इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री और प्लॉयडिक एनालिसिस के लिए फिक्स्ड हार्ट्स से कार्डियोमायोसाइट्स का अलगाव

यह प्रोटोकॉल किसी भी हृदय ऊतक से रॉड के आकार के कार्डियोमायोसाइट्स को अलग करने के लिए एक विधि प्रदान करता है, जिसका उपयोग मैनुअल विश्लेषण के बिना इन कार्डियोमायोसाइट्स की प्लॉयडी और नाभिक स्थिति को मापने के लिए किया जा सकता है। अन्य तकनीकों की तुलना में, हमारा प्रोटोकॉल अधिक सुसंगत सेल पैदावार और सेल आकृति विज्ञान प्रदान करता है, और साइटोमेट्री प्रवाह के विपरीत, हम कार्डियोमायोसाइट्स के नाभिक और प्लॉयडी स्थिति को नेत्रहीन रूप से सत्यापित करने में सक्षम हैं। इस विधि का दृश्य प्रदर्शन महत्वपूर्ण है क्योंकि दिल के ऊतक विभाजन और संघ की सराहना करना आसान है।

इच्छामृत्यु वाले माउस को एक रीढ़ की स्थिति में रखकर शुरू करें, और विस्तारित अंगों को टेप करें। दिल को बेनकाब करने के लिए छाती के माध्यम से काटने के लिए कुंद सिर वाली कैंची का उपयोग करें। इसके बाद उतरते महाधमनी और अफेरी वेना कावा काट लें।

बाएं वेंट्रिकल के माध्यम से पोटेशियम क्लोराइड पीबीएस समाधान के तीन मिलीलीटर इंजेक्शन द्वारा दिल को छिद्रित करने के लिए 23 गेज तितली सुई के साथ एक जलसेक सेट से जुड़े एक पेरिस्टाल्टिक पंप का उपयोग करें। सुनिश्चित करें कि पट के माध्यम से छेद न करें। फिर प्रति मिनट एक मिलीलीटर की दर से 10 मिनट के लिए 4% पीएफए समाधान के 10 मिलीलीटर इंजेक्ट करें।

पूरे दिल को दूर करने के लिए कैंची का प्रयोग करें। और यदि वांछित हो, तो किसी विशिष्ट क्षेत्र को अलग-थलग करें। ऊतक को 1.5 मिलीलीटर सेंट्रलाइज ट्यूब में रखें जिसमें 4% पीएफए समाधान का एक मिलीलीटर होता है।

इसे एक घंटे तक एक घुमाव पर इनक्यूबेट करें। पीबीएस सॉल्यूशन के साथ दिल को पेट्री डिश में रखें। वेंट्रिकल्स में शेष किसी भी पीएफए से छुटकारा पाने के लिए इसे निचोड़ें और इसे पीबीएस में धो लें।

तय दिल को कोलेजनेट समाधान युक्त एक नई 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में रखें। फिर रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर एक घुमाव पर दिल को इनक्यूबेट करें। अगले दिन, कोलेजनेट समाधान युक्त 35 मिलीमीटर पेट्री डिश में दिल को रखें, और इसे संदंश या कैंची के साथ एक मिलीमीटर टुकड़ों में अलग करें।

फिर दो मिनट के लिए अलग ऊतक को आगे बढ़ाने के लिए एक स्थानांतरण पिपेट का उपयोग करें। यदि ऊतक कण अभी भी बने हुए हैं, तो एक संकरा टिप के साथ एक पिपेट का उपयोग करें और जब तक अधिकांश ऊतक टूट न जाएं तब तक ट्रिट्यूशन जारी रखें। 15 मिलीमीटर सेंट्रलाइज ट्यूब पर 200 से 600 माइक्रोमीटर नायलॉन की जाली रखें।

अलग कोशिकाओं के लिए पीबीएस के पांच मिलीलीटर जोड़ें और नायलॉन जाल के माध्यम से उन्हें फ़िल्टर करें। पीबीएस के एक अतिरिक्त चार मिलीलीटर गुजर कर नायलॉन जाल धोएं। फिर एक मिनट के लिए 10 से 100 बार जी पर फ़िल्टर किए गए समाधान को अपकेंद्रित्र करें।

सुपरनेट को त्यागें और धुंधला होने से पहले पीबीएस के 10 मिलीलीटर में गोली को फिर से खर्च करें। इमेज जे के फिजी वितरण को डाउनलोड करने के बाद, फिजी खोलें और मदद, अपडेट और अपडेट साइटों पर क्लिक करें। बायोमेड ग्रुप और आईएफपीबी प्लगइन्स की जांच करें।

निर्भरता प्लगइन्स डाउनलोड करने के लिए, एलिप्स स्प्लिट और मॉर्फो लिब जे फिर क्लोज पर क्लिक करें और परिवर्तन लागू करें। इसके बाद, RStudio डाउनलोड करें और इसे खोलें। पाठ पांडुलिपि से RConsole के कमांड लाइन में कोड की प्रतिलिपि और प्रेस दर्ज करें।

फिर सभी के जवाब में वाई टाइप करें हमारे सभी निर्भरताओं को स्थापित करने के लिए संकेत देता है। छवि मात्राकरण करने के लिए, फिजी खोलें और विश्लेषण करें। स्थिति बार में py।

जब स्क्रिप्ट एडिटिंग विंडो खुलती है, तो निचले बाएं कोने में रन पर क्लिक करें। एक संवाद बॉक्स पॉप अप आउटपुट डेटा निर्देशिका के स्थान के लिए पूछ रहा होगा । फ़ोल्डर का चयन करें जहां सॉफ्टवेयर द्वारा उपयोग किए जाने वाले सभी विश्लेषण डेटा, आंकड़े और अन्य डेटा संग्रहीत किए जाएंगे।

विश्लेषण मापदंडों में, विश्लेषण किए जाने वाले चित्रों के स्थान का चयन करें और नियमित अभिव्यक्तियों का उपयोग करके छवि फ़ाइल नाम प्रारूप दर्ज करें। मनचाही सेटिंग्स चुनने के बाद, ओके पर क्लिक करें। चूंकि विश्लेषण पाइपलाइन के विभिन्न चरणों की छवियां स्क्रीन पर दिखाई देती हैं, इसलिए यह सुनिश्चित करने के लिए उनका निरीक्षण करें कि थ्रेसहोल्डिंग और विभाजन ठीक से हो रहा है। खुला विश्लेषण मल्टीन्यूलेटेड सर्वेयर।

आरएसट्यूडियो में आर। इसके बाद, फ़ोल्डर नाम के चर के लिए, अंतिम स्लैश के बिना अंतिम चरण में चयनित आउटपुट डेटा फ़ोल्डर के लिए फ़ाइल पथ टाइप करें। स्क्रिप्ट एडिटिंग विंडो के ऊपरी बाएं कोने में रन ऐप पर क्लिक करें।

न्यूनतम वैध परमाणु मतलब तीव्रता सीमा, न्यूनतम वैध परमाणु क्षेत्र सीमा, और कार्डियोमायोसाइट्स के लिए अधिकतम वैध न्यूनतम फेरेट्स व्यास के लिए थ्रेसहोल्ड सेट करने के लिए स्लाइडर्स का उपयोग करें। नीचे स्क्रॉल करें और क्लिक चयनित थ्रेसहोल्ड लागू करें फिर प्लॉट तीव्रता वितरण पर क्लिक करें, जो पूरे नमूने के नाभिक तीव्रता वितरण के साथ-साथ प्रत्येक समूहीय चर के लिए अलग उपभूखंडों का एक भूखंड प्रदान करेगा। इंट्रासंपल भिन्नता के लिए खाते में, नीचे स्क्रॉल करें और समूह द्वारा अलग से सामान्य होने की जांच करें, फिर प्लॉयडी और प्लॉट अनुमानित प्लॉइड वितरण की गणना पर क्लिक करें।

एक बार सामान्यीकृत पूरे नमूना ग्राफ दिखाई देता है, दो चोटी पैटर्न दिखाई देना चाहिए। एक दूसरे और outliers से diploid और tetraploid चोटियों को अलग करने के लिए स्लाइडर्स और चुनें थ्रेसहोल्ड का चयन करें। फिर नीचे स्क्रॉल करें और प्लॉय और न्यूक्लियेशन की गणना पर क्लिक करें।

अंत में, बटन प्लॉट पर क्लिक करें और परिणाम फ़ोल्डर में सहेजें। इस विधि का उपयोग समान रूप से विलक्षण कार्डियोमायोसाइट्स को अलग करने के लिए किया जा सकता है जो कोशिकाओं को दूषित किए बिना अपेक्षाकृत शुद्ध हैं। इसे लागू करना आसान है और विभिन्न अलगाव से लगातार कार्डियोमायोसाइट पैदावार और गुणवत्ता प्रदान करता है।

इस प्रोटोकॉल के साथ अलग कार्डियोमायोसाइट्स एंटीबॉडी और फ्लोरोक्रोम कंजुगेटेड एजाइड्स का उपयोग करके दाग लगाया जा सकता है। सारकोमर्स के विशेषता जेड लाइन धुंधला पैटर्न दिखाने के लिए, कोशिकाओं को अल्फा ऐक्टिनिन को पहचानने वाले एंटीबॉडी के साथ दाग दिया गया था। एक अलग प्रयोग में, एडू को निश्चित कार्डियोमायोसाइट्स को अलग करने से पहले चूहों को प्रशासित किया गया था।

अलगाव के बाद, एस-चरण से गुजरने वाले मोनोन्यूक्लिड, बाइन्यूक्लिड और त्रिन्यूक्लिटेड कार्डियोमायोसाइट्स का पता चला। व्यक्तिगत नाभिक की पहचान करने के लिए, मूल डीएनए दाग छवि तीव्रता के आधार पर दहलीज था । एलिप्सेस परमाणु मास्क के लिए फिट थे, व्यक्तिगत नाभिक को खंडित कर रहे थे।

इसके बाद, छवि के पिक्सल को एलिप्से के आधार पर क्षेत्रों में विभाजित किया गया था, जिसके लिए वे सबसे समीपस्थ हैं, और इन क्षेत्रों की सीमाओं का उपयोग परमाणु समूहों के माध्यम से लाइनें खींचने के लिए किया जाता था। कार्डियोमायोसाइट्स का पता लगाने के लिए इसी तरह की विभाजन प्रक्रिया का उपयोग किया गया था। इस विभाजन रणनीति से पता चला है कि नवजात चूहों से कार्डियोमायोसाइट्स के बहुमत मोनोन्यूक्लिट हैं।

मोनोन्यूक्लिड कार्डियोमायोसाइट्स की आवृत्ति दो सप्ताह पुराने चूहों में बहुत कम है, जहां वे कुल कार्डियोमायोसाइट आबादी का लगभग 25% बनाते हैं। जब कार्डियोमायोसाइट्स के भीतर व्यक्तिगत नाभिक की प्लॉयडी स्थिति को मापा गया, तो किशोर चूहों में टेट्राप्लाइड नाभिक की उच्च आवृत्ति का पता चला। कार्डियोमायोसाइट्स को अलग करते समय, यह सत्यापित करना महत्वपूर्ण है कि सभी सेल झुरमुट उनके ट्रियूशन से टूट गए हैं।