Isolering av kardiomyocyter från fasta hjärtan för immuncytokemi och ploidyanalys

Detta protokoll ger en metod för att isolera stavformade kardiomyocyter från någon hjärtvävnad, som sedan kan användas för att mäta ploidy och kärnbildning status av dessa kardiomyocyter utan manuell analys. Jämfört med andra tekniker, ger vårt protokoll mer konsekvent cell avkastning och cell morfologi, och i motsats till flödet cytometry, vi kan visuellt verifiera nucleation och ploidy status kardiomyocyter. Den visuella demonstrationen av denna metod är viktig eftersom hjärtvävnadsuppdelningen och associationen är lättare att uppskatta.

Börja med att placera den avlivade musen i en ryggposition, och tejpa ner de förlängda lemmarna. Använd rakt på sak sax för att skära genom bröstet för att exponera hjärtat. Skär sedan den fallande aorta och inferial vena cava.

Använd en peristaltisk pump fäst vid en infusion set med en 23 gauge butterfly nål för att genomsyra hjärtat genom att injicera tre milliliter kaliumklorid PBS lösning genom den vänstra ventrikeln. Se till att inte tränga igenom septum. Injicera sedan 10 milliliter 4%PFA-lösning i 10 minuter med en hastighet av en milliliter per minut.

Använd sax för att ta bort hela hjärtat. Och om så önskas, isolera en specifik region. Placera vävnaden i ett centrifugeringsrör på 1,5 milliliter som innehåller en milliliter 4%PFA-lösning.

Inkubera den på en vipp i en timme. Placera hjärtat i en petriskål med PBS-lösning. Pressa den för att bli av med eventuella PFA kvar i ventriklarna och tvätta den i PBS.

Sätt fast hjärta i ett nytt 1,5 milliliterrör som innehåller kollagenatlösning. Sedan ruva hjärtat på en vipp på 37 grader Celsius över natten. På nästa dag, sätta hjärtat i en 35 millimeter Petri skålen innehåller kollagenate lösning, och separera den i en millimeter bitar med tlys eller sax.

Använd sedan en överföringspipett för att ytterligare triturtera den dissocierade vävnaden i två minuter. Om vävnadspartiklar fortfarande finns kvar, använd en pipetten med en smalare spets och fortsätt triturationen tills majoriteten av vävnaden bryts ned. Placera en 200 till 600 mikrometer nylon nät över en 15 millimeter centrifug röret.

Tillsätt fem milliliter PBS till de dissocierade cellerna och filtrera dem genom nylonnätet. Tvätta nylonnätet genom att passera ytterligare fyra milliliter PBS. Därefter centrifug den filtrerade lösningen vid 10 till 100 gånger G i en minut.

Kassera supernatanten och resuspend pelleten i 10 milliliter PBS före färgning. Efter att ha laddat ner Fiji-distributionen av bild J, öppna Fiji och klicka på hjälp, uppdatera och hantera uppdateringswebbplatser. Kontrollera biomed gruppen och IFPB plugins.

För att ladda ner beroenden plugins, ellips split och morpho lib J.Klicka sedan på Stäng och tillämpa ändringar. Därefter hämtar du RStudio och öppnar den. Kopiera koden från textmanuskriptet till RConsoles kommandorad och tryck på enter.

sedan skriver Y som svar på alla uppmaningar att installera alla våra beroenden. För att utföra bildkvantifiering, öppna Fiji och dra analyseranuklering. py in i statusfältet.

När skriptredigeringsfönstret öppnas klickar du på kör i det nedre vänstra hörnet. En dialogruta kommer att dyka upp och be om platsen för utdatakatalogen. Välj den mapp där alla analysdata, siffror och andra data som används av programvaran kommer att lagras.

I analysparametrarna väljer du platsen för de bilder som ska analyseras och ange bildfilnamnsformatet med hjälp av reguljära uttryck. Klicka på OK när du har valt önskade inställningar. När bilder från olika stadier av analyspipelinen visas på skärmen inspekterar du dem för att kontrollera att tröskelvärdet och segmenteringen sker på rätt sätt. Öppna analyseramultinuceradserver.

r i Rstudio. Nästa, till variabeln som heter mappnamn skriver du filsökvägen till den utdatamapp som valts i det sista steget utan det slutgiltiga snedstrecket. Klicka på Kör app i det övre vänstra hörnet av skriptredigeringsfönstret.

Använd skjutreglagen för att ange tröskelvärden för lägsta giltiga kärnämnesintensitetströskeln, lägsta giltiga tröskelvärde för kärnområde och den högsta giltiga minsta illrarnas diameter för kardiomyocyter. Bläddra nedåt och klicka på tillämpa valda tröskelvärden klicka sedan på plott intensitetsfördelning, som kommer att återge en tomt av kärnan intensitet fördelningen av hela urvalet samt separata subplots för varje gruppering variabel. För att ta hänsyn till intrasample variation, bläddra ner och kontrollera normalisera separat efter grupp sedan klicka på beräkna ploidy och rita uppskattade ploidy distribution.

När den normaliserade hela provgrafen visas bör de två toppmönstren vara synliga. Använd skjutreglagen och välj tröskelvärden för att isolera diploid- och tetraploidtopparna från varandra och extremvärden. Bläddra sedan ner och klicka på beräkna ploidy och kärnbildning.

Slutligen klickar du på knappen tomt och spara i resultatmapp. Denna metod kan användas för att isolera enhetligt singulariserade kardiomyocyter som är relativt rena utan att förorena celler. Det är lätt att genomföra och ger konsekvent kardiomyocyte avkastning och kvalitet från olika isoleringar.

Kardiomyocyter isolerade med detta protokoll kan färgas med hjälp av antikroppar och fluorokrom konjugerade azider. För att visa den karakteristiska Z linje färgning mönster av sarcomeres, cellerna var färgas med antikroppar erkänner alpha aktinin. I ett separat experiment administrerades EdU till möss innan man isolerade fasta kardiomyocyter.

Efter isolering upptäcktes de mononucleated, binucleated och trinucleated kardiomyocytes som hade genomgått S-fas. För att identifiera enskilda atomkärnor, var den ursprungliga DNA-färgade bilden tröskelvärdet baserat på intensitet. Ellipser var lämpliga att nukleära masker, segmentera enskilda kärnor.

Därefter delades pixlarna i bilden in i territorier baserade på ellipsen som de är mest proximala till, och gränserna för dessa territorier användes för att dra linjer genom kärnkluster. En liknande segmentering process användes för att upptäcka kardiomyocyter. Denna segmentering strategi visade att majoriteten av kardiomyocyter från nyfödda möss är mononucleated.

Frekvensen av mononucleated kardiomyocyter är mycket lägre i två veckor gamla möss, där de utgör cirka 25%av den totala kardiomyocyter befolkningen. När ploidy status enskilda kärnor inom kardiomyocyter mättes, en högre frekvens av tetraploid kärnor upptäcktes i juvenil möss. När du isolerar kardiomyocyter, Det är viktigt att verifiera alla cell klumpar har brutit upp sin trituration.