Name: live cell imaging of microtubule cytoskeleton and micromechanical manipulation of the arabidopsis shoot apical meristem
Uploaded: 2020-05-23T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem at JoVE.com

1. Crescimento das plantas
<ol><li>Semear sementes arabidopsis expressando domínio de ligação de microtúbulos fundido com proteína fluorescente verde (MBD-GFP)10 no solo e manter-se em longo dia (16 h dia /8 h noite), 20 °C/6 °C condições para 1 semana para germinação.</li>
	<li>Após a germinação, transfira mudas para novos potes com espaço de crescimento suficiente para permitir um crescimento vegetativo robusto. Mantenha as plantas em dias curtos (8h dia /16h à noite),...

<ol>
	<li>Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-constructing+our+models+of+cellulose+and+primary+cell+wall+assembly.">Re-constructing our models of cellulose and primary cell wall assembly.</a> Current Opinion in Plant Biology. 22, 122-131 (2014).</li><li>McFarlane, H. E., Doring, A., Persson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+cellulose+synthesis.">The cell biology of cellulose synthesis.</a> Annual Reviews in Plant Biology. 65, 69-94 (2014).</li><li>Burgert, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+micromechanical+design+of+plant+cell+walls.">Exploring the micromechanical design of plant cell walls.</a> American Journal of Botany. 93 (10), 1391-1401 (2006).</li><li>Paredez, A. R., Somerville, C. R., Ehrhardt, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+cellulose+synthase+demonstrates+functional+association+with+microtubules.">Visualization of cellulose synthase demonstrates functional association with microtubules.</a> Science. 312 (5779), 1491-1495 (2006).</li><li>Barbier de Reuille, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MorphoGraphX:+A+platform+for+quantifying+morphogenesis+in+4D.">MorphoGraphX: A platform for quantifying morphogenesis in 4D.</a> Elife. 4, 05864 (2015).</li><li>Kierzkowski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastic+domains+regulate+growth+and+organogenesis+in+the+plant+shoot+apical+meristem.">Elastic domains regulate growth and organogenesis in the plant shoot apical meristem.</a> Science. 335 (6072), 1096-1099 (2012).</li><li>Heisler, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alignment+between+PIN1+polarity+and+microtubule+orientation+in+the+shoot+apical+meristem+reveals+a+tight+coupling+between+morphogenesis+and+auxin+transport.">Alignment between PIN1 polarity and microtubule orientation in the shoot apical meristem reveals a tight coupling between morphogenesis and auxin transport.</a> PLoS Biology. 8 (10), e1000516 (2010).</li><li>Louveaux, M., Rochette, S., Beauzamy, L., Boudaoud, A., Hamant, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+mechanical+compression+on+cortical+microtubules+in+Arabidopsis:+a+quantitative+pipeline.">The impact of mechanical compression on cortical microtubules in Arabidopsis: a quantitative pipeline.</a> Plant Journal. 88 (2), 328-342 (2016).</li><li>Nakayama, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+regulation+of+auxin-mediated+growth.">Mechanical regulation of auxin-mediated growth.</a> Current Biology. 22 (16), 1468-1476 (2012).</li><li>Marc, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+GFP-MAP4+reporter+gene+for+visualizing+cortical+microtubule+rearrangements+in+living+epidermal+cells.">A GFP-MAP4 reporter gene for visualizing cortical microtubule rearrangements in living epidermal cells.</a> Plant Cell. 10 (11), 1927-1940 (1998).</li><li>Strauss, S., Sapala, A., Kierzkowski, D., Smith, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+Plant+Growth+and+Cell+Proliferation+with+MorphoGraphX.">Quantifying Plant Growth and Cell Proliferation with MorphoGraphX.</a> Methods in Molecular Biology. 1992, 269-290 (2019).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Erguvan, O., Louveaux, M., Hamant, O., Verger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ+SurfCut:+a+user-friendly+pipeline+for+high-throughput+extraction+of+cell+contours+from+3D+image+stacks.">ImageJ SurfCut: a user-friendly pipeline for high-throughput extraction of cell contours from 3D image stacks.</a> BMC Biology. 17 (1), 38 (2019).</li><li>Boudaoud, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FibrilTool,+an+ImageJ+plug-in+to+quantify+fibrillar+structures+in+raw+microscopy+images.">FibrilTool, an ImageJ plug-in to quantify fibrillar structures in raw microscopy images.</a> Nature Protocols. 9 (2), 457-463 (2014).</li><li>Sampathkumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+wall+cellulose+synthase+regulates+shoot+apical+meristem+mechanics+and+growth.">Primary wall cellulose synthase regulates shoot apical meristem mechanics and growth.</a> Development. 146 (10), (2019).</li><li>Hervieux, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mechanical+Feedback+Restricts+Sepal+Growth+and+Shape+in+Arabidopsis.">A Mechanical Feedback Restricts Sepal Growth and Shape in Arabidopsis.</a> Current Biology. 6 (8), P1019-P1028 (2016).</li><li>Sampathkumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+and+supracellular+mechanical+stress+prescribes+cytoskeleton+behavior+in+Arabidopsis+cotyledon+pavement+cells.">Subcellular and supracellular mechanical stress prescribes cytoskeleton behavior in Arabidopsis cotyledon pavement cells.</a> Elife. 3, e01967 (2014).</li><li>Sampathkumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+wall+cellulose+synthase+regulates+shoot+apical+meristem+mechanics+and+growth.">Primary wall cellulose synthase regulates shoot apical meristem mechanics and growth.</a> Development. 146 (10), dev179036 (2019).</li><li>Uyttewaal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+stress+acts+via+katanin+to+amplify+differences+in+growth+rate+between+adjacent+cells+in+Arabidopsis.">Mechanical stress acts via katanin to amplify differences in growth rate between adjacent cells in Arabidopsis.</a> Cell. 149 (2), 439-451 (2012).</li><li>Hamant, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+patterning+by+mechanical+signals+in+Arabidopsis.">Developmental patterning by mechanical signals in Arabidopsis.</a> Science. 322 (5908), 1650-1655 (2008).</li></ol>

A avaliação dos eventos de transdução de sinal mecânico é crucial para identificar os reguladores moleculares envolvidos nas vias de mecano-percepção e transdução. O protocolo descrito aqui fornece uma visão quantitativa de tais eventos usando a resposta de microtúbulos corticais como leitura para tal processo em SAMs Arabidopsis. O procedimento descrito aqui é utilizado rotineiramente em diversos estudos em diversos tipos de tecidos16,17,<s...

As células vegetais são cercadas por uma matriz extracelular de polissacarídeos e glicoproteínas que se assemelha mecanicamente a um material composto reforçado com fibra capaz de mudar dinamicamente suas propriedades mecânicas1. O crescimento das células vegetais é impulsionado pela absorção de água na célula, o que resulta em um acúmulo concomitante de forças de tração na parede celular. Em resposta a tais forças, modificações no estado físico da parede celular permitem a expansão celular. As células com paredes primárias são capazes de sofrer um rápido crescimento em comparação com a parede celular secundária contendo células principalmente devido a diferenças na composição química dos polissacarídeos dentro. As células de parede primárias são compostas de celulose, hemicellulose e pectina, além de glicoproteínas, e falta de lignina, componente presente na parede celular secundária2. A celulose, um polímero de glicose ligado através de β-1,4 ligações, é o principal componente das paredes celulares. É organizado em estruturas fibrilares capazes de suportar altas forças de tração experimentadas durante o crescimento celular3. Além de resistir às forças de tração, o reforço mecânico ao longo de uma direção preferencial resulta em expansão orientada por turgor ao longo de um eixo perpendicular à orientação líquida do microfibril de celulose. A organização dos microfibrilas de celulose é influenciada pelo citoesqueleto de microtubulos cortical, pois orientam o movimento direcional dos complexos de celulose-sintetizadores localizados na membrana plasmática4. Portanto, monitorar a organização de microtúbulos corticais usando uma proteína associada a microtúbulos ou tubulina fundida com uma molécula fluorescente serve como proxy para a observação de padrões de sobrepesca de celulose em células vegetais.
A padronização do citoesqueleto de microtúbulos cortical está sob o controle de forças mecânicas derivadas da morfologia celular e tecidual. A organização de microtúbulos corticais não possui nenhuma organização preferencial ao longo do tempo em células localizadas no ápice do SAM, enquanto as células da periferia e a fronteira entre o SAM e o órgão emergente possuem uma matriz supracelular estável e altamente organizada de microtúbulos corticais5. Várias abordagens foram desenvolvidas para perturbar fisicamente o estado mecânico das células. Alterações no estado osmótico, bem como tratamento com compostos farmacológicos e enzimáticos que influenciam a rigidez da parede celular podem resultar em alterações subsequentes nas forças de tração experimentadas pela célula6,7. O uso de engenhocas que permitem o aumento gradual das forças compressivas experimentadas pelos tecidos é outra alternativa8. A aplicação de forças centrífugas também tem sido demonstrada para influenciar as forças mecânicas sem qualquer contato físico com as células9. No entanto, os meios mais amplamente utilizados de mudança de forças direcionais em um grupo de células se aproveitam do fato de que todas as células epidérmicas estão sob tensão e a ablação física das células eliminará a pressão de turgor localmente, bem como interromperá a adesão célula-celular, modificando assim as forças de tração experimentadas pelas células vizinhas. Isto é realizado tanto visando um laser ultravioleta pulsado de alta potência ou por meio de uma agulha fina.
Aqui elaboramos sobre o processo de imagem e avaliação do comportamento de microtúbulos corticais para perturbação mecânica no SAM.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>FibrilTool</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Boudaoud, A. et al., Nat Protoc. 2014</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Schindelin, J. et al., Nat Methods. 2012</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycine</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04201.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM6000 CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAP4-GFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Marc, J. et al., Plant Cell 1998</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micropore tape</td>
			<td>Leukopor</td>
			<td>02482-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MorphographX</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Strauss, S. et al., Methods Mol Biol. 2019</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>myo-inositol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I5125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6-benzyladenine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B3408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nicotinic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N4126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic hinged box</td>
			<td>Electron microscopy sciences</td>
			<td>64312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPM (Plant Preservative Mixture)</td>
			<td>Plant Cell Technology</td>
			<td>PPM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pyridoxine hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SURFCUT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Erguvan, O. et al., BMC Biol. 2019</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>thiamine hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4625</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live cell imaging of microtubule cytoskeleton and micromechanical manipulation of the arabidopsis shoot apical meristem

A compreensão da regulação do nível celular e tecidual do crescimento e da morfogênese está na vanguarda da pesquisa biológica há muitas décadas. Os avanços nas tecnologias moleculares e de imagem nos permitiram obter insights sobre como os sinais bioquímicos influenciam eventos morfogenéticos. No entanto, é cada vez mais evidente que, além dos sinais bioquímicos, as pistas mecânicas também impactam vários aspectos do crescimento celular e tecidual. A Arabidopsis shoot apical meristem (SAM) é uma estrutura em forma de cúpula responsável pela geração de todos os órgãos acima do solo. A organização do citoesqueleto de microtúbulo cortical que media a deposição de celulose apoplásica em células vegetais é espacialmente distinta. A visualização e a avaliação quantitativa dos padrões dos microtúbulos corticais são necessárias para entender a natureza biofísica das células no SAM, já que a celulose é o componente mais rígido da parede celular da planta. A forma estereotipada da organização dos microtúbulos cortical também é uma consequência das forças físicas em todo o tecido existentes no SAM. A perturbação dessas forças físicas e o monitoramento subsequente da organização de microtúbulos corticais permitem a identificação de proteínas candidatas envolvidas na mediação da mecano-percepção e transdução. Aqui descrevemos um protocolo que ajuda a investigar tais processos.

A Figura 1 mostra imagens típicas de projeção obtidas a partir de linhas MBD-GFP com células no centro da cúpula contendo microtúbulos corticais desorganizados, e células na periferia com uma distribuição circunferencial(Figura 1A,B),enquanto as células de domínio de fronteira contêm microtúbulos corticais alinhados paralelos ao eixo longo da célula. Estas observações mostram diferenças na distri...

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Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Aqui descrevemos um protocolo para imagens de células vivas do citoesqueleto de microtúbulos cortical no meristem apical de tiro e monitorando sua resposta às mudanças nas forças físicas.

Imagem celular ao vivo do citoesqueleto microtubulo e manipulação micromecânica da Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Understanding cell and tissue level regulation of growth and morphogenesis has been at the forefront of biological research for many decades. Advances in ...

Este protocolo nos ajuda a entender como o comportamento do Citoesqueleto microtúbulo ocorre nas plantas. Ao mesmo tempo, também nos ajuda a entender como esses componentes estruturais que influenciam a forma celular e do órgão, respondem a mudanças nas forças mecânicas. Embora, este método exija pouca sofisticação, fornece leitura robusta e quantitativa, as diferenças de resposta mecânica entre diferentes genótipos e condições.Comece cultivando sementes arabidopsis expressando domínios de ligação de microtúbulos fundidos com proteína fluorescente verde no solo, a 20 e 6 graus Celsius em condições de longo dia por uma semana. Após a germinação, transfira as mudas para novos vasos com espaço de crescimento suficiente para permitir um crescimento vegetativo robusto, e coloque as plantas em 20 e 16 graus Celsius em condições de curto dia. Após três a cinco semanas, transfira as plantas de volta para condições de longos dias na mesma temperatura até que as plantas fugiam, permitindo que a inflorescência cresça até dois a cinco centímetros de comprimento.Para shoot apical meristem dissection, coloque a inflorescência, e use fórceps afiados para descascar as flores na base dos peduncles, até que seja difícil ver os peduncles a olho nu para remover os botões de flores mais velhos. Use os fórceps para criar uma fenda no agros em um prato de dissecação, e plante a base de inflorescência na grossa Augur. Coloque o prato sob um microscópio dissecando.Começando com o broto de flor mais antigo, empurre com as fórceps para remover o broto de flor da planta. O meristem apical de tiro é geralmente exposto quando flores mais antigas até o estágio seis a sete são removidas. E use as fórceps para empurrar cada broto de flor para baixo até que o meristem apical de tiro seja visível.Assim que o meristem apical de tiro é exposto, deixe a amostra recém-dissecada em meio de crescimento em uma caixa de cultura articulada de plástico retangular esterilizada por etanol com o meristem apical de tiro apenas exposto acima da superfície média. Adicione algumas gotas de água deionizada estéril às bordas da caixa de cultura e feche a tampa para manter a umidade dentro da caixa. Enrole a caixa com fita micropora e coloque a caixa de crescimento em condições diárias longas ou contínuas a 22 graus Celsius por 12 a 24 horas.Quando a planta se recuperar do procedimento de dissecção, cubra a amostra com água deionizada estéril e verifique se há bolhas de ar sob o microscópio dissecador. Transfira a caixa de cultura para um estágio de microscópio confocal vertical e selecione a lente de mergulho de água de 40 ou 60X. Abaixe o objetivo na água e verifique se há bolhas de ar na lente frontal do objeto.Para remover bolhas, abaixe o palco e limpe suavemente a lente com um tecido óptico. Em seguida, use uma pipeta Pasteur para adicionar um pequeno volume de água à lente frontal do objetivo antes de remermergar a lente na água. Em seguida, use o filtro GFP e o módulo de iluminação epi-iluminadora do microscópio confocal para ajustar o controlador XY para localizar a amostra.Ajustando a posição dos oculares, posicione o meristem apical de tiro diretamente sob a fonte de luz e concentre-se ao longo do eixo Z até que o ápice esteja localizado. Use um laser capaz de estimular o GFP para iluminar a amostra, e ajustar o zoom óptico do microscópio, de modo que toda a filmagem apical meristem e o estágio um primordia floral estão no campo de visão. Em seguida, ajuste a potência da saída do laser e as configurações de ganho para obter uma relação de sinal para ruído ideal.Depois de permitir que a amostra se contente por dois a cinco minutos, adquira pilhas Z confocal da amostra em intervalos de fatias Z de 0,25 a 0,5 micrômetros, adicionando aproximadamente 0,3 m de resolução de tamanho de pixel. Ao final da aquisição, remova imediatamente a água e transfira a caixa de cultura de volta para a câmara de crescimento. Para a Micromecânica Shoot Apical Meristem Perturbation, adquira pilhas de imagens pré-ablação da organização de microtúbulos corticais como apenas demonstrado, e descafete a água da caixa de cultura em um prato de cultura.Transfira o meristem apical de tiro sob um microscópio dissecando, e lentamente se aproximou do meristem apical de tiro com uma agulha de seringa limpa de 0,4 por 20 milímetros. Entre em contato brevemente com a periferia da cúpula do meristem apical com a ponta da agulha para confirmar que a ablação foi concluída. E reabastecer o prato de cultura com água deionizada estéril.Em seguida, adicione 10 microgramas por mililitro de iodeto de propidium ao prato e imediatamente adquira pilhas de imagem como demonstrado a cada duas horas por seis horas, devolvendo o prato de cultura à incubação entre cada ponto de tempo. Para análise de dados, gere projeções superficiais das pilhas de imagens usando um programa de software de análise de imagem apropriado e realize a extração da anisotropia de microtúbulos corticais usando a Macro da Ferramenta Fibril em Fiji. Aqui, imagens típicas de projeção obtidas a partir de linhas GFP de domínio de ligação microtúbula com células no centro da cúpula contendo microtúbulos corticais desorganizados, células na periferia, tendo uma distribuição circunferencial e células de domínio de fronteira contendo microtúbulos corticais alinhados paralelamente ao eixo longo da célula podem ser observados.Imagens de lapso de tempo mostram o alinhamento do microtúbulo cortical mudando de uma matriz altamente desordenada para uma matriz mais organizada dentro de seis horas de ablação. Tensores podem ser sobrepostos às imagens de microtúbulos corticais, e as informações extraídas podem ser representadas plotando a anisotropia média ao longo do tempo. Ao ajustar a potência de saída do laser e obter configurações, devemos garantir uma observação clara dos filamentos e tentar evitar a superexposição, pois sinais sobre saturados poderiam distorcer a direção da tração em análise posterior.A microscopia de força atômica também pode ser realizada para avaliar como as mudanças nas forças mecânicas realmente afetam o estado físico da parede celular.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem

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Biologia do Desenvolvimento

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