska Skin kulturer Använda devitaliserad Human Dermis

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets of patients with metastatic melanoma. Major obstacles of this approach are the reduced viability of transferred T cells, caused by telomere shortening, and the limited number of TILs obtained from patients. Less-differentiated T cells with long telomeres would be an ideal T cell subset for adoptive T cell therapy;however, generating large numbers of these less-differentiated T cells is problematic. This limitation of adoptive T cell therapy can be theoretically overcome by using induced pluripotent stem cells (iPSCs) that self-renew, maintain pluripotency, have elongated telomeres, and provide an unlimited source of autologous T cells for immunotherapy. Here, we present a protocol to generate iPSCs using Sendai virus vectors for the transduction of reprogramming factors into TILs. This protocol generates fully reprogrammed, vector-free clones. These TIL-derived iPSCs might be able to generate less-differentiated patient- and tumor-specific T cells for adoptive T cell therapy.

The goal of this protocol is to show the protocol for reprogramming melanoma tumor-infiltrating lymphocytes into induced pluripotent stem cells.

Generering av inducerade pluripotenta stamceller från humant melanom tumörinfiltrerande lymfocyter

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the human body. The differentiation of hPSCs to human hepatocyte-like cells (HLCs) has been extensively studied, and efficient differentiation protocols have been established. The combination of extracellular matrix and biological stimuli, including growth factors, cytokines, and small molecules, have made it possible to generate HLCs that resemble primary human hepatocytes. However, the majority of procedures still employ undefined components, giving rise to batch-to-batch variation. This serves as a significant barrier to the application of the technology. To tackle this issue, we developed a defined system for hepatocyte differentiation using human recombinant laminins as extracellular matrices in combination with a serum-free differentiation process. Highly efficient hepatocyte specification was achieved, with demonstrated improvements in both HLC function and phenotype. Importantly, this system is easy to scale up using research and GMP-grade hPSC lines&#160;promising advances in cell-based modelling and therapies.

The method presented here describes a scalable and good manufacturing practice (GMP)-ready differentiation system to generate human hepatocyte-like cells from pluripotent stem cells. It serves as a cost-effective and standardized system to generate human hepatocyte-like cells for basic and applied human liver research.

Definierade och skalbar generation av hepatocyte-liknande celler från mänskliga pluripotenta stamceller

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that limits the translation of basic brain research into clinical application. While induced pluripotent stem cells (iPSCs) have replaced the ethically questionable human embryonic stem cells, iPSC-based neuronal differentiation studies remain descriptive at the cellular level but fail to adequately provide the details that could be derived from a complex, 3D human brain tissue. 
This gap is now filled through the application of iPSC-derived, 3D brain organoids, "Brains in a dish," that model many features of complex human brain development. Here, a method for generating iPSC-derived, 3D brain organoids is described. The organoids can help with modeling autosomal recessive primary microcephaly (MCPH), a rare human neurodevelopmental disorder. A widely accepted explanation for the brain malformation in MCPH is a depletion of the neural stem cell pool during the early stages of human brain development, a developmental defect that is difficult to recreate or prove in vitro. 
To study MCPH, we generated iPSCs from patient-derived fibroblasts carrying a mutation in the centrosomal protein CPAP. By analyzing the ventricular zone of microcephaly 3D brain organoids, we showed the premature differentiation of neural progenitors. These 3D brain organoids are a powerful in vitro system that will be instrumental in modeling congenital brain disorders induced by neurotoxic chemicals, neurotrophic viral infections, or inherited genetic mutations.

Modeling human brain development has been hindered due to the unprecedented complexity of neural epithelial tissue. Here, a method for the robust generation of brain organoids to delineate early events of human brain development and to model microcephaly in vitro is described.

Generation av iPSC härledda mänskliga hjärnan Organoids till modell Tidig nervsystemets sjukdomar

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. In addition, keratinocytes play an essential role in the initiation, maintenance, and regulation of epidermal immune responses by being part of the innate immune system responding to antigenic stimuli in a fast, nonspecific manner. Here, we describe a protocol for isolation of primary human keratinocytes from adult skin, and demonstrate that these cells respond to calcium-induced terminal differentiation, as measured by an increased expression of the differentiation marker involucrin. In addition, we show that the isolated keratinocytes are responsive to IL-1&#946;-induced activation of intracellular signaling pathways as measured by the activation of the p38 MAPK pathway. Taken together, we describe a method for isolation and culturing of primary human keratinocytes from adult skin. Because the keratinocytes are the predominant cell type in the epidermis, this method is useful to study molecular mechanisms in cutaneous biology in vitro.

The human skin acts as a first line of defense against the external environment. We present a method for isolating primary human keratinocytes from adult skin. These isolated keratinocytes are useful in numerous experimental setups, and are a highly suitable model for studying molecular mechanisms in cutaneous biology in vitro.

Generation och odling av primära mänskliga keratinocyter från vuxen hud

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. ...

Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted in sophisticated in vitro models of the intestinal mucosa. Leveraging these emerging model systems will require adaptation of tools and techniques developed for 2D culture systems and animals. Here, we describe a technique for measuring epithelial barrier permeability in human intestinal organoids in real-time. This is accomplished by microinjection of fluorescently-labeled dextran and imaging on an inverted microscope fitted with epifluorescent filters. Real-time measurement of the barrier permeability in intestinal organoids facilitates the generation of high-resolution temporal data in human intestinal epithelial tissue, although this technique can also be applied to fixed timepoint imaging approaches. This protocol is readily adaptable for the measurement of epithelial barrier permeability following exposure to pharmacologic agents, bacterial products or toxins, or live microorganisms. With minor modifications, this protocol can also serve as a general primer on microinjection of intestinal organoids and users may choose to supplement this protocol with additional or alternative downstream applications following microinjection.

This protocol describes the measurement of epithelial barrier permeability in real-time following pharmacologic treatment in human intestinal organoids using fluorescent microscopy and live cell microscopy.

Realtid mätning av epiteliala barriären permeabilitet i Human Intestinal Organoids

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give rise to multiple cell types, including the myotome (MYO), sclerotome (SCL), dermatome (D), and syndetome (SYN), which in turn develop into skeletal muscle, axial skeleton, dorsal dermis, and axial tendon/ligament, respectively. Therefore, the generation of SMs and their derivatives from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is critical to obtain pluripotent stem cells (PSCs) for application in regenerative medicine and for disease research in the field of orthopedic surgery. Although the induction protocols for MYO and SCL from PSCs have been previously reported by several researchers, no study has yet demonstrated the induction of SYN and D from iPSCs. Therefore, efficient induction of fully competent SMs remains a major challenge. Here, we recapitulate human SM patterning with human iPSCs in vitro by mimicking the signaling environment during chick/mouse SM development, and report on methods of systematic induction of SM derivatives (MYO, SCL, D, and SYN) from human iPSCs under chemically defined conditions through the presomitic mesoderm (PSM) and SM states. Knowledge regarding chick/mouse&#160;SM development was successfully applied to the induction of SMs with human iPSCs. This method could be a novel tool for studying human somitogenesis and patterning without the use of embryos and for cell-based therapy and disease modeling.

We present here a protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into each somite derivative (myotome, sclerotome, dermatome, and syndetome) in chemically defined conditions, which has applications in future disease modeling and cell-based therapies in orthopedic surgery.

I Vitro Generation av Somite derivat från mänskliga inducerade stamceller pluripotenta

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous system and protects neural tissue from toxins and pathogens. Defects in the formation of this barrier have been correlated with neuropathies, and the breakdown of this barrier has been observed in many neurodegenerative diseases. Therefore, it is critical to identify the genes that regulate the formation and maintenance of the blood-brain barrier to identify potential therapeutic targets. In order to understand the exact roles these genes play in neural development, it is necessary to assay the effects of altered gene expression on the integrity of the blood-brain barrier. Many of the molecules that function in the establishment of the blood-brain barrier have been found to be conserved across eukaryotic species, including the fruit fly, Drosophila melanogaster. Fruit flies have proven to be an excellent model system for examining the molecular mechanisms regulating nervous system development and function. This protocol describes a step-by-step procedure to assay for blood-brain barrier integrity during the embryonic and larval stages of D. melanogaster development.

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Blood-brain barrier integrity is critical for nervous system function. In Drosophila melanogaster, the blood-brain barrier is formed by glial cells during late embryogenesis. This protocol describes methods to assay for blood-brain barrier formation and maintenance in D. melanogaster embryos and third instar larvae.

Analys för blod-hjärnbarriären integritet i Drosophila melanogaster

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous ...

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can also become diseased and cause morbidity and even death. Model systems to study human endometrial biology have been limited to in vitro culture systems of single cell types. In addition, the epithelial cells, one of the major cell types of the endometrium, do not propagate well or retain their physiological traits in culture, and thus our understanding of endometrial biology remains limited. We have generated, for the first time, endometrial organoids that consist of both epithelial and stromal cells of the human endometrium. These organoids do not require any exogenous scaffold materials and specifically organize so that epithelial cells encompass the spheroid-like structure and become polarized with stromal cells in the center that produce and secrete collagen. Estrogen, progesterone and androgen receptors are expressed in the epithelial and stromal cells and treatment with physiological levels of estrogen and testosterone promote the organization of the organoids. This new model system can be used to study normal endometrial biology and disease in ways that were not possible before.

A protocol to generate human primary endometrial organoids that consist of epithelial and stromal cells and retain characteristics of the native endometrial tissue is presented. This protocol describes methods from uterine tissue acquisition to the histologic processing of endometrial organoids.

Generering av Multicellulära humana primära Endometrieorganoider

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...