이 프로토콜은 모든 심장 조직에서 막대 모양의 심근세포를 분리하는 방법을 제공하며, 수동 분석 없이 이러한 심근세포의 핵 형성 상태를 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 다른 기술에 비해, 우리의 프로토콜은 보다 일관된 세포 수율 및 세포 형태를 제공하고, 유동 세포측정과는 반대로, 우리는 심근세포세포의 핵형성 및 계피 상태를 시각적으로 확인할 수 있습니다. 심장 조직 분열과 협회가 이해하기 쉽기 때문에이 방법의 시각적 데모는 중요합니다.
먼저 안락사 된 마우스를 supine 위치에 놓고 연장 된 팔다리를 테이핑합니다. 무딘 머리 가위를 사용하여 가슴을 잘라 심장을 노출하십시오. 그런 다음 내림차순 대동맥과 추론 정맥 카바를 잘라.
왼쪽 심실을 통해 염화 칼륨 PBS 용액 3 밀리리터를 주입하여 심장을 견딜 수있는 23 게이지 나비 바늘이있는 주입 세트에 부착 된 연동 펌프를 사용합니다. 중격을 관통하지 않도록하십시오. 그런 다음 분당 1 밀리리터의 속도로 10분 동안 4%의 PFA 용액 10밀리리터를 주입합니다.
가위를 사용하여 심장 전체를 제거합니다. 원하는 경우 특정 영역을 격리합니다. 4%PFA 용액 1밀리리터를 함유한 1.5밀리리터 원심분리기 튜브에 조직을 배치합니다.
로커에 1시간 동안 인큐베이션을 드시면 됩니다. PBS 용액으로 페트리 접시에 하트를 놓습니다. 심실에 남아있는 PFA를 제거하고 PBS에서 씻어 짜내십시오.
콜라주 용액을 포함하는 새로운 1.5 밀리리터 튜브에 고정 된 마음을 넣습니다. 그런 다음 하룻밤 사이에 섭씨 37도에서 로커에 심장을 배양하십시오. 다음 날, 콜라주 용액이 들어있는 35 밀리미터 페트리 접시에 심장을 넣고 집게 또는 가위로 1 밀리미터 조각으로 해리합니다.
그런 다음 이송 파이펫을 사용하여 2 분 동안 해리 된 조직을 더 세타게합니다. 조직 입자가 여전히 남아 있는 경우, 더 좁은 팁파이펫을 사용하고 조직의 대부분이 분해될 때까지 트리튜레이션을 계속하십시오. 15mm 원심분리기 튜브 위에 200~600마이크로미터 나일론 메쉬를 놓습니다.
해리된 셀에 PBS의 5 밀리리터를 추가하고 나일론 메쉬를 통해 필터링합니다. PBS의 4 밀리리터를 추가로 통과하여 나일론 메쉬를 씻으시다. 그런 다음 1분 동안 여과된 용액을 10~100회 G로 원심분리합니다.
상체를 버리고 염색하기 전에 PBS의 10 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단하십시오. 이미지 J의 피지 배포를 다운로드 한 후, 피지를 열고 도움말을 클릭, 업데이트, 업데이트, 업데이트 사이트를 관리. 바이오메드 그룹과 IFPB 플러그인을 확인합니다.
종속성 플러그인을 다운로드하려면 타원 분할 및 morpho lib J.Then를 클릭하고 변경 사항을 적용합니다. 다음으로 RStudio를 다운로드하여 엽니다. 텍스트 원고의 코드를 RConsole의 명령줄에 복사하고 enter를 누릅니다.
그런 다음 모든 종속성을 설치하는 모든 프롬프트에 대한 응답으로 Y를 입력합니다. 이미지 정량화를 수행하려면 피지를 열고 분석 분석합니다. 상태 표시줄에 파이.
스크립트 편집 창이 열리면 왼쪽 아래 모서리에서 실행을 클릭합니다. 출력 데이터 디렉터리 위치를 묻는 대화 상자가 나타납니다. 소프트웨어에서 사용하는 모든 분석 데이터, 수치 및 기타 데이터가 저장되는 폴더를 선택합니다.
분석 매개 변수에서 분석할 이미지의 위치를 선택하고 정규 식을 사용하여 이미지 파일 이름 형식을 입력합니다. 원하는 설정을 선택한 후 확인을 클릭합니다. 분석 파이프라인의 여러 단계의 이미지가 화면에 나타나면 문턱과 세분화가 제대로 발생하는지 확인합니다. 개방형 분석다중 핵관리서버.
Rstudio에서 r. 다음으로, 명명된 폴더 이름 변수에 최종 슬래시 없이 마지막 단계에서 선택한 출력 데이터 폴더에 파일 경로를 입력합니다. 스크립트 편집 창의 왼쪽 위 모서리에서 실행 앱을 클릭합니다.
슬라이더를 사용하여 최소 유효한 핵 평균 강도 임계값, 최소 유효한 핵 영역 임계값 및 심근세포에 대한 최대 유효한 최소 페렛 직경에 대한 임계값을 설정합니다. 아래로 스크롤하여 선택한 임계값을 클릭한 다음 플롯 강도 분포를 클릭하여 전체 샘플의 핵 강도 분포와 각 그룹화 변수에 대한 별도의 서브플롯플롯을 렌더링합니다. 샘플 내 변동을 고려하려면 아래로 스크롤하고 그룹별로 별도로 정규화한 다음 계산을 클릭하고 예상 계략 분포를 플롯합니다.
정규화된 전체 샘플 그래프가 나타나면 두 개의 피크 패턴이 표시되어야 합니다. 슬라이더를 사용하고 임계값을 선택하여 디플로이드와 테트라클로이드 피크를 서로 이상값에서 분리합니다. 그런 다음 아래로 스크롤하여 계피 와 핵을 계산합니다.
마지막으로 단추 플롯을 클릭하고 결과 폴더에 저장합니다. 이 방법은 세포를 오염하지 않고 상대적으로 순수한 균일하게 특이화 된 심근세포를 분리하는 데 사용할 수 있습니다. 구현하기 쉽고 일관된 심근세포 수율과 다양한 격리로부터의 품질을 제공합니다.
이 프로토콜로 분리된 심근세포는 항체 및 불소크롬 공액 아지드를 사용하여 염색될 수 있다. 사르카레의 특징적인 Z 라인 염색 패턴을 보여주기 위해, 세포는 알파 액틴을 인식하는 항체로 염색되었다. 별도의 실험에서 EdU는 고정 심근세포를 분리하기 전에 마우스에게 투여되었다.
격리 후, S-phase를 겪은 단핵, 이중 핵, 및 삼핵된 심근세포가 검출되었다. 개별 핵을 확인하기 위하여는, 원래 DNA 염색한 심상은 강렬에 근거를 둔 문턱을 달았다. 타원은 핵 마스크에 적합하여 개별 핵을 분할했습니다.
다음으로 이미지의 픽셀은 가장 근접한 타원에 따라 영토로 분할되었으며, 이러한 영토의 경계는 핵 클러스터를 통해 선을 그리는 데 사용되었습니다. 유사한 세분화 과정은 심근 세포를 검출하기 위하여 이용되었습니다. 이 세분화 전략은 신생아 마우스에서 심근세포의 대다수가 단핵된다는 것을 보여주었습니다.
단핵근세포의 빈도는 2주 된 마우스에서 훨씬 낮으며, 전체 심근세포 인구의 약 25%를 차지합니다. 심근세포 내의 개별 핵의 계피 상태를 측정했을 때, 테트라클로드 핵의 더 높은 주파수가 청소년 마우스에서 검출되었다. 심근 세포를 격리 할 때, 모든 세포 덩어리가 자신의 트리튜레이션을 분해 한 확인하는 것이 중요합니다.
