Name: a femtoliter droplet array for massively parallel protein synthesis from single dna molecules
Uploaded: 2020-06-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Femtoliter Droplet Array for Massively Parallel Protein Synthesis from Single DNA Molecules at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato dal numero di sovvenzione JP18K14260 di JSPS KAKENHI e dal bilancio dell'Agenzia giapponese per la scienza e la tecnologia della Terra dei Animali. Ringraziamo Shigeru Deguchi (JAMSTEC) e Tetsuro Ikuta (JAMSTEC) per aver fornito le strutture di caratterizzazione. Ringraziamo Ken Takai (JAMSTEC) per il supporto software commerciale. La microfabbricazione è stata condotta presso Takeda Sentanchi Supercleanroom, L'Università di Tokyo, sostenuta da "Nanotechnology Platform Program" del Ministero dell'Istruzione, Cultura, Sport, Scienza e Tecnologia (MEXT), Giappone, Grant Number JPMXP09F19UT0087.

1. Microfabbricazione del substrato di matrice a microcamera femtolare
NOTA: condurre il seguente esperimento di microfabbricazione in una camera pulita. Indossare guanti e un abito da camera pulita prima di entrare nella camera pulita.
<ol><li>Pulizia del substrato di vetro di copertura<ol>
<li>Impostare il vetro di copertura su una barra di rivestimento in vetro di copertura. Sonicare il vetro di copertura in idrossido di sodio 8 M (NaOH) per 15 min a temperatura ambiente (RT). AVVISO: ...

La misurazione altamente quantitativa basata sulle goccioline altamente uniformi, stabili e biocompatibili di FemDA ha permesso la distribuzione discreta, caratteristica unica del nostro studio diversa dalle altre. Abbiamo sistematicamente ottimizzato e dettagliato i processi di microfabbricazione e formazione delle goccioline in questo documento. Ci sono diversi passaggi critici nel protocollo stabilito.
In primo luogo, il rivestimento uniforme del polimero CYTOP altamente viscoso sul substra...

I ricercatori utilizzano i reattori per eseguire reazioni biochimiche. Ci sono sforzi significativi che sono stati fatti per ridurre le dimensioni del reattore e aumentare la produttività sperimentale al fine di ridurre il consumo di reagente migliorando al contempo l'efficienza del lavoro. Entrambi gli aspetti mirano a liberare i ricercatori da un carico di lavoro pesante, riducendo i costi e accelerando la ricerca e lo sviluppo. Abbiamo una chiara tabella di marcia storica sullo sviluppo delle tecnologie dei reattori dal punto di vista dei volumi di reazione e della produttività: singoli becher/flask/test-tube, tubi milliliter, tubi microliter, nanotubi microliter 8 tubi, microliter 96/384/1536-bene piastra, e reattori microfluidici nanoliter/picoliter/picoliter/11,2,3,4,5,6,7. Analogo al ridimensionamento delle dimensioni delle caratteristiche dei transistor sui chip di circuito integrati nell'industria dei semiconduttori negli ultimi decenni, i microreattori bio/chimici stanno attraversando la riduzione del volume e l'integrazione del sistema. Tali strumenti su piccola scala hanno avuto un profondo impatto sulla biologia sintetica basata su cellule o senza cellule, sulla bioproduzione e sulla prototipazione e lo screening ad alta produttività8,9,10,1111,12. Questo documento descrive il nostro recente sforzo sullo sviluppo di una tecnologia unica di array di gocciolini e dimostra la sua applicazione in CFPS13, una tecnologia fondamentale per la biologia sintetica e le comunità di screening molecolare14. In particolare, forniamo intenzionalmente un protocollo ottimizzato e a basso costo per rendere il dispositivo FemDA accessibile a tutti. Il protocollo a basso costo e facile da gestire per il dispositivo miniaturizzato contribuirebbe agli scopi educativi delle università e contribuirebbe a diffondere la tecnologia.
FemDA prepara le goccioline di femtoter ad una densità ultraelevata di 106 per 1 cm2 su un substrato di vetro planare. Abbiamo rivestito un polimero idrofobico, CYTOP15, sul substrato di vetro e inciso selettivamente (rimosso) CYTOP in posizioni predefinite per generare un array a microcamera sul substrato. Così, la microcamera risultante è composta da una parete laterale idrofobica (CYTOP) e un fondo idrofilo (vetro). Quando scorre in sequenza acqua e olio sulla superficie modellata, l'acqua può essere intrappolata e sigillata nelle microcamere. La struttura idrofila-in-idrofobica è vitale per respingere l'acqua al di fuori delle microcamere, isolare i singoli microreattori e mantenere una piccola soluzione acquosa all'interno dello spazio femtolitro. La proprietà unica è stata applicata con successo per la preparazione di goccioline acqua-in-olio e lipidi bistrato microcomogni16,17. Rispetto al prototipo del dispositivo16,abbiamo prima ottimizzato il processo di microfabbricazione per realizzare una rimozione completa del polimero CYTOP e una completa esposizione del fondo di vetro. CYTOP è un fluoropolimero speciale con una tensione superficiale estremamente bassa (19 mN/m) inferiore a quella dei materiali convenzionali di microreattore come vetro, plastica e silicone. Le sue buone prestazioni ottiche, elettriche e chimiche sono già state utilizzate nel trattamento superficiale di dispositivi microfluidici18,19,20,21,22,23,24. Nel sistema FemDA, per ottenere una buona bagnatura dell'olio sulla superficie CYTOP, la tensione superficiale dell'olio deve essere inferiore a quella della superficie solida25. In caso contrario, l'olio liquido a contatto con la superficie solida tende a diventare sferico piuttosto che diffondersi sulla superficie. Inoltre, abbiamo scoperto che alcuni oli di perfluorocarburi popolari (ad esempio, 3M FC-40)16 e oli idrofluoroetering (ad esempio, serie 3M Novec) possono sciogliere CYTOP a causa della morfologia amorfo di CYTOP, che è fatale per la misurazione quantitativa e sarebbe discutibile in termini di contaminazione incrociata tra le goccioline. Fortunatamente, abbiamo identificato un olio biocompatibile ed ecologico che mostra una tensione superficiale inferiore (< 19 mN/m)13. Abbiamo anche trovato un nuovo surfactant che può sciogliere nell'olio selezionato e funzionare in una bassa concentrazione (0.1%, almeno 10 volte inferiore a quelli precedentemente segnalati popolari26,27)13. L'interfaccia acqua/olio risultante può essere stabilizzata dal surfactant. A causa dell'elevato tasso di evaporazione dell'olio, seguendo il filo con l'olio, abbiamo applicato un altro olio biocompatibile e rispettoso dell'ambiente per sostituire il primo a sigillare le microcamere. Chiamiamo il primo olio (ASAHIKLIN AE-3000 con 0,1 wt % SURFLON S-386) il "olio a filo" e il secondo olio (Fomblin Y25) l'"olio di sgelazione", rispettivamente.
La strategia di sigillamento dell'olio in due fasi può realizzare una solida formazione dell'array di goccioline femtoliter in pochi minuti e senza strumentazione sofisticata. A causa del problema dell'evaporazione, è stato considerato difficile generare microreattori più piccoli dei volumi di picoliter28. FemDA ha affrontato questo problema ottimizzando sistematicamente i materiali e i processi utilizzati per la preparazione di microreattori/goccioline. Diverse caratteristiche degne di nota delle goccioline risultanti includono l'alta uniformità (o monodispersità), la stabilità e la biocompatibilità su scala femtolare. Il coefficiente di variazione (CV) del volume delle goccioline è solo del 3% (senza correzione della vignettatura per le immagini microscopiche), il più piccolo CV tra le piattaforme di goccioline al mondo, che garantisce una misurazione altamente parallela e quantitativa. La goccia di femtolitro è stabile per almeno 24 ore senza contaminazione incrociata tra le goccioline a temperatura ambiente, il che è prezioso per una misurazione affidabile del percorso temporale. Per quanto riguarda la biocompatibilità, siamo riusciti a sintetizzare varie proteine da un DNA modello a copia singola nella goccia femtolitro, che in precedenza era stata considerata difficile o inefficiente29,30. Sarebbe degno di chiarire perché alcune proteine in grado di essere sintetizzate nel FemDA non possono essere sintetizzate in altri sistemi di goccioline. FemDA non era solo un avanzamento tecnico, ma ha anche realizzato una misurazione quantitativa senza precedenti in grado di correlare la resa proteica (come riflesso dall'intensità di fluorescenza della gocciolina) al numero di molecole di DNA modello in ogni goccia. Di conseguenza, l'istogramma dell'intensità di fluorescenza delle goccioline dei CFPS con sede a FemDA ha mostrato una distribuzione discreta che può essere ben montata da una somma di distribuzioni gaussiane di intervalli picco-picco uguali. Inoltre, la probabilità di comparsa di goccioline contenenti diversi numeri di molecole di DNA era perfetta per una distribuzione di Poisson31. Così, la diversa resa proteica in ogni goccia può essere normalizzata in base alla distribuzione discreta. Questa caratteristica critica ci permette di separare le informazioni sull'attività ezimatica dall'intensità apparente, che non è ancora disponibile con altre piattaforme di microreattore. I sistemi di smistamento microfluidici esistenti per cellule microfluidiche sono abili nello smistamento completamente automatico e sono bravi a concentrare i campioni, ma a volte possono produrre solo un istogramma relativamente ampio o a coda lunga nell'aspetto analitico32,33. Il nostro sistema FemDA altamente quantitativo e biocompatibile stabilisce un nuovo punto di riferimento e un elevato standard analitico nel campo dello sviluppo di microreattori.
Gli oli e i surfactants che potrebbero essere utilizzati per la preparazione delle goccioline sono ancora molto limitati34. La combinazione di ASAHIKLIN AE-3000 e SURFLON S-386 stabilita a FemDA è un nuovo membro del crescente arsenale dell'interfaccia fisiochimica tra la fase acquosa e la fase dell'olio13. La nuova interfaccia in FemDA è fisicamente stabile, chimicamente inerte, e biologicamente compatibile con la trascrizione complessa, traduzione, e macchinare di modifica post-traduzione per molti tipi di proteine13. Sarebbe piuttosto interessante trovare una proteina che non può essere sintetizzata nelle impostazioni delle goccioline. Inoltre, il risparmio sui costi dei reagenti è più evidente nel sistema di gocciolina del femtolitro rispetto a quello dei sistemi di reattori nanoliter e picoliter35,36. In particolare, ci sarebbe spesso un grande volume morto, che è causato principalmente da tubi o forniture esterne, nei sistemi microfluidici di generazione di gocciolini, ma non nel nostro FemDA. Il formato della matrice è favorito anche dalla caratterizzazione microscopica ripetuta e dettagliata (simile alla cosiddetta analisi ad alto contenuto) per ogni singolo reattore37, piuttosto che una sola istantanea per un oggetto in rapido movimento. La scala femtobotera ha permesso l'integrazione di oltre un milione di reattori su un'area grande di un dito, mentre lo stesso numero di reattori nanollitri (se esiste) richiede un'area di metro quadrato, il che sarebbe indubbiamente poco pratico per la produzione o l'uso di tale sistema.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>(3-aminopropyl)triethoxysilane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>440140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS-01T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-propanol</td>
			<td>Kanto Chemical</td>
			<td>EL grade</td>
			<td>EL: for electronic use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D laser scanning confocal microscope</td>
			<td>Lasertec</td>
			<td>OPTELICS HYBRID</td>
			<td>Other similar microscopes (e.g., Keyence VK-X1000, Olympus LEXT OLS5000) are also applicable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL syringe</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS-50LZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6,8-difluoro-4-methylumbelliferyl phosphate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D6567</td>
			<td>Prepare a 5 mM stock solution in dimethyl sulfoxide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Kanto Chemical</td>
			<td>EL grade</td>
			<td>EL: for electronic use. 
			Purity 99.8%.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air blower</td>
			<td>Hozan</td>
			<td>Z-263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum block</td>
			<td>BIO-BIK</td>
			<td>AB-24M-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum microtube stand</td>
			<td>BIO-BIK</td>
			<td>AB-136C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ASAHIKLIN AE-3000</td>
			<td>AGC</td>
			<td>(Test sample)</td>
			<td>Free test sample may be available upon inquiry to AGC.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BEMCOT PS-2 wiper</td>
			<td>Ozu</td>
			<td>028208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch with plunger</td>
			<td>Kai</td>
			<td>BPP-10F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Matsunami Glass</td>
			<td>No. 1 (24 mm &#215; 32 mm, 0.13~0.17 mm thickness)</td>
			<td>Size-customized.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass staining rack</td>
			<td>Nakayama</td>
			<td>803-131-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CRECIA TechnoWipe clean wiper</td>
			<td>Nippon Paper Crecia</td>
			<td>C100-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cutting mat</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>WB100020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CYTOP</td>
			<td>AGC</td>
			<td>CTL-816AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deaeration mixer</td>
			<td>Thinky</td>
			<td>AR-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desktop cutter</td>
			<td>Roland</td>
			<td>STIKA SV-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Developer</td>
			<td>AZ Electronic Materials</td>
			<td>AZ 300 MIF</td>
			<td>AZ Electronic Materials was now acquired by Merck. 
			Other alkaline developers may be also applicable but should require optimization of development conditions (time, temperature, etc.)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-coated adhesive Kapton film tape</td>
			<td>Teraoka Seisakusho</td>
			<td>7602 #25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Kanto Chemical</td>
			<td>EL grade</td>
			<td>EL: for electronic use. 
			Purity 99.5%.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Version: ImageJ 1.51n</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-cable cutter</td>
			<td>Tokyo-IDEAL</td>
			<td>MT-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fomblin oil</td>
			<td>Solvay</td>
			<td>Y25, or Y25/6</td>
			<td>Free test sample may be available upon inquiry to Solvay. Fomblin Y25/6 is an alternative if Y25 is not readily available.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>TH-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>NN-2270C</td>
			<td>22G &#215; 70 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted fluorescence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ti-E</td>
			<td>Epifluorescence specification, CCD or sCMOS camera, motorized stage, autofocus system, and high NA objective lens are required.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KaleidaGraph</td>
			<td>Synergy</td>
			<td></td>
			<td>Version: 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mask aligner</td>
			<td>SUSS</td>
			<td>MA-6</td>
			<td>Other mask aligners are also applicable as long as the vacuum contact mode is avaliable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICROMAN pipette</td>
			<td>GILSON</td>
			<td>E M250E</td>
			<td>Capillary piston tip: CP250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Version: 16.16.15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini vacuum chamber</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>MVP-100MV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>NIPPON GENE</td>
			<td>316-90101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Amcor</td>
			<td>PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tube</td>
			<td>NIPPON Genetics</td>
			<td>FG-021D/SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>GD90-15</td>
			<td>Diameter 90 mm, height 15 mm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoresist</td>
			<td>AZ Electronic Materials</td>
			<td>AZ P4903</td>
			<td>AZ Electronic Materials was now acquired by Merck. AZ P4620 is an alternative.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>POWERSCAN HT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethelene gloves</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>6-896-02</td>
			<td>Trade name: Saniment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PURExpress in vitro protein synthesis kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E6800S or E6800L</td>
			<td>For cell-free protein synthesis reaction.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reactive-ion etching system</td>
			<td>Samco</td>
			<td>RIE-10NR</td>
			<td>Other RIE systems are also applicable but should require optimization of RIE conditions (gas flow rate, chamber pressure, RF power, etching time, etc.)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase inhibitor</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0314S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scotch tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>810-1-18D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide solution</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td>
			<td>194-09575</td>
			<td>8 M concentration; danger.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater</td>
			<td>Oshigane</td>
			<td>SC-308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SURFLON S-386 surfactant</td>
			<td>AGC</td>
			<td>(Test sample)</td>
			<td>Free test sample may be available upon inquiry to AGC.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184 silicone elastomer</td>
			<td>Dow</td>
			<td>Sylgard184</td>
			<td>Chemical composition: polydimethylsiloxane. The default mixing ratio is base : curing agent = 10 : 1 (m/m).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Ideal-tek</td>
			<td>2WF.SA.1 
			2A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaner</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>ASU-2M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum chuck</td>
			<td>Oshigane</td>
			<td>(Customized)</td>
			<td>Material: delrin; rectangular sample stage with multiple holes (48 holes, each with 1 mm diameter); the size is customzied to fit the size of the cover glass (24 mm &#215; 32 mm).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a femtoliter droplet array for massively parallel protein synthesis from single dna molecules

I progressi nella risoluzione spaziale e nella sensibilità di rilevamento della strumentazione scientifica consentono di applicare piccoli reattori per la ricerca biologica e chimica. Per soddisfare la domanda di microreattori ad alte prestazioni, abbiamo sviluppato un dispositivo FemDA (Femtoliter droplet array) ed esemplificato la sua applicazione in reazioni di sintesi proteica senza cellule (CFPS) massicciamente parallele. Più di un milione di goccioline uniformi sono state prontamente generate all'interno di un'area delle dimensioni di un dito utilizzando un protocollo di sigillamento dell'olio in due fasi. Ogni goccia era ancorata in una microcamera femtolare composta da un fondo idrofilo e da una parete laterale idrofobica. La struttura ibrida idrofilo-in-idrofobico e gli oli e i surfactants di tenuta dedicati sono fondamentali per mantenere stabilmente la soluzione femtoliter aqueous nello spazio femtoliter senza perdita di evaporazione. La configurazione femtoliter e la semplice struttura del dispositivo FemDA hanno permesso un consumo minimo di reagenti. La dimensione uniforme dei reattori a goccia ha reso convincenti e affidabili le misurazioni quantitative e temporali su larga scala. La tecnologia FemDA ha correlato la resa proteica della reazione CFPS con il numero di molecole di DNA in ogni goccia. Abbiamo semplificato le procedure relative alla microfabbricazione del dispositivo, alla formazione delle goccioline del femtoltro e all'acquisizione e all'analisi dei dati microscopici dell'immagine. Il protocollo dettagliato con il basso costo di funzionamento ottimizzato rende la tecnologia FemDA accessibile a tutti coloro che hanno impianti standard di pulizia e un microscopio a fluorescenza convenzionale al proprio posto.

Il processo di microfabbricazione consiste nella pulizia del substrato, nella funzionalizzazione della superficie, nel rivestimento CYTOP, nella fotolitografia, nell'incisione a secco, nella stripping fotoresista e nella pulizia finale. È importante sottolineare che il protocollo presentato ha permesso la rimozione completa del polimero civetta ciforo idrofobico all'interno delle microcamere Figura 3A), producendo una struttura idrofilo-in-idrofobico altamente parallela su un substrato di v...

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A Femtoliter Droplet Array for Massively Parallel Protein Synthesis from Single DNA Molecules

L'obiettivo generale del protocollo è quello di preparare oltre un milione di goccioline di femminiter ordinate, uniformi, stabili e biocompatibili su un substrato di 1 cm2 planari che può essere utilizzato per la sintesi proteica priva di cellule.

Un array di gocciole del femtolitro per sintesi proteica massicciamente parallela da molecole di DNA singolo

Advances in spatial resolution and detection sensitivity of scientific instrumentation make it possible to apply small reactors for biological and ...

Più di un milione di uniformi delle goccioline sono prodotte sul substrato delle dimensioni di un dito. E singole molecole di DNA sono distribuite casualmente in ogni goccia. La resa proteica è proporzionale al numero di molecole in una goccia.La nostra tecnica può essere utilizzata per una misurazione rapida e quantitativa dell'attività enzimatica senza complicate espressioni proteiche e purificazione. Per iniziare, impostare un vetro di copertura su un rack di colorazione e posizionare il rack in otto idrossido di sodio molare. Sonicare il vetro di copertura e il rack di colorazione per 15 minuti a temperatura ambiente.Rimuovere il rack di colorazione dall'idrossido di sodio e sciacquare il vetro di copertura con acqua 10 volte. Asciugare il vetro di copertura con una pistola ad aria compressa. Quindi cuocere e asciugare il vetro di copertura su una piastra calda a 200 gradi Celsius per cinque minuti.Preparare la soluzione di aminosilano dello 0,05%. Immergere il vetro di copertura in questa soluzione e incubarlo per un'ora a temperatura ambiente. Risciacquare il vetro di copertura cinque volte in acqua pura.Quindi asciugare il vetro di copertura usando una pistola ad aria compressa. Cuocerlo sul piatto caldo a 80 gradi Celsius per cinque minuti. Posizionare il substrato di vetro di copertura su un mandrino sottovuoto personalizzato per lo spin coater.Erogare da 70 a 90 microlitri di polimero CYTOP di tipo A al centro del substrato di vetro. Quindi girare immediatamente il polimero. Il rivestimento polimerico iniziale danneggia la qualità dell'array di microcamera finale.Erogare il polimero al centro del vetro di copertura senza introdurre bolle d'aria. Raccogliere il vetro rivestito tenendolo agli angoli e posizionarlo su un foglio di alluminio. Cuocerlo per 30 minuti a 80 gradi Celsius e poi per un'altra ora a 200 gradi Celsius.Distribuire da 0,2 a 0,3 millilitri di fotoresist al centro del substrato. Girare immediatamente il fotoresist a 6.000 giri/min per 60 secondi. Utilizzare una salvietta imbevuta di etanolo per rimuovere il fotoresist in eccesso dai bordi del substrato.Cuocere il substrato a 110 gradi Celsius per cinque minuti. Per reidratare il fotoresist, lasciare riposare il substrato per 30 minuti con un'umidità relativa dal 42 al 60%Caricare il substrato nell'allineatore della maschera ed esporlo per 25 secondi in modalità di contatto sottovuoto. Quindi immergere il substrato nello sviluppatore per cinque minuti per sciogliere il fotoresist esposto.Risciacquare il substrato 10 volte utilizzando acqua pura. Quindi asciugare accuratamente il substrato usando la pistola ad aria compressa. Posizionare il substrato nella camera di reazione della macchina di incisione ionica reattiva e incidere il fotoresist coperto CYTOP con il plasma di ossigeno.Dopo l'incisione, rimuovere il fotoresist rimanente sonicando il substrato in acetone per cinque minuti a temperatura ambiente. Quindi sonicare il substrato in propanolo per cinque minuti. Risciacquare, sonicare e risciacquare nuovamente il substrato usando acqua pura come descritto nel manoscritto.Quindi asciugare il substrato con una pistola ad aria compressa. Utilizzando una fresa desktop, tagliare il nastro adesivo kapton a doppia rivestita nelle forme a microcanale definite. Attaccare i pezzi di nastro tagliati nella parte inferiore di una piastra di Petri piatta per fungere da maestro per lo stampaggio del PDMS.Versare la miscela PDMS nella piastra di Petri a nastro. Quindi posizionare la piastra di Petri in una mini camera a vuoto e deaerare la miscela PDMS per una o tre ore. Quindi posizionare la piastra di Petri in un forno a 60 gradi Celsius e lasciarla durante la notte per curare il PDMS.Dopo che il PDMS si è polimerizzato, sbucciare l'elastomero stagionato dalla piastra di Petri e utilizzare una fresa a cavo piatto per tagliare i blocchi di microcanale PDMS. Quindi fare un buco ad ogni estremità di ogni microcanale. Il substrato precedentemente preparato avrà un'area per l'array di microcamera.Posizionare il microcanale PDMS su questa parte del substrato. Quindi inserire una punta del pipetto da 200 microliter in uno dei fori nel microcanale PDMS. In primo luogo, preparare la soluzione di reazione CFPS in un tubo PCR.Quindi, utilizzando una punta del tubo non filtrante a 200 microlitri, redigere 10 microlitri della soluzione. Inserire la punta del tubo nel foro di ingresso del microcanale PDMS e spingere verso il basso sullo stantuffo della pipetta fino a quando la soluzione non trabocca dalla presa del microcanale. Trasferire il dispositivo FemDA in un blocco di alluminio pre-refrigerato.Verificare che l'area dell'array di microcamera si trasformi rapidamente da traslucida a trasparente. Disegnare 300 microlitri di olio a filo prerimente refrigerato e trasferire immediatamente l'olio nella punta del tubo del foro di ingresso del microcanale. L'olio a filo si muove nel microcanale ed estrude la soluzione di reazione in eccesso situata al di fuori delle microcamera.Rimuovere contemporaneamente le due punte delle pipetta inserite dal dispositivo. Spostare immediatamente il dispositivo dal blocco di alluminio alla pellicola di paraffina. Inserire la punta della pipetta preparata contenente l'olio di tenuta nell'ingresso del microcanale PDMS e iniettare l'olio fino a quando non trabocca dall'uscita.Le goccioline del femtolitro sono sigillate in singole microcamera dall'olio. Aprire l'immagine BF sfocata. Per rimuovere sfondi continui smussati da ogni fotogramma, selezionate Sottrai sfondo dal menu Processo.Immettere 20 per il raggio della palla rotolante. Selezionare la casella Anteprima e selezionare Ok. Selezionare Sì quando viene chiesto se elaborare tutte le immagini.Quindi, per ridurre il rumore, selezionare Processo, Filtri, Mediana. Immettere 2,0 per il raggio in pixel. Selezionare la casella Anteprima e selezionare Ok.Selezionare Sì quando viene chiesto se elaborare tutte le immagini. Selezionare Quindi Immagine, Regola, Soglia per separare le immagini delle microcamera dallo sfondo dell'immagine. Scegliere FemDA, FemDA Analysis dal menu Plugins.Immettere il numero minimo e massimo approssimativo di pixel di una singola microcamera. La circolarità minima e massima prevista delle microcamera e i numeri di fotogramma iniziale e finale, quindi selezionare Genera ROI per rilevare le microcamera. Le ROI rilevate correttamente vengono visualizzate nel menu di scelta rapida ROITable.Nella finestra Analisi FemDA selezionare Applica maschera ROI. Esaminare l'immagine per verificare se le microcamera sono state rilevate correttamente. Apri l'immagine a fluorescenza e portala davanti.Fare di nuovo clic su Applica maschera ROI per aggiungere le ROI all'immagine a fluorescenza. Nella finestra Analisi FemDA selezionare One-Shot per analizzare i dati del punto finale dell'immagine. Immettere N per il numero di pixel principali per utilizzare i pixel di fascia alta di ogni ROI per calcolare l'intensità media della goccia corrispondente.Quindi fare clic su Misura intensità per calcolare le intensità media di tutte le goccioline rilevate. Il ROITable viene aggiornato con i nuovi dati dell'immagine a fluorescenza e l'istogramma viene visualizzato in una nuova finestra. Esportare i dati facendo clic sul pulsante Salva come testo.La soluzione fluorescente è stata incapsulata nelle microcamera FemDA e l'intensità della fluorescenza, correlata alle dimensioni delle goccioline, è stata misurata mediante microscopia. Le goccioline hanno una distribuzione di dimensioni ridotte. L'immagine 3D ricostruita dalla microscopia confocale mostrava anche la dimensione costante delle goccioline nel tempo.Le goccioline erano stabili a temperatura ambiente senza perdita di evaporazione o contaminazione incrociata tra goccioline per almeno 24 ore. La proteina fluorescente mNeonGreen è stata sintetizzata in FemDA. E i dati dell'immagine dello stack sono stati analizzati con l'aiuto dell'immagine simultanea del campo luminoso sfocato.Poiché l'intensità di fluorescenza di ogni goccia viene misurata della sua resa proteica, l'istogramma suggerisce fortemente un numero ineguale di molecole di DNA per goccia. La probabilità di goccioline contenenti un numero diverso di molecole di DNA era perfetta per una distribuzione di Poisson. La sintesi dell'enzima fosfatasi alcalina è stata effettuata anche in FemDA con immagini catturate ogni cinque minuti.La reazione ha mostrato una distribuzione discreta simile dell'intensità di fluorescenza delle goccioline in un momento precedente e i risultati dell'istogramma hanno verificato che il numero ineguale delle molecole di DNA nelle goccioline. Una singola molecola di DNA incapsulata in singole goccioline può essere ulteriormente recuperata, amplificata e sequenziata per renderlo il più alto screening delle proteine possibile. Una tecnica a goccia con volume ridotto e elevata stabilità consente una diagnosi molecolare rapida e precisa delle malattie tumorali con biomarcatori specifici.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Surface Passivation for Single-molecule Protein Studies

Passivazione della superficie per singola molecola proteica Studi

Single-molecule fluorescence spectroscopy has proven to be instrumental in understanding a wide range of biological phenomena at the nanoscale. Important ...

Ricerca

Chimica

Steady-state, Pre-steady-state, and Single-turnover Kinetic Measurement for DNA Glycosylase Activity

Allo steady-state, Pre-steady-state, e Single-fatturato di misura cinetica per il DNA Glycosylase Activity

Human 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) excises the mutagenic oxidative DNA lesion 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG) from DNA. Kinetic characterization ...

Folding and Characterization of a Bio-responsive Robot from DNA Origami

Pieghevole e caratterizzazione di un robot bio-reattiva da origami di DNA

The DNA nanorobot is a hollow hexagonal nanometric device, designed to open in response to specific stimuli and present cargo sequestered inside. Both ...

Self-assembly of Complex Two-dimensional Shapes from Single-stranded DNA Tiles

Auto-assemblaggio di forme complesse bidimensionali da Campagna DNA a singolo filamento

Current methods in DNA nano-architecture have successfully engineered a variety of 2D and 3D structures using principles of self-assembly. In this ...

Synthesis of Cd-free InP/ZnS Quantum Dots Suitable for Biomedical Applications

Sintesi di Cd-libera InP / ZnS Quantum Dots adatto per applicazioni biomediche

Fluorescent nanocrystals, specifically quantum dots, have been a useful tool for many biomedical applications. For successful use in biological systems, ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Sintesi di proteine ​​bioconiugati<em&gt; via</em&gt; Chimica cisteina-maleimmide

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Synthesis of a Water-soluble Metal&#8211;Organic Complex Array

Sintesi di una serie complessa Metal-Organic solubile in acqua

We demonstrate a method for the synthesis of a water-soluble multimetallic peptidic array containing a predetermined sequence of metal centers such as ...

Chemo-enzymatic Synthesis of N-glycans for Array Development and HIV Antibody Profiling

Chemo-enzymatic Synthesis of N-glycans for Array Development and HIV Antibody Profiling

Chemio-enzimatico di sintesi della N- glicani matrice dello sviluppo e dell'anticorpo HIV profilatura

We present a highly efficient way for the rapid preparation of a wide range of N-linked oligosaccharides (estimated to exceed 20,000 structures) that are ...

Synthesis and Performance Characterizations of Transition Metal Single Atom Catalyst for Electrochemical CO2 Reduction

Synthesis and Performance Characterizations of Transition Metal Single Atom Catalyst for Electrochemical CO2 Reduction

Sintesi e caratterizzazione di prestazioni di catalizzatore singolo atomo del metallo di transizione per elettrochimica CO2 riduzione

This protocol presents both the synthesis method of the Ni single atom catalyst, and the electrochemical testing of its catalytic activity and selectivity ...

Stable DNA Motifs, 1D and 2D Nanostructures Constructed from Small Circular DNA Molecules

Motivi di DNA stabile, 1D e 2D nanostrutture costruito da molecole di DNA circolare piccola

This article presents a detailed protocol for synthesis of small circular DNA molecules, annealing of circular DNA motifs, and construction of 1D and 2D ...