Name: directed assembly of elastin-like proteins into defined supramolecular structures and cargo encapsulation in vitro
Uploaded: 2020-04-08T14:00:00
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저자는 재정 지원을 위한 BMBF및 생물학 시스템 분석 센터 (ZBSA)를 위한 연구 시설을 제공하기위한 감사합니다. 우리는 P. G. 슐츠, TSRI, 라 호야, 캘리포니아, 플라스미드 pEVOL-pAzF를 제공에 감사드립니다. 우리는 알버트 루드비히스 대학 프라이부르크의 생물 학적 시스템 분석 센터 (ZBSA)의 생명 이미징 센터 (LIC)의 직원에게 공초점 현미경 자원에 대한 도움과 이미지 기록에 대한 탁월한 지원에 감사드립니다.

1. 양과성 엘라스틴과 같은 단백질의 설계 및 복제 (ELP)
<ol><li>다른 곳에서 설명한 대로 구성을 복제하고디자인합니다 8,,20. 플라스미드는 요청 시 이용 가능합니다.</li>
</ol>2. 단백질 발현, 정제 및 준비
<ol><li>F20E20-mEGFP 및 F20E20-mCherry의 표현<ol>
<li>하룻밤 사전 배양에서 0.3의 OD600까지 메인 발현 배양액을 접종합니다. 37°C에서...

<ol>
	<li>Elzoghby, A. O., Samy, W. M., Elgindy, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-based+nanocarriers+as+promising+drug+and+gene+delivery+systems.">Protein-based nanocarriers as promising drug and gene delivery systems.</a> Journal of Controlled Release. 161 (1), 38-49 (2012).</li><li>Jang, Y., Champion, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-Assembled+Materials+Made+from+Functional+Recombinant+Proteins.">Self-Assembled Materials Made from Functional Recombinant Proteins.</a> Accounts of Chemical Research. 49 (10), 2188-2198 (2016).</li><li>Timmermans, S. B. P. E., van Hest, J. C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+nanoreactors+based+on+peptides+and+proteins.">Self-assembled nanoreactors based on peptides and proteins.</a> Current Opinion in Colloid &amp; Interface Science. 35, 26-35 (2018).</li><li>Dreher, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+Triggered+Self-Assembly+of+Polypeptides+into+Multivalent+Spherical+Micelles.">Temperature Triggered Self-Assembly of Polypeptides into Multivalent Spherical Micelles.</a> Journal of the American Chemical Society. 130 (2), 687-694 (2008).</li><li>Huber, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+amphiphilic+proteins+as+building+blocks+for+the+intracellular+formation+of+organelle-like+compartments.">Designer amphiphilic proteins as building blocks for the intracellular formation of organelle-like compartments.</a> Nature Materials. 14 (1), 125-132 (2014).</li><li>Matsuurua, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+self-assembled+proteins+and+peptides+for+nano-+and+micro-sized+architectures.">Rational design of self-assembled proteins and peptides for nano- and micro-sized architectures.</a> RSC Advances. 4 (6), 2942-2953 (2013).</li><li>Rocklin, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+protein+folding+using+massively+parallel+design,+synthesis,+and+testing.">Global analysis of protein folding using massively parallel design, synthesis, and testing.</a> Science. 357 (6347), 168-175 (2017).</li><li>Schreiber, A., St&#252;hn, L. G., Huber, M. C., Geissinger, S. E., Rao, A., Schiller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-Assembly+Toolbox+of+Tailored+Supramolecular+Architectures+Based+on+an+Amphiphilic+Protein+Library.">Self-Assembly Toolbox of Tailored Supramolecular Architectures Based on an Amphiphilic Protein Library.</a> Small. 15 (30), 1900163 (2019).</li><li>Jang, Y., Hsieh, M. -. C., Dautel, D., Guo, S., Grover, M. A., Champion, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+Coacervate-to-Vesicle+Transition+of+Globular+Fusion+Proteins+to+Engineer+Protein+Vesicle+Size+and+Membrane+Heterogeneity.">Understanding the Coacervate-to-Vesicle Transition of Globular Fusion Proteins to Engineer Protein Vesicle Size and Membrane Heterogeneity.</a> Biomacromolecules. 20 (9), 3494-3503 (2019).</li><li>Vargo, K. B., Sood, N., Moeller, T. D., Heiney, P. A., Hammer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spherical+micelles+assembled+from+variants+of+recombinant+oleosin.">Spherical micelles assembled from variants of recombinant oleosin.</a> Langmuir: the ACS journal of surfaces and colloids. 30 (38), 11292-11300 (2014).</li><li>Bellomo, E. G., Wyrsta, M. D., Pakstis, L., Pochan, D. J., Deming, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimuli-responsive+polypeptide+vesicles+by+conformation-specific+assembly.">Stimuli-responsive polypeptide vesicles by conformation-specific assembly.</a> Nature Materials. 3 (4), 244-248 (2004).</li><li>Mart&#237;n, L., Castro, E., Ribeiro, A., Alonso, M., Rodr&#237;guez-Cabello, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-Triggered+Self-Assembly+of+Elastin-Like+Block+Co-Recombinamers:The+Controlled+Formation+of+Micelles+and+Vesicles+in+an+Aqueous+Medium.">Temperature-Triggered Self-Assembly of Elastin-Like Block Co-Recombinamers:The Controlled Formation of Micelles and Vesicles in an Aqueous Medium.</a> Biomacromolecules. 13 (2), 293-298 (2012).</li><li>Li, Y., Rodriguez-Cabello, J. C., Aparicio, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrafibrillar+Mineralization+of+Self-Assembled+Elastin-Like+Recombinamer+Fibrils.">Intrafibrillar Mineralization of Self-Assembled Elastin-Like Recombinamer Fibrils.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. , (2017).</li><li>Vargo, K. B., Parthasarathy, R., Hammer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembly+of+tunable+protein+suprastructures+from+recombinant+oleosin.">Self-assembly of tunable protein suprastructures from recombinant oleosin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (29), 11657-11662 (2012).</li><li>Park, W. M., Champion, J. 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(148), e59831 (2019).</li><li>Huber, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+amphiphilic+proteins+as+building+blocks+for+the+intracellular+formation+of+organelle-like+compartments.">Designer amphiphilic proteins as building blocks for the intracellular formation of organelle-like compartments.</a> Nature Materials. 14 (1), 125-132 (2015).</li><li>Urry, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastin:+a+representative+ideal+protein+elastomer.">Elastin: a representative ideal protein elastomer.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 357 (1418), 169-184 (2002).</li><li>Huber, M. C., Schreiber, A., Wild, W., Benz, K., Schiller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introducing+a+combinatorial+DNA-toolbox+platform+constituting+defined+protein-based+biohybrid-materials.">Introducing a combinatorial DNA-toolbox platform constituting defined protein-based biohybrid-materials.</a> Biomaterials. 35 (31), 8767-8779 (2014).</li><li>Schreiber, A., Huber, M. C., Schiller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prebiotic+Protocell+Model+Based+on+Dynamic+Protein+Membranes+Accommodating+Anabolic+Reactions.">Prebiotic Protocell Model Based on Dynamic Protein Membranes Accommodating Anabolic Reactions.</a> Langmuir. 35 (29), 9593-9610 (2019).</li><li>Chin, J. W., Santoro, S. W., Martin, A. B., King, D. S., Wang, L., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addition+of+p-Azido-l-phenylalanine+to+the+Genetic+Code+of+Escherichia+coli.">Addition of p-Azido-l-phenylalanine to the Genetic Code of Escherichia coli.</a> Journal of the American Chemical Society. 124 (31), 9026-9027 (2002).</li><li>Sonnino, S., Prinetti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+domains+and+the+"lipid+raft"+concept.">Membrane domains and the "lipid raft" concept.</a> Current Medicinal Chemistry. 20 (1), 4-21 (2013).</li><li>Br&#228;se, S., Gil, C., Knepper, K., Zimmermann, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organische+Azide+-+explodierende+Vielfalt+bei+einer+einzigartigen+Substanzklasse.">Organische Azide - explodierende Vielfalt bei einer einzigartigen Substanzklasse.</a> Angewandte Chemie. 117 (33), 5320-5374 (2005).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-Scale+Structures+in+Tetrahydrofuran&#8211;Water+Mixture+with+a+Trace+Amount+of+Antioxidant+Butylhydroxytoluene+(BHT).">Large-Scale Structures in Tetrahydrofuran&#8211;Water Mixture with a Trace Amount of Antioxidant Butylhydroxytoluene (BHT).</a> The Journal of Physical Chemistry B. 115 (24), 7887-7895 (2011).</li><li>Huber, M. C., Schreiber, A., Schiller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimalist+Protocell+Design:+A+Molecular+System+Based+Solely+on+Proteins+that+Form+Dynamic+Vesicular+Membranes+Embedding+Enzymatic+Functions.">Minimalist Protocell Design: A Molecular System Based Solely on Proteins that Form Dynamic Vesicular Membranes Embedding Enzymatic Functions.</a> ChemBioChem. 20 (20), 2618-2632 (2019).</li><li>Raghunathan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+on+the+stability+and+structure+of+two+different+green+fluorescent+proteins+in+organic+co-solvent+systems.">A comparative study on the stability and structure of two different green fluorescent proteins in organic co-solvent systems.</a> Biotechnology and Bioprocess Engineering. 18 (2), 342-349 (2013).</li><li>Sallach, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+biostability+of+self-assembling+protein+polymers+in+the+absence+of+covalent+crosslinking.">Long-term biostability of self-assembling protein polymers in the absence of covalent crosslinking.</a> Biomaterials. 31 (4), 779-791 (2010).</li></ol>

정의된 상분자 구조의 조립을 위한 기재된 프로토콜을 따르는 동안 결함은 주로 비특이적 응집체의형성(도 2,IV) 또는 균질적으로 분포된 ELP-양서류에 이르게 한다. 프로토콜의 중요한 단계는 다음과 같습니다.
양서류 ELP의 높은 발현 수율을 위해 20°C의 비교적 낮은 온도가 최적입니다. 양과성 ELP의 성공적인 친화도 기반 정제를 위해 용해 완충액에서 4M?...

생명 공학 응용 프로그램에 대한 상분 분자 구조의 조립은 점점 더 중요해지고있다1,,2,,3,,4,,5. 원하는 물리 화학적 특성을 가진 코서바트, 소포 및 섬유와 같은 기능적 아키텍처의 조립을 위해 구성 요소의 물리 화학적 및 형태적 특성을 이해하고 제어하는 것이 중요합니다. 자연에서 발견되는 분자의 분자 정밀도로 인해, 상분 분자 구조에 대한 빌딩 블록은 점점 지질, 핵산 또는 단백질에 기초하고 있습니다. 합성 폴리머에 비해, 단백질 구성 요소는 유전 수준에서 응급 최후의 분자 구조6에 대한 정확한 제어를 할 수 있습니다. 개별 단백질 빌딩 블록의 1차 아미노산(aa) 서열은 최종 초분자구조의3차원 형상 및 물성뿐만 아니라 거시적 수준까지의 분자로부터 그들의 조립 전위성에 대한 정보를 본질적으로 인코딩한다.
다른 상분 분자 구조의 조립을위한보고 된 방법은 종종 온도에 민감한 엘라스틴과 같은 단백질 (ELP)과 같은 양과 성 단백질을 포함5,8,9, 재조합 올레오신10및 인공 단백질 양서류11. 온도 트리거 방법은 미셀의 조립을 주도하고있다4,10,12섬유13시트14및 소포9,15,16. 유기 용매와 관련된 방법은 동적 단백질 기반 소포의 형성을 위해 적용되었습니다.8,11,14. 지금까지 소포 형성을 위한 응용 프로토콜은 마이크로미터 크기의 어셈블리에 대한 조립 제어가 부족한 경우가 많습니다.16,17또는 조립 수율이 제한되어 있습니다.5. 또한, 일부 보고 ELP 기반 소포 는 캡슐화 잠재력을 손상12또는 시간이 지남에 따라 제한된 안정성9. 이러한 단점을 해결하는 제시된 프로토콜은 뚜렷한 물리화학적 특성, 양호한 캡슐화 잠재력 및 장시간 안정성을 갖춘 마이크로미터 및 서브 마이크로미터 크기의 초분자 구조의 자체 조립을 가능하게 합니다. 맞춤형 양서류 ELP는 구형 응고체와 고도로 주문된 꼬인 섬유 번들에서 적용된 프로토콜 및 관련 환경 조건에 따라 unilamellar 소포에 이르기까지 다양한 범위의 상분자 구조로 조립됩니다. 큰 수피 단백질 막 기지를 둔 구획 (PMBC)는 리포좀과 유사한 막 융합 및 상 분리 행동과 같은 모든 주요 표현형을 밝힙니다. PMBC는 간단한 epifluorescence 현미경 검사법을 사용하여 모니터링할 수 있는 화학적으로 다양한 형광화물 분자를 효율적으로 캡슐화합니다. 이 연구에서 사용되는 반복적 인 ELP 도메인은 단백질 기반의 초분자 아키텍처를위한 매력적인 빌딩 블록입니다.18. ELP 펜타펩타이드 반복 유닛(VPGVG)은 구조적 및 기능적 특성을 유지하면서 네 번째 위치(발린, V)에서 프롤린 외에 다른 aa를 견딜 수 있는 것으로 알려져 있습니다.19. 특유의 친수성 및 소수성 도메인을 포함하는 양과성 ELP의 설계는 뚜렷한 소수성, 극성 및 전하를 가진 VPGXG 반복에 aa 게스트 잔류물 (X)을 삽입함으로써 실현되었습니다.20. 친수성 도메인이 충전된 글루탐산(E) 또는 아르기닌(R)을 게스트 잔류물로 함유하는 동안 소수성 페닐알라닌(F) 또는 이솔루신(I)을 구비한 양과성 ELP 도메인. 적격 한 양과 성 ELP 구문 및 해당 aa 시퀀스의 목록은 보충 정보 및 참조에서 찾을 수 있습니다.8,21. 형광 현미경 검사법을 통해 시각화를 위한 작은 형광 염료 또는 형광 단백질을 갖춘 모든 빌딩 블록. mEGFP 및 기타 형광 단백질은 ELP 양서류의 친수성 도메인에 N-말단 융합되었다. 유기 염료는 구리가 없는 균주를 통해 공액화되었고 알키네-아지드 사이클로아더(SPAAC)를 동시 도입된 부자연 아미노산(UAA)으로 촉진시켰다. UAA의 공동 번역 편입para-아지도페닐알라닌 (파즈프)22친수성 ELP 도메인의 N 말단 수정을 허용합니다. 이에 녹색 형광염료 BDP-FL-PEG4-DBCO(BDP) 또는 변형된 사이클로크틴을 가진 임의의 작은 형광 분자는 형광 프로브로서 사용될 수 있다. UAA pAzF의 성공적인 통합과 SPAAC를 통한 염료의 사이클로추가는 해당 트립틱 펩타이드의 효율적인 이온화로 인해 LC-MS/MS를 통해 쉽게 확인할 수 있습니다.8. 이 작은 유기 염료는 형광 단백질이 대부분의 유기 용매와 호환되지 않으므로 조립 프로토콜에 대한 용매 선택을 넓히기 위해 적용되었습니다. 실험실에서 개발된 상분자 구조에 대한 가장 효율적인 조립 프로토콜 2개는 아래에 설명되어 있습니다. THF 팽윤 방법은 유기 염료 변형 양과성 ELP와만 호환됩니다. 대조적으로, 1-부탄올(BuOH) 압출 방법은 형광 프로브와 같은 많은 단백질과 호환되며, 예를 들어 mEGFP, 기재된 방법은 이들 융합 단백질의 형광을 완전히 보존하기 때문이다. 또한, 소분자 및 수혈융합 거동을 캡슐화하는 것은 BuOH 압출 방법을 채택함으로써 가장 잘 작동한다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1191px;" width="1191">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">1 &#181;m and 0.2 &#181;m Steril Filter</td>
			<td style="width:411px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">1,4-Dithiothreitol</td>
			<td style="width:411px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">1-butanol. &#62;99.5% p.a.</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">2log DNA ladder</td>
			<td style="width:411px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">50 mL Falcon tubes</td>
			<td style="width:411px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">79249 Alkyne Mega Stokes dye</td>
			<td style="width:411px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Acetic acid glacial</td>
			<td style="width:411px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Acetonitrile, anhydrous, 99.8%</td>
			<td style="width:411px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Ampicillin sodium-salt, 99%</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">BDP-FL-PEG4-DBCO</td>
			<td style="width:411px;">Jena Bioscience</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Biofuge</td>
			<td style="width:411px;">Heraeus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Bottle Top Filter with PES membrane (45 &#181;m, 22 &#181;m)</td>
			<td style="width:411px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Brillant Blue G250 (Coomassie)</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">BspQI</td>
			<td style="width:411px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Camera DS Qi1</td>
			<td style="width:411px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Centrifuge 5417r</td>
			<td style="width:411px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Centrifuge 5810r</td>
			<td style="width:411px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">CF-400-Cu square mesh copper grid</td>
			<td style="width:411px;">EMS</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Chloramphenicol</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">CompactStar CS 4</td>
			<td style="width:411px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Dextran, Texas Red, 3000 MW, neutral</td>
			<td style="width:411px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Digital sonifier</td>
			<td style="width:411px;">Branson</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:411px;">Applichem</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Dnase I</td>
			<td style="width:411px;">Applichem</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">EarI</td>
			<td style="width:411px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">EcoRI-HF</td>
			<td style="width:411px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Environmental shaker incubator ES-20</td>
			<td style="width:411px;">Biosan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Ethanol absolute</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Ethidium bromide solution</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Filter supports</td>
			<td style="width:411px;">Avanti</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Glass plates</td>
			<td style="width:411px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Glycerol Proteomics Grade</td>
			<td style="width:411px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Glycin</td>
			<td style="width:411px;">Applichem</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">H4-Azido-Phe-OH</td>
			<td style="width:411px;">Bachhem</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Heat plate MR HeiTec</td>
			<td style="width:411px;">Heidolph</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">HindIII</td>
			<td style="width:411px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">HisTrap FF crude column</td>
			<td style="width:411px;">GE Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Nickel column</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Hydrochloride acid fuming, 37%, p.a.</td>
			<td style="width:411px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Illuminator ix 20</td>
			<td style="width:411px;">INTAS</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Illuminator LAS-4000</td>
			<td style="width:411px;">Fujifilm</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Imidazole</td>
			<td style="width:411px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Immersions oil for microscopy</td>
			<td style="width:411px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Incubators shakers Unimax 1010</td>
			<td style="width:411px;">Heidolph</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Inkubator 1000</td>
			<td style="width:411px;">Heidolph</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">IPTG, &#62;99%</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Kanamycinsulfate</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">L(+)-Arabinose</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Laboratory scales Extend ed2202s/224s-OCE</td>
			<td style="width:411px;">Sartorius</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">LB-Medium</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Lyophilizer Alpha 2-4 LSC</td>
			<td style="width:411px;">Christ</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Lysozyme, 20000 U/mg</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Microscope CM 100</td>
			<td style="width:411px;">Philips</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Microscope Eclipse TS 100</td>
			<td style="width:411px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Microscopy cover glasses (15 x 15 mm)</td>
			<td style="width:411px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Microscopy slides</td>
			<td style="width:411px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Microwave</td>
			<td style="width:411px;">Studio</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Mini-Extruder Set</td>
			<td style="width:411px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">NaCl, &#62;99.5%, p.a.</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Natriumhydroxid pellets</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Ni-NTA Agarose, PerfectPro</td>
			<td style="width:411px;">5 Prime</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Nucleopore Track-Etch Membrane</td>
			<td style="width:411px;">Avanti</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">PH meter 766 calimatic</td>
			<td style="width:411px;">Knick</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Phenylmethylsulfonylflourid (PMSF)</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Polypropylene Columns (1 mL)</td>
			<td style="width:411px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">PowerPac basic</td>
			<td style="width:411px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Propanol-2-ol</td>
			<td style="width:411px;">Emplura</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Protein ladder 10-250 kDa</td>
			<td style="width:411px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Recirculating cooler F12</td>
			<td style="width:411px;">Julabo</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Reinforcement rings</td>
			<td style="width:411px;">Herma</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">SacI HF</td>
			<td style="width:411px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">SDS Pellets</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Sodiumdihydrogen phosphate dihydrate, NaH2PO4</td>
			<td style="width:411px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Sterile syringe filter 0.2 mm Cellulose Acetate</td>
			<td style="width:411px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td style="width:411px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">TEMED</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">TexasRed Dextran-Conjugate</td>
			<td style="width:411px;">MolecularProbes</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Thermomix comfort</td>
			<td style="width:411px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">THF, &#62;99.5% p.a.</td>
			<td style="width:411px;">Acros</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Triton X 100</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Trypton/Pepton from Casein</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Ultrasonic cleaner</td>
			<td style="width:411px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Urea p.a.</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Vacuum pump 2.5</td>
			<td style="width:411px;">Vacuubrand</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">XbaI</td>
			<td style="width:411px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">XhoI</td>
			<td style="width:411px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">ZelluTrans regenerated cellulose tubular membrane (12.0 S/ 3.5 S/ 1.0 V)</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

directed assembly of elastin-like proteins into defined supramolecular structures and cargo encapsulation in vitro

맞춤형 단백질성 빌딩 블록은 최소 세포, 약물 전달 차량 및 효소 스캐폴드와 같은 포부 분자 구조의 조립을 위한 다목적 후보입니다. 유전적 수준에서의 생체 적합성 및 튜닝성으로 인해 엘라스틴과 같은 단백질(ELP)은 생명 공학 및 생물 의학 응용 분야에 이상적인 구성 요소입니다. 그럼에도 불구하고, 뚜렷한 물리화학적 특성과 양호한 캡슐화 잠재력을 가진 단백질 기반의 상분자 구조의 조립은 여전히 도전적이다.
여기에서 우리는 구형 응고체, 섬유 및 안정한 소포와 같은 초분자 단백질 아키텍처로 양과성 ELP의 유도자가 조립을 위한 2개의 효율적인 프로토콜을 제공합니다. 제시된 조립 프로토콜은 적응형 물리화학적 특성을 가진 ELP를 기반으로 단백질 멤브레인 기반 구획(PMBC)을 생성합니다. PMBC는 위상 분리 거동을 시연하고 방법 의존적 멤브레인 융합을 드러내며 화학적으로 다양한 형광화물 분자를 캡슐화할 수 있습니다. 생성된 PMBC는 약물 제형 및 전달 플랫폼, 인공 세포 및 구획화된 반응 공간으로서 높은 적용 잠재력을 가지고 있다.

소포 생산을 위한 프로토콜 개발 그림 1은 두 가지 다른 소포 준비 방법을 간략하게 설명합니다. 좌측의 THF 팽윤 방법은 3개의 연속적인 단계로 구성되며 온도에 따라 ELP의 상이한 상이한 분자 어셈블리를 초래한다. 그림 1A 에피오레스내시크 현미경 이미지는 BDP-R20F20에서 조립된 소포와 BDP-R40F20에서 조립된 섬유소 ?...

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Directed Assembly of Elastin-like Proteins into defined Supramolecular Structures and Cargo Encapsulation In Vitro

유기 및 수성 용매의 계면에서 맞춤형 양피 성 엘라스틴과 같은 단백질은 환경 매개 변수에 의해 유발되는 소포, 섬유 및 응고체와 같은 복잡한 상분자 구조로 조립됩니다. 설명된 조립 프로토콜은 튜닝 가능한 특성을 가진 단백질 멤브레인 기반 구획(PMBC)을 생성하여 다양한 화물을 캡슐화할 수 있도록 합니다.

엘라스틴과 같은 단백질을 체외에서 정의된 수분자 구조 및 화물 캡슐화로 조립하도록 지시

Tailored proteinaceous building blocks are versatile candidates for the assembly of supramolecular structures such as minimal cells, drug delivery ...

최소한의 세포 설계 및 약물 전달을 위한 수프라 분자 구조의 효율적인 조립은 여전히 어려운 일입니다. 여기서, 우리는 양용 성 엘라스틴과 같은 단백질을 기반으로 수분자 구조를 산출하는 효율적인 프로토콜을 보여줍니다. 제시된 조립 프로토콜은 소포, 섬유 및 동서와 같은 적응 가능한 물리화학적 특성을 가진 다목적 수분자 구조를 생성합니다.단백질 멤브레인 기반 구획은 상 분리 거동을 보여주고 화학적으로 다양한 형광화물 분자의 캡슐화를 허용합니다. F20E20-mEGFP 및 F20E20-mCherry의 표현을 위해, 1박 전문화에서 0.3의 OD600까지 의 주요 표현 문화를 접종한다. 37섭씨 와 200 rpm에서 적절한 항생제로 보충된 멸균 LB 배지의 400 밀리리터에서 배양하십시오.발현 배양은 0.5 ~0.8의 OD600에 도달하면 IPTG를 1밀리머의 최종 농도에 추가하고 인큐베이션 온도를 섭씨 20도로 낮춘다. 부자연스러운 아미노산을 가진 수륙양용 ELP의 발현을 위해, 0.3의 OD에 적합한 플라스미드를 포함하는 야간 대장균 전 배양으로부터 주요 발현 문화를 접종한다. 카나마이신과 클로람페니콜을 섭씨 37도, 200rpm에 보충한 멸균 LB 배지 400밀리리터로 인큐베이션을 증식합니다.100 밀리풀라 부자연스러운 아미노산 육수를 준비하려면 206.2 밀리그램의 부자연스러운 아미노산을 초순수 수의 8 밀리리터에 추가하십시오. 용액의 pH를 수산화 나트륨 3마리로 올리고 적극적으로 섞습니다. 부자연스러운 아미노산이 용해되면 pH를 약 10.5로 낮추고 초순수수를 10밀리리터의 부피에 추가합니다.멸균 0.22 마이크로미터 필터로 용액을 걸러내고 2밀리리터 반응 튜브로 알리쿼트합니다. 발현 배양은 0.5 ~0.8의 OD600에 도달하면, 2밀리머의 최종 농도에 부자연스러운 아미노산을 첨가한다. 10 분 더 배양.그런 다음 IPTG 및 아라비노스의 동시 첨가를 통해 표적 단백질 및 필요한 tRNA 합성제의 발현을 유도한다. 인큐베이션 온도를 섭씨 20도로 낮추고 식이 약 20시간 동안 계속되도록 합니다. 인큐베이션 후, 40분 동안 4도, 000배 g에서 원심분리로 세포를 수확한다.리소지메 및 PMSF로 리시스 버퍼에서 세포 펠릿을 다시 중단합니다. 얼음에 30 분 동안 솔루션을 인큐베이션합니다. 그런 다음 액체 질소에 잠기면 두 번 동결하고 해동하십시오.서스펜션을 초음파 처리하고 10, 000 배 g 및 섭씨 4도에서 원심 분리로 lysate을 40 분 동안 취소합니다. 그런 다음 친화성 크로마토그래피를 사용하여 단백질을 정화합니다. 단백질 용출 후 추가 사용이 될 때까지 섭씨 4도에 보관하십시오.ELP 용액 500 마이크로리터에 형광 염료 1개를 추가하고 ThermoMixer에서 흔들리는 동안 섭씨 15도에서 약 10시간 동안 반응을 배양하여 빛으로부터 보호합니다. 과도한 형광염을 제거하려면 초순수 수역에서 투석 막을 10분 동안 평형화합니다. 멤브레인을 올바른 크기로 잘라 서 응고 된 ELP 용액을 사용하여 반응 튜브의 개구부 위에 놓습니다.그런 다음 코어가없는 뚜껑으로 튜브를 닫아 멤브레인을 개구부로 고정합니다. 공기의 트래핑을 방지하기 위해 뚜껑과 멤브레인 사이의 공간을 버퍼로 채웁니다. 그런 다음 반응 튜브를 선택한 버퍼에 넣고 표면 아래로 밀어 거꾸로 놓습니다.섭씨 4도에서 적어도 3시간 동안 투석을 수행하여 각 버퍼 변경 후 투석이 적어도 3시간 이상 계속될 수 있도록 합니다. THF 팽윤의 경우, 안정적인 pH 7.5로 인산염 또는 트리스 버퍼에 대해 균질한 ELP 용액을 투석한다. 리오필라이저를 준비하고 동결 건조를 위해 온도를 시동하도록 식힙니다.Aliquot는 1.5 밀리리터 반응 튜브에서 투석 된 단백질 용액을 인용하고 동결 건조 과정에서 압력 변화로 인해 고체 샘플을 잃지 않도록 작은 구멍이있는 캡으로 밀봉하십시오. 액체 질소에 있는 견본을 충격 동결합니다. 냉동 단백질 샘플을 액체 질소에서 꺼내 서 즉시 동결 건조를 시작 하는 lyophilizer에 배치 합니다.시료가 완전히 건조한 후, 건조한 질소로 환기시키고 반응 튜브 뚜껑을 즉시 닫아 공기 습기와의 접촉을 피하십시오. lyophilized 샘플에 순수 THF를 추가하고 15 분 동안 얼음 물이있는 수조 초음파 식소식에 용액을 넣습니다. 열순환기를 섭씨 30~60도로 예열하여 소포 형성을 위해 섭씨 30도 또는 섬유 형성을 위해 섭씨 90도까지 예열하고, 초순수 수또는 완충액으로 새로운 반응 튜브를 준비합니다.초음파 처리 후 ELP/THF 용액과 준비된 물 또는 버퍼를 5분 동안 열순환기에 배치합니다. 그런 다음 ELP 용액을 물 이나 버퍼 위에 계층화하여 두 단계와 뚜렷한 상호 위상의 분리가 보이는지 확인하고 혼합물을 열순환기에 다시 배치합니다. 샘플을 실온에서 10 분 동안 식히고 물 이나 버퍼 또는 형광 현미경 검사법에 대한 투석을 진행하십시오.일대일 50 마이크로몰라 ELP 용액을 준비하고 10~20%에서 20%1-부타놀을 추가합니다. 위아래로 파이프를 통해 즉시 용액을 섞는다. 용액의 탁도는 혼합 하는 동안 증가 해야 합니다., 소포 형성을 나타내는.좁은 크기 분포를 달성하기 위해, 하나의 마이크로 미터의 모공 크기와 멤브레인을 통해 미니 압출기로 소포를 돌출. 염료 캡슐화를 위해, DMSO에 Dextran 텍사스 레드 스톡 솔루션 의 한 마이크로 리터와 10 밀리머 트리-HCl에 ELP 용액의 약 40 마이크로 리터를 혼합. 1부타놀 10마이크로리터를 넣고 0.25 x 25mm 바늘이 장착된 주사기를 통해 5~10회 돌출합니다.THF 팽윤 방법은 3개의 연속단계로 구성되고 온도에 따라 ELP의 상이한 수분자 어셈블리를 초래한다. 상피 형광 현미경 이미지는 BDP-R20F20및 BDP-R40F20에서 조립된 세동 구조에서 조립된 소포를 보여줍니다. 1부타놀 압출 방법은 ELP 소포의 형성에만 이르게 한다.THF 붓기 방법에 비해 약 2개의 크기의 더 많은 소포가 생성된다. BDP-R40F20은 10~ 15%의 부타놀과 혼합되었고, 소포는 혼합물의 압출을 통해 제조되었다. 상이한 수분자 구조는 THF 팽창 프로토콜을 통해 BDP-R40F20으로부터 조립되었다.완충제의 pH 및 조립 공정의 온도는 동서병, 피브릴 또는 소포를 형성하도록 조정되었다. 어셈블리 프로토콜의 작은 실수는 집계의 형성으로 이어질 수 있습니다. 양전하 염료 ATTO Rho(13)와 다당류 도포(3000)는 1부타놀 압출 방법을 통해 F20R20-mEGFP에서 조립된 소포의 루멘으로 캡슐화되었다.공초점 현미경 이미지는 녹색 채널의 소포, 빨간색 채널의 화물 및 그로 인한 병합 채널의 성공적인 캡슐화를 보여줍니다. 단일 PMBC 빌딩 블록과 조립된 PMBC 인구의 혼합 시 ELP 수륙 양용애호가의 위상 분리 및 융합 거동도 입증되었습니다. PMBC 어셈블리 이전에 혼합하면 조립된 PMBC 멤브레인 내에서 균질하게 분포된 분자로 이어지며, 조립된 소포 집단을 혼합하면 적어도 20분 동안 볼 수 있는 적색 또는 녹색 형광의 막 패치로 이어집니다.이 절차를 시도할 때, THF 팽윤 방법과 부타놀 압출 방법 사이의 차이에 대해 올바른 단계 순서와 차이점에 주의를 기울이는 것이 중요합니다. 이 프로토콜에 따라, ELP 소포는 약물 전달 셔틀, 시험관 내 전사 및 번역과 같은 효소 반응의 플랫폼으로 사용하거나 합성 최소 세포의 형성으로 사용될 수 있다.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Formation of Ordered Biomolecular Structures by the Self-assembly of Short Peptides

짧은 펩타이드의 자기 조립에 의해 주문 생체 고분자 구조의 형성

In nature, complex functional structures are formed by the self-assembly of biomolecules under mild conditions. Understanding the forces that control ...

연구

화학

In Situ SIMS and IR Spectroscopy of Well-defined Surfaces Prepared by Soft Landing of Mass-selected Ions

In Situ SIMS and IR Spectroscopy of Well-defined Surfaces Prepared by Soft Landing of Mass-selected Ions

대량 선택 이온 소프트 랜딩에 의해 준비 잘 정의 된 표면의 제자리 SIMS 및 IR 분광법

Soft landing of mass-selected ions onto surfaces is a powerful approach for the highly-controlled preparation of materials that are inaccessible using ...

Atomically Defined Templates for Epitaxial Growth of Complex Oxide Thin Films

복합 산화물 박막의 에피 택셜 성장을위한 원자 적으로 정의 된 템플릿

Atomically defined substrate surfaces are prerequisite for the epitaxial growth of complex oxide thin films. In this protocol, two approaches to obtain ...

Construction and Systematical Symmetric Studies of a Series of Supramolecular Clusters with Binary or Ternary Ammonium Triphenylacetates

건설 및 바이너리 또는 삼항 암모늄 Triphenylacetates와 초분자 클러스터의 시리즈의 체계적 대칭 연구

Functions of clusters in nano or sub-nano scale significantly depend on not only kinds of their components but also arrangements, or symmetry, of their ...

Encapsulation of Cancer Therapeutic Agent Dacarbazine Using Nanostructured Lipid Carrier

나노 구조 지질 캐리어를 사용하여 암 치료제 다카 바진의 캡슐화

The only formula of dacarbazine (Dac) in clinical use is intravenous infusion, presenting a poor therapeutic profile due to the low dispersity of the drug ...

Synthesis and Characterization of Supramolecular Colloids

Control over colloidal assembly is of utmost importance for the development of functional colloidal materials with tailored structural and mechanical ...

Site Directed Spin Labeling and EPR Spectroscopic Studies of Pentameric Ligand-Gated Ion Channels

사이트 감독 스핀 라벨 및 펜타 머 리간드 - 게이 티드 이온 채널의 EPR 분광 연구

Ion channel gating is a stimulus-driven orchestration of protein motions that leads to transitions between closed, open, and desensitized states. ...

Highly Stable, Functional Hairy Nanoparticles and Biopolymers from Wood Fibers: Towards Sustainable Nanotechnology

매우 안정, 기능 털이 나노 입자와 목재 섬유에서 생체 고분자 : 지속 가능한 나노 기술쪽으로

Nanoparticles, as one of the key materials in nanotechnology and nanomedicine, have gained significant importance during the past decade. While ...

From Molecules to Materials: Engineering New Ionic Liquid Crystals Through Halogen Bonding

분자 재료를에서: 할로겐 결합을 통해 새로운 이오니아 액체 크리스탈 엔지니어링

Herein, we demonstrate that a bottom-up approach, based on halogen bonding (XB), can be successfully applied for the design of a new type of ionic liquid ...