Name: live cell imaging of microtubule cytoskeleton and micromechanical manipulation of the arabidopsis shoot apical meristem
Uploaded: 2020-05-23T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem at JoVE.com

1. Plantengroei
<ol><li>Zaai Arabidopsis zaden uitdrukken microtubbule binding domein versmolten met groene fluorescerende eiwitten (MBD-GFP)10 op de bodem en houden in lange dag (16 uur dag / 8 uur nacht), 20 °C / 6 ° C voorwaarden voor 1 week voor ontkieming.</li>
	<li>Breng na het ontkiemen zaailingen over naar nieuwe potten met voldoende groeiruimte om robuuste vegetatieve groei mogelijk te maken. Houd planten op korte dag (8 uur per dag /16 uur 's nachts), 20 °C/16 °C voorwaard...

<ol>
	<li>Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-constructing+our+models+of+cellulose+and+primary+cell+wall+assembly.">Re-constructing our models of cellulose and primary cell wall assembly.</a> Current Opinion in Plant Biology. 22, 122-131 (2014).</li><li>McFarlane, H. E., Doring, A., Persson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+cellulose+synthesis.">The cell biology of cellulose synthesis.</a> Annual Reviews in Plant Biology. 65, 69-94 (2014).</li><li>Burgert, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+micromechanical+design+of+plant+cell+walls.">Exploring the micromechanical design of plant cell walls.</a> American Journal of Botany. 93 (10), 1391-1401 (2006).</li><li>Paredez, A. R., Somerville, C. R., Ehrhardt, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+cellulose+synthase+demonstrates+functional+association+with+microtubules.">Visualization of cellulose synthase demonstrates functional association with microtubules.</a> Science. 312 (5779), 1491-1495 (2006).</li><li>Barbier de Reuille, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MorphoGraphX:+A+platform+for+quantifying+morphogenesis+in+4D.">MorphoGraphX: A platform for quantifying morphogenesis in 4D.</a> Elife. 4, 05864 (2015).</li><li>Kierzkowski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastic+domains+regulate+growth+and+organogenesis+in+the+plant+shoot+apical+meristem.">Elastic domains regulate growth and organogenesis in the plant shoot apical meristem.</a> Science. 335 (6072), 1096-1099 (2012).</li><li>Heisler, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alignment+between+PIN1+polarity+and+microtubule+orientation+in+the+shoot+apical+meristem+reveals+a+tight+coupling+between+morphogenesis+and+auxin+transport.">Alignment between PIN1 polarity and microtubule orientation in the shoot apical meristem reveals a tight coupling between morphogenesis and auxin transport.</a> PLoS Biology. 8 (10), e1000516 (2010).</li><li>Louveaux, M., Rochette, S., Beauzamy, L., Boudaoud, A., Hamant, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+mechanical+compression+on+cortical+microtubules+in+Arabidopsis:+a+quantitative+pipeline.">The impact of mechanical compression on cortical microtubules in Arabidopsis: a quantitative pipeline.</a> Plant Journal. 88 (2), 328-342 (2016).</li><li>Nakayama, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+regulation+of+auxin-mediated+growth.">Mechanical regulation of auxin-mediated growth.</a> Current Biology. 22 (16), 1468-1476 (2012).</li><li>Marc, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+GFP-MAP4+reporter+gene+for+visualizing+cortical+microtubule+rearrangements+in+living+epidermal+cells.">A GFP-MAP4 reporter gene for visualizing cortical microtubule rearrangements in living epidermal cells.</a> Plant Cell. 10 (11), 1927-1940 (1998).</li><li>Strauss, S., Sapala, A., Kierzkowski, D., Smith, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+Plant+Growth+and+Cell+Proliferation+with+MorphoGraphX.">Quantifying Plant Growth and Cell Proliferation with MorphoGraphX.</a> Methods in Molecular Biology. 1992, 269-290 (2019).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Erguvan, O., Louveaux, M., Hamant, O., Verger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ+SurfCut:+a+user-friendly+pipeline+for+high-throughput+extraction+of+cell+contours+from+3D+image+stacks.">ImageJ SurfCut: a user-friendly pipeline for high-throughput extraction of cell contours from 3D image stacks.</a> BMC Biology. 17 (1), 38 (2019).</li><li>Boudaoud, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FibrilTool,+an+ImageJ+plug-in+to+quantify+fibrillar+structures+in+raw+microscopy+images.">FibrilTool, an ImageJ plug-in to quantify fibrillar structures in raw microscopy images.</a> Nature Protocols. 9 (2), 457-463 (2014).</li><li>Sampathkumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+wall+cellulose+synthase+regulates+shoot+apical+meristem+mechanics+and+growth.">Primary wall cellulose synthase regulates shoot apical meristem mechanics and growth.</a> Development. 146 (10), (2019).</li><li>Hervieux, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mechanical+Feedback+Restricts+Sepal+Growth+and+Shape+in+Arabidopsis.">A Mechanical Feedback Restricts Sepal Growth and Shape in Arabidopsis.</a> Current Biology. 6 (8), P1019-P1028 (2016).</li><li>Sampathkumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+and+supracellular+mechanical+stress+prescribes+cytoskeleton+behavior+in+Arabidopsis+cotyledon+pavement+cells.">Subcellular and supracellular mechanical stress prescribes cytoskeleton behavior in Arabidopsis cotyledon pavement cells.</a> Elife. 3, e01967 (2014).</li><li>Sampathkumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+wall+cellulose+synthase+regulates+shoot+apical+meristem+mechanics+and+growth.">Primary wall cellulose synthase regulates shoot apical meristem mechanics and growth.</a> Development. 146 (10), dev179036 (2019).</li><li>Uyttewaal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+stress+acts+via+katanin+to+amplify+differences+in+growth+rate+between+adjacent+cells+in+Arabidopsis.">Mechanical stress acts via katanin to amplify differences in growth rate between adjacent cells in Arabidopsis.</a> Cell. 149 (2), 439-451 (2012).</li><li>Hamant, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+patterning+by+mechanical+signals+in+Arabidopsis.">Developmental patterning by mechanical signals in Arabidopsis.</a> Science. 322 (5908), 1650-1655 (2008).</li></ol>

De beoordeling van mechanische signaaltransductiegebeurtenissen is cruciaal om moleculaire regelgevers te identificeren die betrokken zijn bij de mechano-waarnemings- en transductietrajecten. Het hier beschreven protocol geeft een kwantitatief beeld van dergelijke gebeurtenissen door de corticale microtubulirespons te gebruiken als uitlezing voor een dergelijk proces in Arabidopsis SAMs. De hier beschreven procedure wordt routinematig gebruikt in verschillende studies in verschillende weefseltypen<sup class="xre...

Plantencellen worden omgeven door een extracellulaire matrix van polysacchariden en glycoproteïnen die mechanisch lijkt op een vezelversterkt composietmateriaal dat zijn mechanische eigenschappen dynamisch kan veranderen1. De groei van plantencellen wordt gedreven door de opname van water in de cel, wat resulteert in een gelijktijdige opbouw van trekkrachten op de celwand. In reactie op dergelijke krachten, wijzigingen in de fysieke toestand van de celwand zorgt voor celuitzetting. Cellen met primaire wanden zijn in staat om een snelle groei te ondergaan in vergelijking met secundaire celwand met cellen voornamelijk als gevolg van verschillen in de chemische samenstelling van de polysaccharides binnen. Primaire wandcellen zijn samengesteld uit cellulose, hemicellulose en pectine in aanvulling op glycoproteïnen, en gebrek aan lignine, een component die aanwezig is in de secundaire celwand2. Cellulose, een glucosepolymeer dat via β-1,4-bindingen is gekoppeld, is de belangrijkste component van de celwanden. Het is georganiseerd in fibrillar structuren die bestand zijn tegen hoge trekkrachten ervaren tijdens celgroei3. Naast het weerstaan van trekkrachten, mechanische versterking langs een preferentiële richting resulteert in turgor-gedreven expansie langs een as loodrecht op de netto oriëntatie van de cellulose microfibril. De organisatie van de cellulose microfibrils wordt beïnvloed door het corticale microtubulicytoskelet, omdat ze de richtingsbeweging van de cellulosesynthese-synthetiserende complexen op het plasmamembraan4begeleiden. Daarom dient het monitoren van corticale microtubuli organisatie met behulp van een microtubuli-geassocieerd eiwit of tubuline versmolten met een fluorescerend molecuul als een proxy voor de observatie van bovenmatige patronen van cellulose in plantencellen.
De patronen van de corticale microtubulicytoskelet is onder de controle van cel- en weefselmorfologie afgeleide mechanische krachten. Corticale microtubuli organisatie heeft geen preferentiële organisatie na verloop van tijd in cellen gelegen aan de top van de SAM, terwijl cellen in de periferie en de grens tussen de SAM en het opkomende orgaan hebben een stabiele, zeer georganiseerde supracellulaire array van corticale microtubuli5. Verschillende benaderingen zijn ontwikkeld om de mechanische status van de cellen fysiek te verstoren. Veranderingen in de osmotische status, evenals de behandeling met farmacologische en enzymatische verbindingen die de stijfheid van de celwand beïnvloeden, kunnen leiden tot latere veranderingen in de trekkrachten die door de cel6,7 wordenervaren . Het gebruik van constructies die het mogelijk maken voor de geleidelijke toename van de compressieve krachten ervaren door weefsels is een ander alternatief8. Toepassing van centrifugale krachten is ook aangetoond dat de mechanische krachten beïnvloeden zonder enig fysiek contact met de cellen9. Echter, de meest gebruikte middelen van het veranderen van directionele krachten in een groep cellen profiteren van het feit dat alle epidermale cellen onder spanning staan en fysieke ablatie van cellen zal elimineren turgor druk lokaal evenals verstoren cel-tot-cel hechting, waardoor het wijzigen van de trekkrachten ervaren door de naburige cellen. Dit wordt uitgevoerd door het richten van een high-powered gepulseerde ultraviolette laser of door middel van een fijne naald.
Hier gaan we dieper in op het proces van beeldvorming en het beoordelen van corticale microtubuli gedrag voor mechanische verstoring bij de SAM.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>FibrilTool</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Boudaoud, A. et al., Nat Protoc. 2014</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Schindelin, J. et al., Nat Methods. 2012</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycine</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04201.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM6000 CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAP4-GFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Marc, J. et al., Plant Cell 1998</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micropore tape</td>
			<td>Leukopor</td>
			<td>02482-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MorphographX</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Strauss, S. et al., Methods Mol Biol. 2019</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>myo-inositol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I5125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6-benzyladenine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B3408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nicotinic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N4126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic hinged box</td>
			<td>Electron microscopy sciences</td>
			<td>64312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPM (Plant Preservative Mixture)</td>
			<td>Plant Cell Technology</td>
			<td>PPM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pyridoxine hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SURFCUT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Erguvan, O. et al., BMC Biol. 2019</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>thiamine hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4625</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live cell imaging of microtubule cytoskeleton and micromechanical manipulation of the arabidopsis shoot apical meristem

Inzicht in cel- en weefselniveauregulatie van groei en morfogenese loopt al tientallen jaren voorop in biologisch onderzoek. Dankzij de vooruitgang in moleculaire en beeldvormende technologieën konden we inzicht krijgen in hoe biochemische signalen morfogenetische gebeurtenissen beïnvloeden. Het wordt echter steeds duidelijker dat naast biochemische signalen, mechanische signalen ook invloed hebben op verschillende aspecten van cel- en weefselgroei. Arabidopsis ontspruit apical meristem (SAM) is een koepel-vormige structuur verantwoordelijk voor de generatie van alle bovengrondse organen. De organisatie van het corticale microtubulicytoskelet dat apoplastische cellulosedepositie bemiddelt in plantencellen is ruimtelijk verschillend. Visualisatie en kwantitatieve beoordeling van patronen van corticale microtubuli zijn noodzakelijk voor het begrijpen van de biofysische aard van cellen in de SAM, omdat cellulose de stijfste component van de plantencelwand is. De stereotiepe vorm van corticale microtubuli organisatie is ook een gevolg van weefsel-brede fysieke krachten bestaande in de SAM. Verstoring van deze fysieke krachten en de daaropvolgende monitoring van corticale microtubuli organisatie maakt het mogelijk voor de identificatie van kandidaat-eiwitten die betrokken zijn bij het bemiddelen van mechano-perceptie en transductie. Hier beschrijven we een protocol dat helpt bij het onderzoeken van dergelijke processen.

Figuur 1 toont typische projectiebeelden verkregen uit MBD-GFP-lijnen met cellen in het midden van de koepel met ongeorganiseerde corticale microtubuli, en cellen aan de periferie met een omtrekverdeling(figuur 1A,B), terwijl de grensdomeincellen corticale microtubuli bevatten die parallel aan de lange as van de cel zijn uitgelijnd. Deze waarnemingen tonen verschillen in de ruimtelijke verdeling van corticale mic...

Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem at JoVE.com

Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Hier beschrijven we een protocol voor live celbeeldvorming van de corticale microtubuliercytoskelet bij de shoot apicale meristem en het toezicht op de reactie op veranderingen in de fysieke krachten.

Live Cell Imaging van Microtubule Cytoskeleton en Micromechanische Manipulatie van de Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Understanding cell and tissue level regulation of growth and morphogenesis has been at the forefront of biological research for many decades. Advances in ...

Dit protocol helpt ons te begrijpen hoe Microtubule Cytoskeleton gedrag optreedt in planten. Tegelijkertijd helpt het ons ook te begrijpen hoe deze structurele componenten die de cel- en orgaanvorm beïnvloeden, reageren op veranderingen in mechanische krachten. Hoewel deze methode weinig verfijning vereist, biedt het robuuste, kwantitatieve read-after, de mechanische responsverschillen tussen verschillende genotypes en omstandigheden.Begin met het kweken van arabidopsis zaden uitdrukken microtubuli bindende domeinen versmolten met groene fluorescerende eiwitten in de bodem, op 20 en 6 graden Celsius onder lange dag omstandigheden voor een week. Breng na het ontkiemen de zaailingen over in nieuwe potten met voldoende groeiruimte om robuuste vegetatieve groei mogelijk te maken en plaats de planten op 20 en 16 graden Celsius onder korte dagomstandigheden. Na drie tot vijf weken, breng de planten terug naar lange dag omstandigheden op dezelfde temperatuur tot de planten bout, waardoor de bloeiwijze te groeien tot twee tot vijf centimeter lang.Voor Shoot Apical Meristem dissectie, putt de bloeiwijze, en gebruik scherpe tangen om de bloemen te schillen aan de basis van de peduncles, totdat het moeilijk is om de peduncles te zien met het blote oog om de oudere bloemknoppen te verwijderen. Gebruik de tangen om een spleet in de agros te creëren in een ontleden schotel, en plant de bloeiwijze basis in de dikke Augur. Plaats de schotel onder een ontledenmicroscoop.Te beginnen met de oudste bloemknop, duw met de tang om de bloemknop te verwijderen uit de plant. De shoot apicale meristem wordt meestal blootgesteld wanneer oudere bloemen tot fase zes tot zeven worden verwijderd. En gebruik de tangen om elke bloemknop naar beneden te duwen totdat de shoot apicale meristem zichtbaar is.Zodra de shoot apicale meristem is blootgesteld, laat de vers ontleed monster in groeimedium in een ethanol-gesteriliseerde rechthoekige plastic scharnierende cultuur doos met de shoot apicale meristem net blootgesteld boven het medium oppervlak. Voeg een paar druppels steriel gedeïsiliseerd water toe aan de randen van de kweekdoos en sluit het deksel om de vochtigheid in de doos te behouden. Wikkel de doos met micropore tape en plaats de groeibox onder lange of continue dagomstandigheden op 22 graden Celsius gedurende 12 tot 24 uur.Wanneer de plant is hersteld van de ontledingsprocedure, bedek het monster met steriel gedeïoniseerd water en controleer op luchtbellen onder de ontledenmicroscoop. Breng de kweekdoos over naar een rechtopstaande confocale microscoopfase en selecteer de 40 of 60X waterdip lens. Laat het doel in het water zakken en controleer op luchtbellen op de voorste lens van het object.Om bellen te verwijderen, lager het podium en veeg de lens voorzichtig met een optisch weefsel. Gebruik vervolgens een Pasteur pipet om een klein volume water toe te voegen aan de voorste lens van het doel voordat u de lens opnieuw onderdompelt in het water. Gebruik vervolgens het GFP-filter en de epi-verlichtingsmodule van de confocale microscoop om de XY-controller aan te passen om het monster te lokaliseren.Het aanpassen van de positie van de oculair, plaats de shoot apicale meristem direct onder de lichtbron, en focus langs de Z-as totdat de top zich bevindt. Gebruik een laser in staat van spannende GFP om het monster te verlichten, en de optische zoom van de microscoop aan te passen, zodat de hele shoot apicale meristem en het podium een florale primordia zijn in het gezichtsveld. Pas vervolgens de kracht van de laseroutput en de gain-instellingen aan om een optimale signaal-ruisverhouding te verkrijgen.Nadat het monster twee tot vijf minuten heeft kunnen worden gedrenk, verwerft u confocale Z-stapels van het monster met 0,25 tot 0,5 micrometer Z-segmentintervallen, wat een pixelgrootteresolutie van ongeveer 0,3 micro meter toevoegt. Verwijder aan het einde van de overname onmiddellijk het water en breng de kweekbox terug naar de groeikamer. Voor Micromechanical Shoot Apical Meristem Perturbation, verwerven pre-ablatie beeld stapels van de corticale microtubule organisatie zoals net aangetoond, en decaf het water uit de cultuur doos in een cultuur schotel.Breng de shoot apicale meristem onder een ontledenmicroscoop, en langzaam benaderde de shoot apicale meristem met een schone 0,4 bij 20 millimeter spuitnaald. Neem kort contact op met de periferie van de koepel van de schietapicale meristem met de naaldpunt om te bevestigen dat de ablatie is voltooid. En vul de kweekschotel bij met steriel gedeïsized water.Voeg vervolgens 10 microgram per milliliter propidium jodide toe aan de schotel en verwerf onmiddellijk beeldstapels zoals aangetoond om de twee uur gedurende zes uur, het terugbrengen van de kweekschotel naar de incubatie tussen elk keerpunt. Voor gegevensanalyse genereert u oppervlakteprojecties van de beeldstapels met behulp van een geschikt softwareprogramma voor beeldanalyse en voert u extractie uit van de corticale microtubbule-anisotropie met behulp van de Fibril Tool Macro in Fiji. Hier kunnen typische projectiebeelden worden verkregen uit microtubbule bindingsdomein GFP-lijnen met cellen in het midden van de koepel die ongeorganiseerde corticale microtubuli bevatten, cellen aan de periferie, met een omtrekverdeling en grensdomeincellen die corticale microtubuli bevatten die parallel aan de lange as van de cel zijn uitgelijnd.Time-lapse imaging, toont corticale microtubuli uitlijning veranderen van een zeer wanordelijke array naar een meer georganiseerde array binnen zes uur na ablatie. Tensors kunnen worden bovenop de corticale microtubuli beelden, en de geëxtraheerde informatie kan worden vertegenwoordigd door het plotten van de gemiddelde anisotropie na verloop van tijd. Bij het aanpassen van laservermogen en gain-instellingen moeten we ervoor zorgen dat de filamenten duidelijk worden geobserveerd en proberen overbelichting te voorkomen, omdat over verzadigde signalen de trekrichting in latere analyse kunnen beïnvloeden.Atoomkracht microscopie kan ook worden uitgevoerd om te beoordelen hoe de veranderingen in de mechanische krachten daadwerkelijk van invloed op de fysieke status van de celwand.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Live Imaging of Innate Immune and Preneoplastic Cell Interactions Using an Inducible Gal4/UAS Expression System in Larval Zebrafish Skin

Live-Imaging van aangeboren immuunsysteem en preneoplastische cel interacties Met behulp van een Inducible Gal4 / UAS Expression System in larvale zebravis Skin

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS ...

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Live-beeldvorming van de<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

Live confocale Imaging van de ontwikkelingslanden Arabidopsis Flowers

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Bioengineering van Humanized Botmarg Microenvironments in Mouse en hun visualisatie door Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In Vitro Zaadknop teelt voor Live-cel Imaging van Zygote polarisatie en Embryo patronen in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Methoden voor Imaging intracellulaire pH van de follikel stamcel overdrachtslijn in Live Drosophila eierstokweefsel

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Levende cel beeldvorming van chromosoom segregatie tijdens de mitose

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Confocal Live Imaging of Shoot Apical Meristems from Different Plant Species

Confocale Live beeldvorming van Shoot apicale Meristems van verschillende plantensoorten

The shoot apical meristem (SAM) functions as a conserved stem cell reservoir and it generates almost all aboveground tissues during the postembryonic ...

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

Dissectie en live-imaging van de late embryonale drosophila gonad

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, ...