Name: directed assembly of elastin-like proteins into defined supramolecular structures and cargo encapsulation in vitro
Uploaded: 2020-04-08T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Directed Assembly of Elastin-like Proteins into defined Supramolecular Structures and Cargo Encapsulation In Vitro at JoVE.com

Die Autoren danken dem BMBF für die finanzielle Unterstützung und dem Center for Biological Systems Analysis (ZBSA) für die Bereitstellung der Forschungseinrichtung. Wir danken P. G. Schultz, TSRI, La Jolla, Kalifornien, USA für die Bereitstellung des Plasmids pEVOL-pAzF. Wir danken den Mitarbeitern des Life Imaging Center (LIC) im Zentrum für Biologische Systemanalyse (ZBSA) der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg für die Unterstützung bei der konfokalen Mikroskopie und die hervorragende Unterstützung bei der Bildaufnahme.

1. Design und Klonen von amphiphilen Elastin-ähnlichen Proteinen (ELPs)
<ol><li>Klonen und Entwerfen der Konstrukte wie an anderer Stelle beschrieben8,20. Plasmide sind auf Anfrage erhältlich.</li>
</ol>2. Proteinexpression, Reinigung und Zubereitung
<ol><li>Ausdruck von F20E20-mEGFP und F20E20-mCherry<ol>
<li>Impfen Sie die Hauptausdruckskultur von der Übernacht-Vorkultur bis zu einem OD600 von 0,3. Bei 37 °C, 200 U/min...

<ol>
	<li>Elzoghby, A. O., Samy, W. M., Elgindy, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-based+nanocarriers+as+promising+drug+and+gene+delivery+systems.">Protein-based nanocarriers as promising drug and gene delivery systems.</a> Journal of Controlled Release. 161 (1), 38-49 (2012).</li><li>Jang, Y., Champion, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-Assembled+Materials+Made+from+Functional+Recombinant+Proteins.">Self-Assembled Materials Made from Functional Recombinant Proteins.</a> Accounts of Chemical Research. 49 (10), 2188-2198 (2016).</li><li>Timmermans, S. B. P. E., van Hest, J. C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+nanoreactors+based+on+peptides+and+proteins.">Self-assembled nanoreactors based on peptides and proteins.</a> Current Opinion in Colloid &amp; Interface Science. 35, 26-35 (2018).</li><li>Dreher, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+Triggered+Self-Assembly+of+Polypeptides+into+Multivalent+Spherical+Micelles.">Temperature Triggered Self-Assembly of Polypeptides into Multivalent Spherical Micelles.</a> Journal of the American Chemical Society. 130 (2), 687-694 (2008).</li><li>Huber, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+amphiphilic+proteins+as+building+blocks+for+the+intracellular+formation+of+organelle-like+compartments.">Designer amphiphilic proteins as building blocks for the intracellular formation of organelle-like compartments.</a> Nature Materials. 14 (1), 125-132 (2014).</li><li>Matsuurua, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+self-assembled+proteins+and+peptides+for+nano-+and+micro-sized+architectures.">Rational design of self-assembled proteins and peptides for nano- and micro-sized architectures.</a> RSC Advances. 4 (6), 2942-2953 (2013).</li><li>Rocklin, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+protein+folding+using+massively+parallel+design,+synthesis,+and+testing.">Global analysis of protein folding using massively parallel design, synthesis, and testing.</a> Science. 357 (6347), 168-175 (2017).</li><li>Schreiber, A., St&#252;hn, L. G., Huber, M. C., Geissinger, S. E., Rao, A., Schiller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-Assembly+Toolbox+of+Tailored+Supramolecular+Architectures+Based+on+an+Amphiphilic+Protein+Library.">Self-Assembly Toolbox of Tailored Supramolecular Architectures Based on an Amphiphilic Protein Library.</a> Small. 15 (30), 1900163 (2019).</li><li>Jang, Y., Hsieh, M. -. C., Dautel, D., Guo, S., Grover, M. A., Champion, J. 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C., Aparicio, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrafibrillar+Mineralization+of+Self-Assembled+Elastin-Like+Recombinamer+Fibrils.">Intrafibrillar Mineralization of Self-Assembled Elastin-Like Recombinamer Fibrils.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. , (2017).</li><li>Vargo, K. B., Parthasarathy, R., Hammer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembly+of+tunable+protein+suprastructures+from+recombinant+oleosin.">Self-assembly of tunable protein suprastructures from recombinant oleosin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (29), 11657-11662 (2012).</li><li>Park, W. M., Champion, J. 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(148), e59831 (2019).</li><li>Huber, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+amphiphilic+proteins+as+building+blocks+for+the+intracellular+formation+of+organelle-like+compartments.">Designer amphiphilic proteins as building blocks for the intracellular formation of organelle-like compartments.</a> Nature Materials. 14 (1), 125-132 (2015).</li><li>Urry, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastin:+a+representative+ideal+protein+elastomer.">Elastin: a representative ideal protein elastomer.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 357 (1418), 169-184 (2002).</li><li>Huber, M. C., Schreiber, A., Wild, W., Benz, K., Schiller, S. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addition+of+p-Azido-l-phenylalanine+to+the+Genetic+Code+of+Escherichia+coli.">Addition of p-Azido-l-phenylalanine to the Genetic Code of Escherichia coli.</a> Journal of the American Chemical Society. 124 (31), 9026-9027 (2002).</li><li>Sonnino, S., Prinetti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+domains+and+the+"lipid+raft"+concept.">Membrane domains and the "lipid raft" concept.</a> Current Medicinal Chemistry. 20 (1), 4-21 (2013).</li><li>Br&#228;se, S., Gil, C., Knepper, K., Zimmermann, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organische+Azide+-+explodierende+Vielfalt+bei+einer+einzigartigen+Substanzklasse.">Organische Azide - explodierende Vielfalt bei einer einzigartigen Substanzklasse.</a> Angewandte Chemie. 117 (33), 5320-5374 (2005).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-Scale+Structures+in+Tetrahydrofuran&#8211;Water+Mixture+with+a+Trace+Amount+of+Antioxidant+Butylhydroxytoluene+(BHT).">Large-Scale Structures in Tetrahydrofuran&#8211;Water Mixture with a Trace Amount of Antioxidant Butylhydroxytoluene (BHT).</a> The Journal of Physical Chemistry B. 115 (24), 7887-7895 (2011).</li><li>Huber, M. C., Schreiber, A., Schiller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimalist+Protocell+Design:+A+Molecular+System+Based+Solely+on+Proteins+that+Form+Dynamic+Vesicular+Membranes+Embedding+Enzymatic+Functions.">Minimalist Protocell Design: A Molecular System Based Solely on Proteins that Form Dynamic Vesicular Membranes Embedding Enzymatic Functions.</a> ChemBioChem. 20 (20), 2618-2632 (2019).</li><li>Raghunathan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+on+the+stability+and+structure+of+two+different+green+fluorescent+proteins+in+organic+co-solvent+systems.">A comparative study on the stability and structure of two different green fluorescent proteins in organic co-solvent systems.</a> Biotechnology and Bioprocess Engineering. 18 (2), 342-349 (2013).</li><li>Sallach, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+biostability+of+self-assembling+protein+polymers+in+the+absence+of+covalent+crosslinking.">Long-term biostability of self-assembling protein polymers in the absence of covalent crosslinking.</a> Biomaterials. 31 (4), 779-791 (2010).</li></ol>

Ein Fehler bei der Befolgung der beschriebenen Protokolle für die Montage definierter supramolekularer Strukturen führt hauptsächlich zur Bildung unspezifischer Aggregate(Abbildung 2, IV) oder zu homogen verteilten ELP-Amphiphilen. Kritische Schritte des Protokolls werden im Folgenden erläutert:
Für eine hohe Expressionsausbeute des amphiphilen ELP ist eine relativ niedrige Temperatur von 20°C optimal. Für eine erfolgreiche Affinitäts-basierte Reinigung de...

Die Montage supramolekularer Strukturen für biotechnologische Anwendungen wird immer wichtiger1,2,3,4,5. Für die Montage von funktionalen Architekturen wie Koacervate, Vesikel und Fasern mit den gewünschten physikalisch-chemischen Eigenschaften ist es wichtig, die physikalisch-chemischen und konformen Eigenschaften der Komponenten zu verstehen und zu kontrollieren. Aufgrund der molekularen Präzision von Molekülen in der Natur basieren Bausteine für supramolekulare Strukturen zunehmend auf Lipiden, Nukleinsäuren oder Proteinen. Im Vergleich zu synthetischen Polymeren ermöglichen proteinhaltige Bausteine eine präzise Kontrolle der entstehenden supramolekularen Strukturen6 auf genetischer Ebene. Die primäre Aminosäure(aa) Sequenz der einzelnen Proteinbausteine kodiert die Informationen für ihr Montagepotential von der molekularen bis zur makroskopischen Ebene sowie die dreidimensionale Form und physikalische Eigenschaften der endgültigen supramolekularen Struktur7.
Gemeldete Methoden zur Montage verschiedener supramolekularer Strukturen beinhalten oft amphiphile Proteine wie temperaturempfindliche Elastin-ähnliche Proteine (ELP)5,8,9, rekombinantes Oleosin10und künstliche Protein-Amphiphilen11. Temperaturausgelöste Methoden haben zur Montage von Mizellen geführt4,10,12Fasern13Blätter14und Vesikel9,15,16. Für die Bildung dynamischer proteinbasierter Vesikel wurden Methoden mit organischen Lösungsmitteln angewendet.8,11,14. Bisher fehlt es bei den angewandten Protokollen für die Vesikelbildung oft an Montagekontrolle über mikrometergroße Baugruppen.16,17oder haben eine begrenzte Montageausbeute5. Darüber hinaus haben einige berichtete ELP-basierte Vesikel ein beeinträchtigtes12oder begrenzte Stabilität im Laufe der Zeit9. Um diese Nachteile zu beheben, ermöglichen die vorgestellten Protokolle die Selbstmontage von mikrometer- und submikrometergroßen supramolekularen Strukturen mit ausgeprägten physiochemischen Eigenschaften, gutem Verkapselungspotenzial und Langzeitstabilität. Maßgeschneiderte amphiphile ELPs fügen sich zu supramolekularen Strukturen zusammen und reichen von kugelförmigen Coacervaten und hochgeordneten verdrehten Faserbündeln bis hin zu unilamelladervetriären Vesikeln, abhängig vom angewandten Protokoll und den damit verbundenen Umgebungsbedingungen. Große vesikuläre ProteinMembran-basierte Fächer (PMBC) zeigen alle Hauptphänotypen wie Membranfusion und Phasentrennungsverhalten analog zu Liposomen. PMBCs kapseln effizient chemisch vielfältige fluoreszierende Ladungsmoleküle, die mit einfacher Epifluoreszenzmikroskopie überwacht werden können. Die in dieser Studie verwendeten sich wiederholenden ELP-Domänen sind attraktive Bausteine für proteinbasierte supramolekulare Architekturen18. Die ELP-Pentapeptid-Wiederholungseinheit (VPGVG) ist dafür bekannt, neben Prolin an der vierten Position (Valin, V) unterschiedliche Aa zu tolerieren und dabei ihre strukturellen und funktionellen Eigenschaften zu erhalten.19. Das Design von amphiphilen ELPs, die ausgeprägte hydrophile und hydrophobe Domänen enthalten, wurde durch einfügen von Aa-Gastrückständen (X) in die VPGXG-Wiederholung mit ausgeprägter Hydrophobie, Polarität und Ladung realisiert.20. Amphiphile ELP-Domänen, die mit hydrophoberphenylalanin (F) oder Isoleucin (I) ausgestattet sind, während die hydrophile Domäne geladene Glutaminsäure (E) oder Arginin (R) als Gästerückstände enthielt. Eine Liste der förderfähigen amphiphilen ELP-Konstrukte und entsprechenden Aa-Sequenzen finden Sie in den ergänzenden Informationen und Referenzen8,21. Alle Bausteine sind entweder mit kleinen Fluoreszenzfarbstoffen oder fluoreszierenden Proteinen zur Visualisierung mittels Fluoreszenzmikroskopie ausgestattet. mEGFP und andere fluoreszierende Proteine wurden n-terminal mit den hydrophilen Domänen der ELP-Amphiphilen verschmolzen. Organische Farbstoffe wurden über kupferfreie Stämme konjugiert, die Alkyn-Azid-Cycloaddition (SPAAC) zu einer ko-translational eingeführten unnatürlichen Aminosäure (UAA) förderten. Die ko-translationale Einbeziehung der UAApara-Azidophenylalanin (pAzF)22ermöglicht die N-Terminal-Modifikation der hydrophilen ELP-Domäne. Auf diese Weise wird der grüne Fluoreszenzfarbstoff BDP-FL-PEG4-DBCO (BDP) oder jedes kleine fluoreszierende Molekül mit einem gespannten Zyklopädat kann als Fluoreszenzsonde verwendet werden. Erfolgreiche Einarbeitung des UAA pAzF und Cycloaddition des Farbstoffs über SPAAC kann durch effiziente Ionisierung der entsprechenden tryptischen Peptide einfach über LC-MS/MS bestätigt werden8. Dieser kleine organische Farbstoff wurde angewendet, um die Lösungsmittelauswahl für Montageprotokolle zu erweitern, da fluoreszierende Proteine mit den meisten organischen Lösungsmitteln nicht kompatibel sind. Die beiden effizientesten Montageprotokolle für supramolekulare Strukturen, die in unserem Labor entwickelt wurden, werden im Folgenden beschrieben. Die THF-Schwellungsmethode ist nur mit organischem Farbstoff modifiziertem amphiphilem ELP kompatibel. Im Gegensatz dazu ist die 1-Butanol-Extrusionsmethode (BuOH) mit vielen Proteinen wie fluoreszierender Sonde, z.B. mEGFP, kompatibel, da die beschriebene Methode die Fluoreszenz dieser Fusionsproteine vollständig bewahrt. Darüber hinaus funktioniert die Verkapselung kleiner Moleküle und das vesikuläre Fusionsverhalten am besten mit der BuOH-Extrusionsmethode.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1191px;" width="1191">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">1 &#181;m and 0.2 &#181;m Steril Filter</td>
			<td style="width:411px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">1,4-Dithiothreitol</td>
			<td style="width:411px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">1-butanol. &#62;99.5% p.a.</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">2log DNA ladder</td>
			<td style="width:411px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">50 mL Falcon tubes</td>
			<td style="width:411px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">79249 Alkyne Mega Stokes dye</td>
			<td style="width:411px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Acetic acid glacial</td>
			<td style="width:411px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Acetonitrile, anhydrous, 99.8%</td>
			<td style="width:411px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Ampicillin sodium-salt, 99%</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">BDP-FL-PEG4-DBCO</td>
			<td style="width:411px;">Jena Bioscience</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Biofuge</td>
			<td style="width:411px;">Heraeus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Bottle Top Filter with PES membrane (45 &#181;m, 22 &#181;m)</td>
			<td style="width:411px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Brillant Blue G250 (Coomassie)</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">BspQI</td>
			<td style="width:411px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Camera DS Qi1</td>
			<td style="width:411px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Centrifuge 5417r</td>
			<td style="width:411px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Centrifuge 5810r</td>
			<td style="width:411px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">CF-400-Cu square mesh copper grid</td>
			<td style="width:411px;">EMS</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Chloramphenicol</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">CompactStar CS 4</td>
			<td style="width:411px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Dextran, Texas Red, 3000 MW, neutral</td>
			<td style="width:411px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Digital sonifier</td>
			<td style="width:411px;">Branson</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:411px;">Applichem</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Dnase I</td>
			<td style="width:411px;">Applichem</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">EarI</td>
			<td style="width:411px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">EcoRI-HF</td>
			<td style="width:411px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Environmental shaker incubator ES-20</td>
			<td style="width:411px;">Biosan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Ethanol absolute</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Ethidium bromide solution</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Filter supports</td>
			<td style="width:411px;">Avanti</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Glass plates</td>
			<td style="width:411px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Glycerol Proteomics Grade</td>
			<td style="width:411px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Glycin</td>
			<td style="width:411px;">Applichem</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">H4-Azido-Phe-OH</td>
			<td style="width:411px;">Bachhem</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Heat plate MR HeiTec</td>
			<td style="width:411px;">Heidolph</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">HindIII</td>
			<td style="width:411px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">HisTrap FF crude column</td>
			<td style="width:411px;">GE Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Nickel column</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Hydrochloride acid fuming, 37%, p.a.</td>
			<td style="width:411px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Illuminator ix 20</td>
			<td style="width:411px;">INTAS</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Illuminator LAS-4000</td>
			<td style="width:411px;">Fujifilm</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Imidazole</td>
			<td style="width:411px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Immersions oil for microscopy</td>
			<td style="width:411px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Incubators shakers Unimax 1010</td>
			<td style="width:411px;">Heidolph</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Inkubator 1000</td>
			<td style="width:411px;">Heidolph</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">IPTG, &#62;99%</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Kanamycinsulfate</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">L(+)-Arabinose</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Laboratory scales Extend ed2202s/224s-OCE</td>
			<td style="width:411px;">Sartorius</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">LB-Medium</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Lyophilizer Alpha 2-4 LSC</td>
			<td style="width:411px;">Christ</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Lysozyme, 20000 U/mg</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Microscope CM 100</td>
			<td style="width:411px;">Philips</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Microscope Eclipse TS 100</td>
			<td style="width:411px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Microscopy cover glasses (15 x 15 mm)</td>
			<td style="width:411px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Microscopy slides</td>
			<td style="width:411px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Microwave</td>
			<td style="width:411px;">Studio</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Mini-Extruder Set</td>
			<td style="width:411px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">NaCl, &#62;99.5%, p.a.</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Natriumhydroxid pellets</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Ni-NTA Agarose, PerfectPro</td>
			<td style="width:411px;">5 Prime</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Nucleopore Track-Etch Membrane</td>
			<td style="width:411px;">Avanti</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">PH meter 766 calimatic</td>
			<td style="width:411px;">Knick</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Phenylmethylsulfonylflourid (PMSF)</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Polypropylene Columns (1 mL)</td>
			<td style="width:411px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">PowerPac basic</td>
			<td style="width:411px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Propanol-2-ol</td>
			<td style="width:411px;">Emplura</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Protein ladder 10-250 kDa</td>
			<td style="width:411px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Recirculating cooler F12</td>
			<td style="width:411px;">Julabo</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Reinforcement rings</td>
			<td style="width:411px;">Herma</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">SacI HF</td>
			<td style="width:411px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">SDS Pellets</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Sodiumdihydrogen phosphate dihydrate, NaH2PO4</td>
			<td style="width:411px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Sterile syringe filter 0.2 mm Cellulose Acetate</td>
			<td style="width:411px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td style="width:411px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">TEMED</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">TexasRed Dextran-Conjugate</td>
			<td style="width:411px;">MolecularProbes</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Thermomix comfort</td>
			<td style="width:411px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">THF, &#62;99.5% p.a.</td>
			<td style="width:411px;">Acros</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Triton X 100</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Trypton/Pepton from Casein</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Ultrasonic cleaner</td>
			<td style="width:411px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Urea p.a.</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Vacuum pump 2.5</td>
			<td style="width:411px;">Vacuubrand</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">XbaI</td>
			<td style="width:411px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">XhoI</td>
			<td style="width:411px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">ZelluTrans regenerated cellulose tubular membrane (12.0 S/ 3.5 S/ 1.0 V)</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

directed assembly of elastin-like proteins into defined supramolecular structures and cargo encapsulation in vitro

Maßgeschneiderte proteinhaltige Bausteine sind vielseitige Kandidaten für die Montage supramolekularer Strukturen wie Minimalzellen, Wirkstoffabgabefahrzeuge und Enzymgerüste. Aufgrund ihrer Biokompatibilität und Tunabilität auf genetischer Ebene sind Elastin-ähnliche Proteine (ELP) ideale Bausteine für biotechnologische und biomedizinische Anwendungen. Dennoch bleibt die Montage von proteinbasierten supramolekularen Strukturen mit ausgeprägten physiochemischen Eigenschaften und gutem Verkapselungspotenzial eine Herausforderung.
Hier bieten wir zwei effiziente Protokolle für die geführte Selbstmontage von amphiphilen ELPs in supramolekulare Proteinarchitekturen wie sphärische Coacervate, Fasern und stabile Vesikel. Die vorgestellten Montageprotokolle erzeugen Proteinmembran-basierte Fächer (PMBCs) auf Basis von ELPs mit anpassungsfähigen physikalisch-chemischen Eigenschaften. PMBCs zeigen Phasentrennungsverhalten und zeigen eine methodenabhängige Membranfusion auf und sind in der Lage, chemisch unterschiedliche fluoreszierende Ladungsmoleküle zu verkapseln. Die resultierenden PMBCs haben ein hohes Anwendungspotenzial als Wirkstoffformulierungs- und Abgabeplattform, künstliche Zelle und abgeschotteten Reaktionsraum.

Protokollentwicklung für die Vesikelproduktion Abbildung 1 zeigt die beiden verschiedenen Vesikelvorbereitungsmethoden. Die THF-Schwellungsmethode auf der linken Seite besteht aus drei aufeinanderfolgenden Schritten und führt je nach Temperatur zu unterschiedlichen supramolekularen Baugruppen des ELP. In Abbildung 1A zeigen Epifluoreszenzmikroskopiebilder Vesikel, die aus BDP-R20F20 zusammengesetzt sind, und fib...

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Directed Assembly of Elastin-like Proteins into defined Supramolecular Structures and Cargo Encapsulation In Vitro

An der Schnittstelle von organischen und wässrigen Lösungsmitteln fügen sich maßgeschneiderte amphiphile Elastin-ähnliche Proteine zu komplexen supramolekularen Strukturen wie Vesikeln, Fasern und Koacervaten zusammen, die durch Umweltparameter ausgelöst werden. Die beschriebenen Montageprotokolle ergeben Proteinmembran-basierte Fächer (PMBCs) mit abstimmbaren Eigenschaften, die die Verkapselung verschiedener Ladungen ermöglichen.

Gerichtete Montage von Elastin-ähnlichen Proteinen in definierte supramolekulare Strukturen und Cargo-Verkapselung In Vitro

Tailored proteinaceous building blocks are versatile candidates for the assembly of supramolecular structures such as minimal cells, drug delivery ...

Die effiziente Montage supramolekularer Strukturen für minimalezellige Gestaltung und Medikamentenabgabe bleibt eine Herausforderung. Hier zeigen wir effiziente Protokolle, die supramolekulare Strukturen auf Basis amphiphiler Elastin-ähnlicher Proteine ergeben. Die vorgestellten Montageprotokolle erzeugen vielseitige supramolekulare Strukturen mit anpassungsfähigen physikalisch-chemischen Eigenschaften wie Vesikel, Fasern und Koacervate.Proteinmembranbasierte Kompartimente demonstrieren Phasentrennungsverhalten und ermöglichen die Verkapselung chemisch vielfältiger fluoreszierender Ladungsmoleküle. Für den Ausdruck von F20E20-mEGFP und F20E20-mCherry, impfen Sie die Hauptausdruckskultur von der Übernacht-Vorkultur zu einem OD600 von 0,3. Inkubieren Sie es in 400 Milliliter sterilem LB-Medium, ergänzt mit entsprechenden Antibiotika bei 37 Grad Celsius und 200 Umdrehungen pro Minute.Wenn die Ausdruckskultur OD600 von 0,5 bis 0,8 erreicht, fügen Sie IPTG zu einer Endkonzentration von einem Millimolar hinzu und reduzieren Sie die Inkubationstemperatur auf 20 Grad Celsius. Zur Expression des amphiphilen ELP mit der unnatürlichen Aminosäure impfen Sie die Hauptexpressionskultur von der E.coli-Präkultur über Nacht, die die entsprechenden Plasmide enthält, bis zu einem OD von 0,3. Inkubieren Sie es in 400 Milliliter sterilem LB-Medium, ergänzt mit Kanamycin und Chloramphenicol bei 37 Grad Celsius und 200 Rpm.Um den 100-Millimolaren unnatürlichen Aminosäurebestand vorzubereiten, fügen Sie 206,2 Milligramm unnatürliche Aminosäure zu acht MilliliterRinpurwasser hinzu. Den pH-Wert der Lösung mit dreimolarem Natriumhydroxid anheben und kräftig mischen. Wenn die unnatürliche Aminosäure gelöst ist, senken Sie den pH-Wert auf ca. 10,5 und fügen Sie ein Volumen von 10 Millilitern Ultrareinstwasser hinzu.Filtern Sie die Lösung mit einem sterilen 0,22-Mikrometer-Filter und aliquotieren Sie sie in Zwei-Milliliter-Reaktionsröhren. Wenn die Expressionskultur OD600 von 0,5 bis 0,8 erreicht, fügen Sie die unnatürliche Aminosäure zu einer Endkonzentration von zwei Millimolar hinzu. Inkubieren Sie es für 10 weitere Minuten.Dann induzieren Expression des Zielproteins und die notwendige tRNA-Synthetase durch gleichzeitige Zugabe von IPTG und Arabinose. Reduzieren Sie die Inkubationstemperatur auf 20 Grad Celsius, und lassen Sie den Ausdruck für etwa 20 Stunden fortsetzen. Nach der Inkubation die Zellen durch Zentrifugieren bei vier Grad Celsius und 4000 mal g für 40 Minuten ernten.Setzen Sie das Zellpellet im Lysepuffer mit Lysozym und PMSF wieder auf. Inkubieren Sie die Lösung für 30 Minuten auf Eis. Dann einfrieren und zweimal auftauen, indem Sie in flüssigen Stickstoff eintauchen.Sonicatdie Suspension, und löschen Sie das Lysat durch Zentrifugation bei 10 000 mal g und vier Grad Celsius für 40 Minuten. Dann reinigen Sie das Protein mit Affinitätschromatographie. Nach der Proteinelution bei vier Grad Celsius bis zur weiteren Verwendung lagern.Fügen Sie einen Mikroliter Fluoreszenzfarbstoff zu 500 Mikroliter ELP-Lösung hinzu und inkubieren Sie die Reaktion für etwa 10 Stunden bei 15 Grad Celsius, während Sie in einem ThermoMixer schütteln, um sie vor Licht zu schützen. Um übermäßigen Fluoreszenzfarbstoff zu entfernen, gleichziehen Sie eine Dialysemembran in Reinstwasser für 10 Minuten. Schneiden Sie die Membran in die richtige Größe, um mit der angeklickten ELP-Lösung auf die Öffnung des Reaktionsrohrs gelegt zu werden.Befestigen Sie dann die Membran an der Öffnung, indem Sie das Rohr mit einem Deckel schließen, der keinen Kern hat. Füllen Sie den Raum zwischen Deckel und Membran mit Puffer, um das Abfangen von Luft zu verhindern. Legen Sie dann das Reaktionsrohr in den gewählten Puffer, drücken Sie es unter die Oberfläche und drehen Sie es auf den Kopf.Führen Sie die Dialyse mindestens drei Stunden bei vier Grad Celsius durch, sodass die Dialyse nach jedem Pufferwechsel noch mindestens drei Stunden andauern kann. Bei THF-Schwellungen die homogene ELP-Lösung gegen Phosphat oder Tris-Puffer mit stabilem pH-Wert 7,5 dialysieren. Bereiten Sie den Lyophilisator vor und kühlen Sie ihn auf Die Anfangstemperatur für die Gefriertrocknung.Aliquot die dialysierte Proteinlösung in 1,5-Milliliter-Reaktionsröhren und versiegeln Sie sie mit Kappen mit einem kleinen Loch, um zu vermeiden, dass die feste Probe durch Druckänderungen im Verlauf der Gefriertrocknung verloren geht. Schock-Einfrieren der Proben in flüssigem Stickstoff. Nehmen Sie die gefrorenen Proteinproben aus dem flüssigen Stickstoff und legen Sie sie sofort in den Lyophilisator, um mit der Gefriertrocknung zu beginnen.Nachdem die Probe vollständig trocken ist, belüften Sie sie mit trockenem Stickstoff, und schließen Sie sofort die Reaktionsrohrdeckel, um den Kontakt mit Luftfeuchte zu vermeiden. Fügen Sie den lyophilisierten Proben reines THF hinzu und legen Sie die Lösung 15 Minuten lang in einen Wasserbadbeschalltoner mit Eiswasser. Einen Thermocycler für die Vesikelbildung auf 30 bis 60 Grad Celsius vorheizen oder bis zu 90 Grad Celsius für die Faserbildung vorheizen und neue Reaktionsrohre mit Reinstwasser oder Puffer vorbereiten.Nach der Beschallung die ELP/THF-Lösung und das vorbereitete Wasser oder den Puffer fünf Minuten lang in den Thermocycler geben. Dann stifizieren Sie die ELP-Lösung auf das Wasser oder den Puffer, um sicherzustellen, dass die Trennung der beiden Phasen und eine deutliche Interphase sichtbar ist, und legen Sie das Gemisch wieder in den Thermocycler. Lassen Sie die Probe bei Raumtemperatur 10 Minuten abkühlen und fahren Sie mit der Dialyse gegen Wasser oder Puffer oder mit Fluoreszenzmikroskopie fort.Bereiten Sie eine EIN- bis 50-Mikromolar-ELP-Lösung vor und fügen Sie 10 bis 20%1-Butanol hinzu. Mischen Sie die Lösung sofort, indem Sie nach oben und unten pfeifen. Die Trübung der Lösung sollte während des Mischens zunehmen, was auf die Vesikelbildung hindeutet.Um eine schmale Größenverteilung zu erreichen, extrudieren Sie Vesikel mit einem Miniextruder durch eine Membran mit einer Porengröße von einem Mikrometer. Für die Färbeverkapselung ca. 40 Mikroliter ELP-Lösung in 10-Millimolar Tris-HCl mit einem Mikroliter Dextran Texas Red Stofflösung in DMSO mischen. 10 Mikroliter 1-Butanol hinzufügen und fünf- bis zehnmal durch eine Spritze extrudieren, die mit einer 0,25 mal 25-Millimeter-Nadel ausgestattet ist.Die THF-Schwellungsmethode besteht aus drei aufeinanderfolgenden Schritten und führt je nach Temperatur zu unterschiedlichen supramolekularen Baugruppen des ELP. Die Epifluoreszenzmikroskopiebilder zeigen Vesikel aus BDP-R20F20 und fibrilläre Strukturen aus BDP-R40F20. Die 1-Butanol-Extrusionsmethode führt ausschließlich zur Bildung von ELP-Vesikeln.Etwa zwei Größenordnungen mehr Vesikel werden im Vergleich zur THF-Schwellungsmethode produziert. BDP-R40F20 wurde mit 10 bis 15% Butanol gemischt, und Vesikel wurden über die Extrusion der Mischung hergestellt. Aus BDP-R40F20 wurden über das THF-Schwellungsprotokoll verschiedene supramolekulare Strukturen zusammengesetzt.Der pH-Wert des Puffers und die Temperatur des Montageprozesses wurden so eingestellt, dass sie entweder Koacervate, Fibrillen oder Vesikel bilden. Kleine Fehler im Montageprotokoll können zur Bildung von Aggregaten führen. Positiv geladener Farbstoff ATTO Rho 13 und das Polysaccharid dextran red 3000 wurden in das Lumen von Vesikeln eingekapselt, die aus F20R20-mEGFP über das 1-Butanol-Extrusionsverfahren zusammengesetzt wurden.Konfokale Mikroskopiebilder zeigen die Vesikel im grünen Kanal, die Ladung im roten Kanal und die erfolgreiche Verkapselung im resultierenden zusammengeführten Kanal. Das Phasentrennungs- und Fusionsverhalten von ELP-Amphiphilen beim Mischen einzelner PMBC-Bausteine mit montierten PMBC-Populationen wurde ebenfalls demonstriert. Das Mischen vor der PMBC-Montage führt zu homogen verteilten Molekülen innerhalb der montierten PMBC-Membran, während das Mischen von zusammengesetzten Vesikelpopulationen zu Membranflecken mit roter oder grüner Fluoreszenz führt, die mindestens 20 Minuten lang sichtbar sind.Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, auf die richtige Schrittreihenfolge und die Unterschiede zwischen der THF-Schwellungsmethode und der Butanolextrusionsmethode zu achten. Nach diesem Protokoll können die ELP-Vesikel als Arzneimittelabgabe-Shuttles, als Plattform für enzymatische Reaktionen wie In-vitro-Transkription und -Übersetzung oder bei der Bildung synthetischer Minimalzellen verwendet werden.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Formation of Ordered Biomolecular Structures by the Self-assembly of Short Peptides

Bildung geordneter Strukturen Biomolekulare durch die Selbstorganisation von kurzen Peptiden

In nature, complex functional structures are formed by the self-assembly of biomolecules under mild conditions. Understanding the forces that control ...

Forschung

Chemie

In Situ SIMS and IR Spectroscopy of Well-defined Surfaces Prepared by Soft Landing of Mass-selected Ions

In Situ SIMS and IR Spectroscopy of Well-defined Surfaces Prepared by Soft Landing of Mass-selected Ions

In-situ-SIMS und IR-Spektroskopie von gut definierten Oberflächen durch weiche Landung der Messe-Ionen ausgewählt Vorbereitet

Soft landing of mass-selected ions onto surfaces is a powerful approach for the highly-controlled preparation of materials that are inaccessible using ...

Atomically Defined Templates for Epitaxial Growth of Complex Oxide Thin Films

Atomar definierte Vorlagen Epitaxieausrüstung komplexer Oxide Thin Films

Atomically defined substrate surfaces are prerequisite for the epitaxial growth of complex oxide thin films. In this protocol, two approaches to obtain ...

Construction and Systematical Symmetric Studies of a Series of Supramolecular Clusters with Binary or Ternary Ammonium Triphenylacetates

Ausbau und Systematische Symmetric Studien auf eine Serie von supramolekularen Cluster mit binären oder ternären Ammonium Triphenylacetates

Functions of clusters in nano or sub-nano scale significantly depend on not only kinds of their components but also arrangements, or symmetry, of their ...

Encapsulation of Cancer Therapeutic Agent Dacarbazine Using Nanostructured Lipid Carrier

Verkapselung von Krebstherapeutikum Dacarbazin Verwendung von Nanostrukturierte Lipid-Träger

The only formula of dacarbazine (Dac) in clinical use is intravenous infusion, presenting a poor therapeutic profile due to the low dispersity of the drug ...

Synthesis and Characterization of Supramolecular Colloids

Synthese und Charakterisierung von supramolekularen Kolloid-

Control over colloidal assembly is of utmost importance for the development of functional colloidal materials with tailored structural and mechanical ...

Site Directed Spin Labeling and EPR Spectroscopic Studies of Pentameric Ligand-Gated Ion Channels

Site-Directed Spin Labeling und EPR-spektroskopischen Untersuchungen von pentamerem liganden-gesteuerten Ionenkanäle

Ion channel gating is a stimulus-driven orchestration of protein motions that leads to transitions between closed, open, and desensitized states. ...

Highly Stable, Functional Hairy Nanoparticles and Biopolymers from Wood Fibers: Towards Sustainable Nanotechnology

Hochstabile, funktionelle Hairy Nanopartikel und Biopolymere aus Holzfasern für eine nachhaltige Nanotechnologie

Nanoparticles, as one of the key materials in nanotechnology and nanomedicine, have gained significant importance during the past decade. While ...

From Molecules to Materials: Engineering New Ionic Liquid Crystals Through Halogen Bonding

Von Molekülen zu Materialien: neue ionische Flüssigkristalle durch Halogen-Bonding Technik

Herein, we demonstrate that a bottom-up approach, based on halogen bonding (XB), can be successfully applied for the design of a new type of ionic liquid ...