6.4K Views
•
08:41 min
•
October 7th, 2020
DOI :
October 7th, 2020
•0:04
Introduction
0:50
Perfusion and Fixation of the Heart
1:52
Isolation of Fixed Cardiomyocytes
3:17
Image Quantification and Data Analysis
4:53
Data Analysis
6:25
Results: Segmentation and Classification of Isolated Cardiomyocytes
8:19
Conclusion
Transcript
Этот протокол обеспечивает метод для изоляции стержня формы кардиомиоцитов из любой сердечной ткани, которые затем могут быть использованы для измерения плоидии и нуклеации статус этих кардиомиоцитов без ручного анализа. По сравнению с другими методами, наш протокол обеспечивает более последовательную урожайность клеток и морфологию клеток, и в отличие от цитометрии потока, мы можем визуально проверить нуклеацию и плоиди статус кардиомиоцитов. Визуальная демонстрация этого метода имеет важное значение, потому что разделение и ассоциация сердечной ткани легче оценить.
Начните с размещения усыпленной мыши в положении на спине, и лентой вниз расширенные конечности. Используйте тупые ножницы, чтобы прорезать грудь, чтобы разоблачить сердце. Затем вырежьте нисходящую аорту и адскую каву вены.
Используйте перистальтический насос, прикрепленный к набору инфузии с иглой бабочки 23 калибра, чтобы окутать сердце путем введения трех миллилитров раствора хлорида калия PBS через левый желудочек. Убедитесь в том, чтобы не пробить перегородку. Затем ввимим 10 миллилитров раствора 4%PFA в течение 10 минут со скоростью одного миллилитра в минуту.
Используйте ножницы, чтобы удалить все сердце. И при желании изолировать конкретный регион. Поместите ткань в 1,5 миллилитровую центрифугу, содержащую один миллилитр раствора 4%PFA.
Инкубировать его на рокер в течение одного часа. Поместите сердце в чашку Петри с раствором PBS. Сожмите его, чтобы избавиться от любых PFA оставшихся в желудочках и мыть его в PBS.
Поместите фиксированное сердце в новую 1,5 миллилитровую трубку, содержащую коллагенатный раствор. Затем инкубировать сердце на рокер при 37 градусов по Цельсию в одночасье. На следующий день положите сердце в 35-миллиметровую чашку Петри, содержащую коллагеновый раствор, и развяжте ее на одну миллиметровую кусочки с помощью типсов или ножниц.
Затем используйте перенесите пипетку для дальнейшего тритурата диссоциированной ткани в течение двух минут. Если частицы ткани все еще остаются, используйте пипетку с более узким кончиком и продолжайте тритурацию до тех пор, пока большая часть ткани не будет разбита. Поместите нейлоновую сетку диаметром от 200 до 600 микрометров над 15-миллиметровой центрифугой.
Добавьте пять миллилитров PBS в диссоциированные клетки и отфильтруйте их через нейлоновую сетку. Вымойте нейлоновую сетку, пройдя дополнительные четыре миллилитров PBS. Затем центрифуга фильтруется раствор на 10 до 100 раз G в течение одной минуты.
Откажитесь от супернатанта и повторно посовелите гранулы в 10 миллилитров PBS до окрашивания. После загрузки Фиджи распределения изображения J, открыть Фиджи и нажмите на помощь, обновление и управление обновления сайтов. Проверьте биомедицинскую группу и плагины IFPB.
Чтобы загрузить плагины зависимостей, эллипс разделить и морфо lib J.Then нажмите близко и применить изменения. Далее, скачать RStudio и открыть его. Скопировать код из текстовой рукописи в командную строку RConsole и нажмите введите.
затем введи Y в ответ на все подсказки для установки всех наших зависимостей. Для выполнения количественной оценки изображений откройте Фиджи и перетащите анализ. py в статус-бар.
Когда откроется окно редактирования скриптов, нажмите кнопку «Бег в левом нижнем углу». Всплывает диалоговое окно с запросом местоположения каталога выходных данных. Выберите папку, в которой будут храниться все данные анализа, цифры и другие данные, используемые программным обеспечением.
В параметрах анализа выберите местоположение изображений, которые будут проанализированы, и введите формат имени файла изображения с помощью обычных выражений. После выбора нужных настроек нажмите OK. По мере того, как изображения с различных этапов конвейера анализа отображаются на экране, проверяйте их, чтобы убедиться, что пороговые значения и сегментация происходят должным образом. Открытый анализмультинуцированный серватор.
г в Rstudio. Далее, к имени папки с переменным именем, ввемите путь файла к папке выходных данных, выбранной на последнем этапе без окончательного слэша. Нажмите запустить приложение в левом верхнем углу окна редактирования скрипта.
Используйте ползунки, чтобы установить пороговые значения для минимального допустимого порога ядерной среднего интенсивности, минимального допустимого порога ядерной зоны и максимально допустимого минимального диаметра хорьков для кардиомиоцитов. Прокрутите вниз и нажмите применить выбранные пороги затем нажмите распределение интенсивности участка, который будет оказывать участок распределения интенсивности ядра всего образца, а также отдельные подсюжеты для каждой переменной группировки. Для учета внутрисемейных вариаций прокрутите вниз и проверьте нормализацию отдельно по группе, затем нажмите вычислить ploidy и график предполагаемого распределения ploidy.
Как только нормализованный график всего образца появляется, два пиковых шаблона должны быть видны. Используйте ползунки и выберите пороги, чтобы изолировать диплоидные и тетраплоидные пики друг от друга и выбросы. Затем прокрутите вниз и нажмите вычислить ploidy и нуклеации.
Наконец, нажмите на кнопку участка и сохранить в папку результатов. Этот метод может быть использован для изоляции равномерно сингулярных кардиомиоцитов, которые являются относительно чистыми без загрязнения клеток. Это легко реализовать и обеспечивает последовательные выходы кардиомиоцитов и качество от различных изоляций.
Кардиомиоциты, изолированные с помощью этого протокола, могут быть окрашены с помощью антител и конъюгированных флюорохромных азидов. Чтобы показать характерный рисунок окрашивания линии сармеров, клетки были окрашены антителами, распознавающих альфа-актинин. В отдельном эксперименте, ЭдУ вводили мышам, прежде чем изолировать фиксированные кардиомиоциты.
После изоляции были обнаружены мононуклеированные, бинуклеированные и тринуклеированные кардиомиоциты, прошедшие S-фазу. Для идентификации отдельных ядер исходное изображение, окрашенное ДНК, было пороговым в зависимости от интенсивности. Эллипсы были пригодны для ядерных масок, сегментации отдельных ядер.
Далее пиксели изображения были разделены на территории, основанные на эллипсе, к которому они наиболее проксимальна, и границы этих территорий использовались для прорисовки линий через ядерные кластеры. Аналогичный процесс сегментации был использован для обнаружения кардиомиоцитов. Эта стратегия сегментации показала, что большинство кардиомиоцитов у новорожденных мышей мононуклеированы.
Частота мононуклеированных кардиомиоцитов значительно ниже у двухнедельных мышей, где они составляют около 25% от общей популяции кардиомиоцитов. При измерении плоидного статуса отдельных ядер в кардиомиоцитах у несовершеннолетних мышей была обнаружена более высокая частота тетраплоидных ядер. При изоляции кардиомиоцитов, важно проверить все клеточные сгустки распались от их тритурации.
Целью этой работы является разработка метода воспроизводимой изоляции кардиомиоцитов от взрослого сердца и измерения содержания и нуклеации ДНК.
Explore More Videos
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved