6.4K Views
•
08:41 min
•
October 7th, 2020
DOI :
October 7th, 2020
•0:04
Introduction
0:50
Perfusion and Fixation of the Heart
1:52
Isolation of Fixed Cardiomyocytes
3:17
Image Quantification and Data Analysis
4:53
Data Analysis
6:25
Results: Segmentation and Classification of Isolated Cardiomyocytes
8:19
Conclusion
Transcript
Denne protokollen gir en metode for å isolere stangformede kardiomyocytter fra hjertevev, som deretter kan brukes til å måle ploidy og nucleation status for disse kardiomyocytter uten manuell analyse. Sammenlignet med andre teknikker, gir vår protokoll mer konsistent celleavlinger og cellemorfologi, og i motsetning til strømningscytometri, er vi i stand til å visuelt verifisere kjerner og ploidy status for kardiomyocytter. Den visuelle demonstrasjonen av denne metoden er viktig fordi hjertevevsdelingen og foreningen er lettere å sette pris på.
Begynn med å plassere den eutaniserte musen i liggende stilling, og taping ned de utvidede lemmer. Bruk sløvhodet saks for å skjære gjennom brystet for å eksponere hjertet. Deretter kutter du den synkende aorta og inferial vena cava.
Bruk en peristaltisk pumpe festet til et infusjonssett med en 23 gauge butterfly nål for å perfuse hjertet ved å injisere tre milliliter kaliumklorid PBS løsning gjennom venstre ventrikkel. Pass på at du ikke pierce gjennom septum. Deretter injiserer du 10 milliliter med 4% PFA-løsning i 10 minutter med en hastighet på en milliliter per minutt.
Bruk saks for å fjerne hele hjertet. Og hvis ønskelig, isolere en bestemt region. Plasser vevet i et 1,5 milliliter sentrifugerør som inneholder en milliliter 4% PFA-løsning.
Inkuber den på en rocker i en time. Legg hjertet i en petriskål med PBS-løsning. Klem den for å bli kvitt eventuelle PFA gjenværende i ventriklene og vask den i PBS.
Sett det faste hjertet inn i et nytt 1,5 milliliter rør som inneholder kollagenløsning. Deretter inkubere hjertet på en rocker på 37 grader Celsius over natten. På neste dag legger du hjertet i en 35 millimeter petriskål som inneholder kollagenløsning, og dissosierer det i en millimeter stykker med tang eller saks.
Bruk deretter en overføringspipette for å ytterligere triturere det dissosierte vevet i to minutter. Hvis vevspartikler fortsatt forblir, bruk en pipette med en smalere spiss og fortsett triturasjonen til flertallet av vevet er brutt ned. Plasser et 200 til 600 mikrometer nylonnett over et 15 millimeter sentrifugerør.
Tilsett fem milliliter PBS til de dissosierte cellene og filtrer dem gjennom nylonnettet. Vask nylonnettet ved å sende ytterligere fire milliliter PBS. Sentrifuger deretter den filtrerte oppløsningen ved 10 til 100 ganger G i ett minutt.
Kast den overnaturlige og resuspend pellet i 10 milliliter PBS før farging. Etter å ha lastet ned Fiji-distribusjonen av bilde J, åpne Fiji og klikk på hjelp, oppdater og administrer oppdateringsnettsteder. Sjekk biomed gruppen og IFPB plugins.
Hvis du vil laste ned avhengighetene plugins, ellipse split og morpho lib J.Then click close and apply changes. Deretter laster du ned RStudio og åpner den. Kopier koden fra tekstmanuskriptet til RConsoles kommandolinje, og trykk enter.
skriv deretter inn Y som svar på alle forespørsler om å installere alle våre avhengigheter. Hvis du vil utføre bildekvantifisering, åpner du Fiji og drar analyzenucleation. inn i statuslinjen.
Når skriptredigeringsvinduet åpnes, klikker du kjør nederst til venstre. En dialogboks vil dukke opp ber om plasseringen av utdatakatalogen. Velg mappen der alle analysedata, tall og andre data som brukes av programvaren, skal lagres.
I analyseparameterne velger du plasseringen av bildene som skal analyseres, og skriver inn bildefilnavnformatet ved hjelp av regulære uttrykk. Når du har valgt ønskede innstillinger, klikker du OK. Etter hvert som bilder fra ulike stadier av analysepipelinen vises på skjermen, må du inspisere dem for å forsikre deg om at terskelen og segmenteringen skjer på riktig måte. Åpne analyzemultinucleatedserver.
r i Rstudio. Deretter skriver du inn filbanen til utdatamappen som er valgt i det siste trinnet, til variabelnavnet mappenavn, og deretter skrives inn filbanen til utdatamappen som ble valgt i det siste trinnet uten den endelige skråstreken. Klikk kjør app øverst til venstre i skriptredigeringsvinduet.
Bruk glidebryterne til å angi terskler for minimum gyldig kjernefysisk gjennomsnittsintensitetsterskelen, den minste gyldige kjernefysiske områdeterskelen og den maksimale gyldige minimumserretiamet for kardiomyocytter. Rull ned og klikk bruk valgte terskler, og klikk deretter plottintensitetsfordeling, noe som vil gjengi en plott av kjernens intensitetsfordelingen av hele eksemplet, samt separate delplott for hver grupperingsvariabel. Hvis du vil ta hensyn til intrasample-variasjon, blar du ned og kontrollerer normaliseringen separat etter gruppe, og deretter klikker du beregn knep og plotte estimert knepdistribusjon.
Når den normaliserte hele prøvegrafen vises, skal de to toppmønstrene være synlige. Bruk glidebryterne og velg terskler for å isolere diploid og tetraploid topper fra hverandre og outliers. Rull deretter ned og klikk beregn ploidy og kjerner.
Til slutt klikker du på knappeplottet og lagrer i resultatmappen. Denne metoden kan brukes til å isolere ensartede entallerte kardiomyocytter som er relativt rene uten å forurense celler. Det er lett å implementere og gir konsistent kardiomyocyte utbytter og kvalitet fra ulike isolasjoner.
Kardiomyocytter isolert med denne protokollen kan farges ved hjelp av antistoffer og fluorokrom konjugerte azider. For å vise den karakteristiske Z linje farging mønster av sarcomeres, cellene ble farget med antistoffer gjenkjenne alfa actinin. I et eget eksperiment ble EdU administrert til mus før de isolerer faste kardiomyocytter.
Etter isolasjon ble de mononukleated, binucleated og trinucleated kardiomyocytter som hadde gjennomgått S-fase oppdaget. For å identifisere individuelle kjerner var det opprinnelige DNA-farget bildet terskelet basert på intensitet. Ellipsene var egnet til atommaskene, og segmenterte individuelle kjerner.
Deretter ble bildepunktene i bildet partisjonert i territorier basert på ellipsen som de er mest proksimale, og grensene til disse områdene ble brukt til å trekke linjer gjennom kjernefysiske klynger. En lignende segmenteringsprosess ble brukt til å oppdage kardiomyocytter. Denne segmenteringsstrategien viste at flertallet av kardiomyocytter fra nyfødte mus er mononukleated.
Frekvensen av mononukleated kardiomyocytter er mye lavere i to uker gamle mus, hvor de utgjør ca 25% av den totale kardiomyocytterpopulasjonen. Når ploidy status for individuelle kjerner i kardiomyocytter ble målt, ble en høyere frekvens av tetraploid kjerner oppdaget hos juvenile mus. Når du isolerer kardiomyocytter, er det viktig å verifisere at alle celleklopper har brutt opp triturasjonen.
Målet med dette arbeidet er å utvikle en metode for å reprodusere kardiomyocytter fra det voksne hjertet og måle DNA-innhold og kjerner.
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved