Isolering af kardiomyocytter fra faste hjerter til immunoktokemi og ploidy analyse

Denne protokol giver en metode til isolering af stangformede kardiomyocytter fra hjertevæv, som derefter kan bruges til at måle ploidy og nukleation status af disse kardiomyocytter uden manuel analyse. Sammenlignet med andre teknikker, vores protokol giver mere konsekvent celle udbytter og celle morfologi, og i modsætning til flow cytometri, vi er i stand til visuelt at kontrollere nucleation og ploidy status cardiomyocytes. Den visuelle demonstration af denne metode er vigtig, fordi hjertet væv division og forening er lettere at værdsætte.

Begynd med at placere den aflivede mus i en liggende position, og tape ned de udvidede lemmer. Brug stump-ledes saks til at skære gennem brystet for at udsætte hjertet. Derefter skæres den faldende aorta og inferial vena cava.

Brug en peristaltisk pumpe fastgjort til et infusionssæt med en 23 gauge butterfly nål til at gennemgå hjertet ved at injicere tre milliliter kaliumchlorid PBS opløsning gennem venstre hjertekammer. Sørg for ikke at gennembore gennem skillevæggen. Derefter injiceres 10 milliliter 4% PFA-opløsning i 10 minutter med en hastighed på en milliliter pr. minut.

Brug en saks til at fjerne hele hjertet. Og hvis det ønskes, isolere en bestemt region. Vævet anbringes i et 1,5 millilitercentrifugerør, der indeholder en milliliter 4% PFA-opløsning.

Inkuber den på en rocker i en time. Anstændig hjertet i en petriskål med PBS opløsning. Klem den for at slippe af med eventuelle PFA tilbage i hjertekamrene og vaske det i PBS.

Sæt det faste hjerte i et nyt 1,5 milliliterrør indeholdende kollagenopløsning. Derefter inkubere hjertet på en rocker på 37 grader Celsius natten over. På den næste dag, sætte hjertet i en 35 millimeter petriskål, der indeholder kollagen opløsning, og dissociate det i en millimeter stykker med scecet eller saks.

Brug derefter en overførselpipette til yderligere at triturere det dissocierede væv i to minutter. Hvis der stadig findes vævspartikler, skal du bruge en pipette med en smallere spids og fortsætte triturationen, indtil størstedelen af vævet er nedbrudt. Placer en 200 til 600 mikrometer nylon mesh over en 15 millimeter centrifuge rør.

Tilsæt fem milliliter PBS til de dissocierede celler og filtrer dem gennem nylonmasken. Nylonmasken vaskes ved at passere yderligere fire milliliter PBS. Derefter centrifugeres den filtrerede opløsning ved 10 til 100 gange G i et minut.

Supernatanten kasseres, og pelletpend pellet i 10 milliliter PBS før farvning. Når du har downloadet Fiji-distributionen af billede J, skal du åbne Fiji og klikke på hjælp, opdatere og administrere opdateringswebsteder. Tjek biomed gruppen og IFPB plugins.

For at hente afhængigheder plugins, ellipse split og morpho lib J.Then klik tæt og anvende ændringer. Dernæst downloade RStudio og åbne den. Kopier koden fra tekstmanuskriptet til RConsoles kommandolinje, og tryk på Enter.

derefter skrive Y som svar på alle prompter til at installere alle vores afhængigheder. Hvis du vil udføre billedanktificering, skal du åbne Fiji og trække analysernukleation. ind i statuslinjen.

Når scriptredigeringsvinduet åbnes, skal du klikke på Kør i nederste venstre hjørne. Der vises en dialogboks, hvor du bliver bedt om placeringen af outputdatamappen. Vælg den mappe, hvor alle analysedata, figurer og andre data, der bruges af softwaren, skal gemmes.

I analyseparametrene skal du vælge placeringen af de billeder, der skal analyseres, og indtaste billedfilnavnformatet ved hjælp af regulære udtryk. Klik på OK, når du har valgt de ønskede indstillinger. Når billeder fra forskellige faser af analysepipelinen vises på skærmen, skal du undersøge dem for at sikre, at tærskelværdien og segmenteringen sker korrekt. Åbn analysérmultinucleatedserver.

r i Rstudio. Skriv derefter filstien til den outputdatamappe, der er valgt i sidste trin, til navnet på variablen med navnet på mappen med navnet på den pågældende variabel uden den endelige skråstreg. Klik på kør-appen i øverste venstre hjørne af scriptredigeringsvinduet.

Brug skyderne til at fastsætte tærskler for den mindste gyldige nukleare gennemsnitsintensitetstærskel, den mindste gyldige tærskel for nukleart område og den maksimale gyldige minimumsanterdiameter for kardiomyocytter. Rul ned, og klik på anvend de valgte tærskler, og klik derefter på fordeling af plotintensitet, hvilket vil gengive et plot af kernens intensitetsfordeling af hele prøven samt separate underplots for hver grupperingsvariabel. For at tage højde for intrasample variation, rulle ned og kontrollere normalisere separat efter gruppe og klik derefter beregne ploidy og plot anslået ploidy distribution.

Når den normaliserede hel prøvegraf vises, skal de to spidsmønstre være synlige. Brug skyderne og vælg tærskler til at isolere diploid og tetraploid toppe fra hinanden og outliers. Rul derefter ned, og klik på beregn ploidy og nucleation.

Endelig skal du klikke på knappen plot og gemme i resultaterne mappe. Denne metode kan bruges til at isolere ensartet singulariserede kardiomyocytter, der er relativt rene uden at forurene celler. Det er nemt at gennemføre og giver konsekvent cardiomyocyte udbytter og kvalitet fra forskellige isolationer.

Kardiomyocytter isoleret med denne protokol kan farves ved hjælp af antistoffer og fluorokrom konjugerede azider. For at vise den karakteristiske Z linje farvning mønster af sarcomeres, cellerne blev farves med antistoffer, der anerkender alpha actinin. I et separat eksperiment blev EdU administreret til mus, før de isolerede faste kardiomyocytter.

Efter isolation blev de mononukleerede, binukleerede og trinukleerede kardiomyocytter, der havde gennemgået S-fasen, opdaget. For at identificere individuelle kerner blev det oprindelige DNA-farvede billede tærskeleret baseret på intensitet. Ellipserne var egnet til de nukleare masker, segmentering individuelle kerner.

Dernæst blev billedets pixel opdelt i områder baseret på den ellipse, som de er mest proksimale, og grænserne for disse områder blev brugt til at tegne linjer gennem nukleare klynger. En lignende segmenteringsproces blev anvendt til at detektere kardiomyocytter. Denne segmenteringsstrategi viste, at størstedelen af kardiomyocytter fra nyfødte mus er mononukleerede.

Hyppigheden af mononukleerede kardiomyocytter er meget lavere i to uger gamle mus, hvor de udgør omkring 25% af den samlede kardiomyocyte population. Når ploidy status for individuelle kerner i cardiomyocytes blev målt, en højere frekvens af tetraploid kerner blev påvist i unge mus. Når isolere kardiomyocytter, er det vigtigt at kontrollere alle celle klumper har brudt op deres trituration.