Name: a femtoliter droplet array for massively parallel protein synthesis from single dna molecules
Uploaded: 2020-06-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Femtoliter Droplet Array for Massively Parallel Protein Synthesis from Single DNA Molecules at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pelo número de subvenção JSPS KAKENHI JP18K14260 e pelo orçamento da Agência japonesa de Ciência e Tecnologia da Terra Marinha. Agradecemos a Shigeru Deguchi (JAMSTEC) e Tetsuro Ikuta (JAMSTEC) por fornecerem as instalações de caracterização. Agradecemos a Ken Takai (JAMSTEC) pelo suporte a software comercial. A microfabização foi realizada na Supercleanroom Takeda Sentanchi, a Universidade de Tóquio, apoiada pelo "Programa plataforma de nanotecnologia" do Ministério da Educação, Cultura, Esportes, Ciência e Tecnologia (MEXT), Japão, Número de Subvenção JPMXP09F19UT0087.

1. Microfabricação do substrato de matriz de microcrobra femtoliter
NOTA: Realize o seguinte experimento de microfabização em uma sala de limpeza. Use luvas e um terno de limpeza antes de entrar na sala de limpeza.
<ol><li>Substrato de vidro de cobertura de limpeza<ol>
<li>Coloque o vidro da tampa em um rack de coloração de vidro de cobertura. Sonicar o vidro de cobertura em hidróxido de sódio de 8 M (NaOH) por 15 min a temperatura ambiente (RT). ATENÇÃO: O NaOH em altas concent...

A medição altamente quantitativa baseada nas gotículas altamente uniformes, estáveis e biocompatíveis no FemDA possibilitou a distribuição discreta, a característica única do nosso estudo diferente das outras. Otimizamos sistematicamente e detalhamos os processos de microfabização e formação de gotículas neste artigo. Existem várias etapas críticas no protocolo estabelecido.
Primeiro, o revestimento uniforme do polímero CYTOP altamente viscoso no substrato de vidro fino retang...

Pesquisadores usam reatores para realizar reações bioquím químicas. Há esforços significativos que têm sido feitos para reduzir o tamanho do reator e aumentar o rendimento experimental, a fim de diminuir o consumo de reagentes e, ao mesmo tempo, melhorar a eficiência do trabalho. Ambos os aspectos visam libertar os pesquisadores de uma carga de trabalho pesada, diminuindo o custo e acelerando a pesquisa e o desenvolvimento. Temos um roteiro histórico claro sobre o desenvolvimento das tecnologias do reator do ponto de vista dos volumes de reação e do throughput: bicos únicos/frascos/tubos de ensaio, tubos mililitros, tubos microliteres, microliter 8-tube tiras, microliter 96/384/1536-well placa, e nanoliter/picoliter/picoliter/femtoliter reatores1,,2,3,,4,5,6,7. Análogo à redução do tamanho do recurso de transistores em chips de circuito integrados na indústria de semicondutores nas últimas décadas, os microreatores bioquímicos estão passando por redução de volume e integração do sistema. Tais ferramentas de pequena escala tiveram um impacto profundo na biologia sintética baseada em células ou sem células, a biocoformação biomafatorial e a prototipagem e triagem de alta produtividade8,,9,,10,,11,12. Este artigo descreve nosso recente esforço no desenvolvimento de uma tecnologia única de gotículas e demonstra sua aplicação no CFPS13, uma tecnologia fundamental para a biologia sintética e comunidades de triagem molecular14. Em particular, fornecemos intencionalmente um protocolo otimizado e de baixo custo para tornar o dispositivo FemDA acessível a todos. O protocolo de baixo custo e fácil de lidar para o dispositivo miniaturizado contribuiria para os propósitos educacionais das universidades e ajudaria a disseminar a tecnologia.
FemDA prepara gotículas femtoliter a uma densidade ultra-alta de 106 por 1 cm2 em um substrato de vidro planar. Nós revestemos um polímero hidrofóbico, CYTOP15,no substrato de vidro e gravado seletivamente (removido) CYTOP em posições predefinidas para gerar uma matriz de microcâmara no substrato. Assim, a microcâmara resultante é composta por uma parede lateral hidrofóbica (CYTOP) e um fundo hidrofílico (vidro). Quando fluimos sequencialmente água e óleo sobre a superfície padronizada, a água pode ser presa e selada nos microchambers. A estrutura hidrofóbica-em-hidrofóbica é vital para repelir a água fora dos microchambers, isolar microreatores individuais e reter uma pequena solução aquosa dentro do espaço femtoliter. A propriedade única foi aplicada com sucesso para a preparação de gotículas de água em óleo e microcompartamentos lipídes bicamadas16,17. Em comparação com o protótipo do dispositivo16,primeiro otimizamos o processo de microfabaçação para realizar uma remoção completa do polímero CYTOP, bem como uma exposição completa do fundo de vidro. CYTOP é um fluoropolímero especial com tensão superficiais (19 mN/m) inferior à de materiais microrretores convencionais, como vidro, plásticos e silicone. Seu bom desempenho óptico, elétrico e químico já foi utilizado no tratamento superficial de dispositivos microfluidos18,19,20,,21,,22,,23,,24. No sistema FemDA, para obter uma boa moçação do óleo na superfície CYTOP, a tensão superficial do óleo deve ser menor do que a da superfície sólida25. Caso contrário, o óleo líquido em contato com a superfície sólida tende a se tornar esférico em vez de se espalhar sobre a superfície. Além disso, descobrimos que alguns óleos populares de perfluorocarbono (por exemplo, 3M FC-40)16 e óleos de hidrofluoroether (por exemplo, série 3M Novec) podem dissolver CYTOP como resultado da morfologia amorfa do CYTOP, que é fatal para medição quantitativa e seria questionável em termos de contaminação cruzada entre gotículas. Felizmente, identificamos um óleo biocompatível e ecologicamente correto que exibe tensão superficial mais baixa (< 19 mN/m)13. Também encontramos um novo surfactante que pode dissolver-se no óleo selecionado e funcionar em baixa concentração (0,1%, pelo menos 10 vezes menor do que os populares relatados anteriormente26,27)13. A interface água/óleo resultante pode ser estabilizada pelo surfactante. Devido à alta taxa de evaporação do óleo, após a descarga com o óleo, aplicamos outro óleo biocompatível e ambientalmente amigável para substituir o primeiro a selar os microchambers. Chamamos o primeiro óleo (ASAHIKLIN AE-3000 com 0,1 wt % SURFLON S-386) o "óleo de descarga" e o segundo óleo (Fomblin Y25) o "óleo de vedação", respectivamente.
A estratégia de vedação de óleo em duas etapas pode realizar uma formação robusta da matriz de gotículas femtoliter em minutos e sem instrumentação sofisticada. Devido ao problema de evaporação, tem sido considerado desafiador gerar microreatores menores do que os volumes picoliter28. A FemDA abordou essa questão otimizando sistematicamente os materiais e processos utilizados para a elaboração de microreatores/gotículas. Várias características notáveis das gotículas resultantes incluem a alta uniformidade (ou monodispersidade), estabilidade e biocompatibilidade na escala femtoliter. O coeficiente de variação (CV) do volume de gotículas é de apenas 3% (sem correção de vinheta para as imagens microscópicas), o menor CV entre as plataformas de gotículas do mundo, o que garante uma medição altamente paralela e quantitativa. A gotícula femtoliter é estável por pelo menos 24 horas sem contaminação cruzada entre gotículas à temperatura ambiente, o que é valioso para uma medição confiável do curso de tempo. Em relação à biocompatibilidade, conseguimos sintetizar várias proteínas a partir de um DNA modelo de cópia única na gotícula femtoliter, que anteriormente havia sido considerada difícil ou ineficiente29,30. Seria digno de elucidar por que algumas proteínas capazes de ser sintetizadas no FemDA não podem ser sintetizadas em outros sistemas de gotículas. FemDA não foi meramente um avanço técnico, mas também realizou uma medição quantitativa sem precedentes que pode correlacionar o rendimento da proteína (como refletido pela intensidade da fluorescência da gotícula) ao número de moléculas de DNA modelo em cada gotícula. Como resultado, o histograma da intensidade de fluorescência de gotículas do CFPS baseado em FemDA mostrou uma distribuição discreta que pode ser bem encaixada por uma soma de distribuições gaussianas de intervalos de pico a pico iguais. Além disso, a probabilidade de ocorrência de gotículas contendo diferentes números de moléculas de DNA foi perfeita para uma distribuição de Poisson31. Assim, o rendimento diferente de proteínas em cada gotícula pode ser normalizado com base na distribuição discreta. Este recurso crítico nos permite separar as informações de atividade enzimática da intensidade aparente, que ainda não está disponível com outras plataformas de microreatores. Os sistemas de classificação de células/gotículas microfluidas existentes são habilitados em classificação totalmente automática e bons em concentrar amostras, mas às vezes só podem produzir um histograma relativamente amplo ou de cauda longa no aspecto analítico32,33. Nosso sistema FemDA altamente quantitativo e biocompatível estabelece um novo benchmark e um alto padrão analítico no campo do desenvolvimento de microreatores.
Os óleos e surfactantes que poderiam ser usados para a preparação de gotículas ainda são muito limitados34. A combinação de ASAHIKLIN AE-3000 e SURFLON S-386 estabelecida na FemDA é um novo membro do crescente arsenal da interface fisioquímica entre a fase aquosa e a fase13do óleo . A nova interface em FemDA é fisicamente estável, quimicamente inerte e biologicamente compatível com a transcrição complexa, tradução e máquinas de modificação pós-translacional para muitos tipos de proteínas13. Seria bastante atraente encontrar uma proteína que não pode ser sintetizada nas configurações de gotícula. Além disso, a economia de custos dos reagentes é mais evidente no sistema de gotícula femtoliter do que no sistema de reator nanoliter e picoliter35,36. Em particular, muitas vezes haveria um grande volume morto, que é causado principalmente por tubos ou suprimentos externos, em sistemas microfluídicos de geração de droplet, mas não em nosso FemDA. O formato de matriz também é favorecido pela caracterização microscópica repetida e detalhada (semelhante à chamada análise de alto conteúdo) para cada reator37, em vez de apenas um único instantâneo para um objeto em movimento rápido. A escala femtoliter permitiu a integração de mais de um milhão de reatores em uma área do tamanho de um dedo, enquanto o mesmo número de reatores nanoliteres (se existir) requer sobre a área do metro quadrado, o que seria sem dúvida impraticável para fabricar ou usar tal sistema.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>(3-aminopropyl)triethoxysilane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>440140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS-01T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-propanol</td>
			<td>Kanto Chemical</td>
			<td>EL grade</td>
			<td>EL: for electronic use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D laser scanning confocal microscope</td>
			<td>Lasertec</td>
			<td>OPTELICS HYBRID</td>
			<td>Other similar microscopes (e.g., Keyence VK-X1000, Olympus LEXT OLS5000) are also applicable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL syringe</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS-50LZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6,8-difluoro-4-methylumbelliferyl phosphate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D6567</td>
			<td>Prepare a 5 mM stock solution in dimethyl sulfoxide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Kanto Chemical</td>
			<td>EL grade</td>
			<td>EL: for electronic use. 
			Purity 99.8%.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air blower</td>
			<td>Hozan</td>
			<td>Z-263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum block</td>
			<td>BIO-BIK</td>
			<td>AB-24M-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum microtube stand</td>
			<td>BIO-BIK</td>
			<td>AB-136C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ASAHIKLIN AE-3000</td>
			<td>AGC</td>
			<td>(Test sample)</td>
			<td>Free test sample may be available upon inquiry to AGC.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BEMCOT PS-2 wiper</td>
			<td>Ozu</td>
			<td>028208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch with plunger</td>
			<td>Kai</td>
			<td>BPP-10F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Matsunami Glass</td>
			<td>No. 1 (24 mm &#215; 32 mm, 0.13~0.17 mm thickness)</td>
			<td>Size-customized.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass staining rack</td>
			<td>Nakayama</td>
			<td>803-131-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CRECIA TechnoWipe clean wiper</td>
			<td>Nippon Paper Crecia</td>
			<td>C100-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cutting mat</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>WB100020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CYTOP</td>
			<td>AGC</td>
			<td>CTL-816AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deaeration mixer</td>
			<td>Thinky</td>
			<td>AR-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desktop cutter</td>
			<td>Roland</td>
			<td>STIKA SV-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Developer</td>
			<td>AZ Electronic Materials</td>
			<td>AZ 300 MIF</td>
			<td>AZ Electronic Materials was now acquired by Merck. 
			Other alkaline developers may be also applicable but should require optimization of development conditions (time, temperature, etc.)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-coated adhesive Kapton film tape</td>
			<td>Teraoka Seisakusho</td>
			<td>7602 #25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Kanto Chemical</td>
			<td>EL grade</td>
			<td>EL: for electronic use. 
			Purity 99.5%.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Version: ImageJ 1.51n</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-cable cutter</td>
			<td>Tokyo-IDEAL</td>
			<td>MT-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fomblin oil</td>
			<td>Solvay</td>
			<td>Y25, or Y25/6</td>
			<td>Free test sample may be available upon inquiry to Solvay. Fomblin Y25/6 is an alternative if Y25 is not readily available.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>TH-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>NN-2270C</td>
			<td>22G &#215; 70 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted fluorescence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ti-E</td>
			<td>Epifluorescence specification, CCD or sCMOS camera, motorized stage, autofocus system, and high NA objective lens are required.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KaleidaGraph</td>
			<td>Synergy</td>
			<td></td>
			<td>Version: 4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mask aligner</td>
			<td>SUSS</td>
			<td>MA-6</td>
			<td>Other mask aligners are also applicable as long as the vacuum contact mode is avaliable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICROMAN pipette</td>
			<td>GILSON</td>
			<td>E M250E</td>
			<td>Capillary piston tip: CP250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Version: 16.16.15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini vacuum chamber</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>MVP-100MV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>NIPPON GENE</td>
			<td>316-90101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Amcor</td>
			<td>PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tube</td>
			<td>NIPPON Genetics</td>
			<td>FG-021D/SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>GD90-15</td>
			<td>Diameter 90 mm, height 15 mm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoresist</td>
			<td>AZ Electronic Materials</td>
			<td>AZ P4903</td>
			<td>AZ Electronic Materials was now acquired by Merck. AZ P4620 is an alternative.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>POWERSCAN HT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethelene gloves</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>6-896-02</td>
			<td>Trade name: Saniment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PURExpress in vitro protein synthesis kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E6800S or E6800L</td>
			<td>For cell-free protein synthesis reaction.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reactive-ion etching system</td>
			<td>Samco</td>
			<td>RIE-10NR</td>
			<td>Other RIE systems are also applicable but should require optimization of RIE conditions (gas flow rate, chamber pressure, RF power, etching time, etc.)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase inhibitor</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0314S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scotch tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>810-1-18D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide solution</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td>
			<td>194-09575</td>
			<td>8 M concentration; danger.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater</td>
			<td>Oshigane</td>
			<td>SC-308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SURFLON S-386 surfactant</td>
			<td>AGC</td>
			<td>(Test sample)</td>
			<td>Free test sample may be available upon inquiry to AGC.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184 silicone elastomer</td>
			<td>Dow</td>
			<td>Sylgard184</td>
			<td>Chemical composition: polydimethylsiloxane. The default mixing ratio is base : curing agent = 10 : 1 (m/m).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Ideal-tek</td>
			<td>2WF.SA.1 
			2A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaner</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>ASU-2M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum chuck</td>
			<td>Oshigane</td>
			<td>(Customized)</td>
			<td>Material: delrin; rectangular sample stage with multiple holes (48 holes, each with 1 mm diameter); the size is customzied to fit the size of the cover glass (24 mm &#215; 32 mm).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a femtoliter droplet array for massively parallel protein synthesis from single dna molecules

Os avanços na resolução espacial e na sensibilidade de detecção da instrumentação científica possibilitam a aplicação de pequenos reatores para pesquisas biológicas e químicas. Para atender à demanda por microreatores de alto desempenho, desenvolvemos um dispositivo Femtoliter droplet array (FemDA) e exemplificamos sua aplicação em reações de síntese proteica livre de células massivamente paralelas (CFPS). Mais de um milhão de gotículas uniformes foram prontamente geradas dentro de uma área do tamanho de um dedo usando um protocolo de vedação de óleo de duas etapas. Cada gotícula estava ancorada em uma microcâmara femtoliter composta por um fundo hidrofílico e uma parede lateral hidrofóbica. A estrutura hidrofóbica híbrida e os óleos de vedação dedicados e surfactantes são cruciais para manter a solução aquosa femtoliter no espaço femtoliter sem perda de evaporação. A configuração femtoliter e a estrutura simples do dispositivo FemDA permitiram o consumo mínimo de reagentes. A dimensão uniforme dos reatores de gotículas tornou as medições quantitativas e de curso de tempo em larga escala convincentes e confiáveis. A tecnologia FemDA correlacionou o rendimento proteico da reação do CFPS com o número de moléculas de DNA em cada gotícula. Agilizamos os procedimentos sobre a microfabização do dispositivo, a formação das gotículas femtoliter e a aquisição e análise dos dados de imagem microscópica. O protocolo detalhado com o baixo custo otimizado de execução torna a tecnologia FemDA acessível a todos que possuem instalações padrão de limpeza e um microscópio de fluorescência convencional em seu próprio lugar.

O processo de microfabricação consiste em limpeza de substratos, funcionalização de superfície, revestimento CYTOP, fotolitografia, gravura a seco, despojo fotoresist e limpeza final. É importante ressaltar que o protocolo apresentado permitiu a remoção completa do polímero CYTOP hidrofóbico dentro dos microchambers Figura 3A, produzindo uma estrutura hidrofóbica-hidrofóbica altamente paralela em um substrato de vidro de cobertura padrão. Com o auxílio do protocolo de vedação...

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A Femtoliter Droplet Array for Massively Parallel Protein Synthesis from Single DNA Molecules

O objetivo geral do protocolo é preparar mais de um milhão de gotículas femtoliter ordenadas, uniformes, estáveis e biocompatíveis em um substrato planar de 1 cm2 que pode ser usado para síntese proteica sem células.

Uma matriz de gotícula femtoliter para síntese de proteínas massivamente paralelas de moléculas de DNA único

Advances in spatial resolution and detection sensitivity of scientific instrumentation make it possible to apply small reactors for biological and ...

Mais de um milhão de uniformes das gotículas são produzidos no substrato do tamanho do dedo. E moléculas de DNA simples são distribuídas aleatoriamente em cada gota. O rendimento da proteína é proporcional ao número de moléculas em uma gotícula.Nossa técnica pode ser usada para uma medição rápida e quantitativa da atividade enzimática sem expressão e purificação de proteínas complicadas. Para começar, coloque um copo de tampa em um rack de coloração e coloque o rack em oito hidróxido de sódio molar. Sonicar o vidro de cobertura e o rack de coloração por 15 minutos em temperatura ambiente.Remova o rack de coloração do hidróxido de sódio e enxágue o vidro da tampa com água 10 vezes. Seque o vidro da tampa com uma arma de ar. Em seguida, asse e seque o copo de cobertura em uma placa quente a 200 graus Celsius por cinco minutos.Prepare solução de 0,05% aminosilano. Mergulhe o vidro de cobertura nesta solução e incuba-o por uma hora em temperatura ambiente. Enxágüe o vidro da tampa cinco vezes em água pura.Em seguida, seque o vidro da tampa usando uma arma de ar. Asse na placa quente a 80 graus Celsius por cinco minutos. Coloque o substrato de vidro de cobertura em um mandril de vácuo personalizado para o revestimento de spin.Dispense de 70 a 90 microliters de polímero CYTOP tipo A no centro do substrato de vidro. Em seguida, imediatamente gire o polímero. O revestimento inicial do polímero danifica a qualidade da matriz de microcâmara final.Distribua o polímero no centro do vidro de cobertura sem introduzir bolhas de ar. Pegue o vidro revestido segurando-o nas esquinas e coloque-o em uma folha de alumínio. Asse por 30 minutos a 80 graus Celsius e depois por mais uma hora a 200 graus Celsius.Dispense 0,2 a 0,3 mililitros de fotoresist no centro do substrato. Imediatamente gire o fotoresist a 6.000 rpm por 60 segundos. Use uma limpeza encharcada de etanol para remover o excesso de fotoresistia das bordas do substrato.Asse o substrato a 110 graus Celsius por cinco minutos. Para reidratar o fotoresist, deixe o substrato ficar por 30 minutos a uma umidade relativa de 42 a 60% Carregue o substrato no alinhador da máscara e exponha-o por 25 segundos em um modo de contato a vácuo. Em seguida, mergulhe o substrato no desenvolvedor por cinco minutos para dissolver o fotoresist exposto.Enxágüe o substrato 10 vezes usando água pura. Em seguida, seque o substrato completamente usando a pistola de ar. Coloque o substrato na câmara de reação da máquina de gravura de íons reativos e etch o fotoresist coberto CYTOP com o plasma de oxigênio.Após a gravação, remova o fotoresist restante sonicando o substrato em acetona por cinco minutos à temperatura ambiente. Em seguida, sonicar o substrato em propanol por cinco minutos. Enxágüe, sonicato e enxágue o substrato novamente usando água pura como descrito no manuscrito.Em seguida, seque o substrato com uma arma de ar. Usando um cortador de desktop, corte fita de filme Kapton de revestimento duplo nas formas de microcanal definidas. Coloque os pedaços de fita cortadas no fundo de uma placa de Petri plana para servir como mestre para a moldagem do PDMS.Despeje a mistura PDMS na placa petri com padrão de fita. Em seguida, coloque a placa de Petri em uma mini câmara de vácuo e desaerar a mistura PDMS por uma a três horas. Em seguida, coloque a placa de Petri em um forno a 60 graus Celsius e deixe-a durante a noite para curar o PDMS.Depois que o PDMS tiver curado, descasque o elastômero curado da placa de Petri e use um cortador de cabo plano para cortar os blocos microcanais PDMS. Em seguida, faça um buraco em cada extremidade de cada microcanal. O substrato previamente preparado terá uma área para a matriz de microcâmaras.Posicione o microcanal PDMS nesta parte do substrato. Em seguida, insira uma ponta de tubulação de 200 microliter em um dos orifícios do microcanal PDMS. Primeiro, prepare a solução de reação CFPS em um tubo PCR.Em seguida, usando uma ponta de tubulação não filtrante de 200 microliteres, elasve 10 microliters da solução. Insira a ponta da tubulação no orifício de entrada do microcanal PDMS e empurre para baixo no êmbolo da tubulação até que a solução transborde da saída do microcanal. Transfira o dispositivo FemDA para um bloco de alumínio pré-refrigerado.Confirme se a área de matriz de microcâmara passa rapidamente de translúcida para transparente. Desenhe 300 microliters de óleo de descarga pré-refrigerado e transfira imediatamente o óleo para a ponta tubulata do orifício de entrada do microcanal. O óleo de descarga se move para o microcanal e extrude a solução de reação em excesso localizada fora dos microchambers.Remova simultaneamente as duas pontas de tubulação inseridas do dispositivo. Mova imediatamente o dispositivo do bloco de alumínio para o filme de parafina. Insira a ponta de tubulação preparada contendo o óleo de vedação na entrada do microcanal PDMS e injete o óleo até que ele transborde da tomada.As gotículas femtoliter são seladas em microchambers individuais pelo óleo. Abra a imagem BF desfocada. Para remover fundos contínuos suaves de cada quadro, selecione Subtrair o fundo do menu Process.Digite 20 para o raio da bola rolando. Verifique a caixa De visualização e selecione Ok. Selecione Sim quando perguntado se deve processar todas as imagens.Em seguida, para reduzir o ruído, selecione Processo, Filtros, Mediana. Digite 2.0 para o raio em pixels. Verifique a caixa De visualização e selecione Ok.Selecione Sim quando perguntado se deve processar todas as imagens. Em seguida, selecione Imagem, Ajuste, Limiar para separar as imagens dos microchambers do fundo da imagem. No menu Plugins, selecione FemDA, Análise FemDA.Insira o número mínimo e máximo aproximado de pixels de uma única microcâmara. A circularidade mínima e máxima esperada dos microchambers e os números do quadro de início e final, em seguida, selecione Gerar ROI para detectar os microchambers. Os ROIs detectados com sucesso são mostrados no ROITable do menu pop-up.Na janela Análise FemDA, selecione Aplicar máscara de ROI. Examine a imagem para ver se os microchambers foram detectados corretamente. Abra a imagem da fluorescência e traga-a para a frente.Clique em Aplicar a máscara ROI novamente para adicionar os ROIs à imagem de fluorescência. Na janela Análise FemDA, selecione One-Shot para analisar dados de ponto final da imagem. Digite N para o número de pixels superiores usar os pixels topo de linha de cada ROI para calcular a intensidade média da gotícula correspondente.Em seguida, clique em Medir a intensidade para calcular as intensidades médias de todas as gotículas detectadas. O ROITable é atualizado com os novos dados da imagem da fluorescência e o histograma é exibido em uma nova janela. Exporte os dados clicando no botão Salvar como texto.A solução fluorescente foi encapsulada em microchambers FemDA e a intensidade da fluorescência, que está correlacionada com o tamanho da gotícula, foi medida por meio de microscopia. Verificou-se que as gotículas tinham uma distribuição de tamanho estreito. A imagem 3D reconstruída da microscopia confocal também mostrou o tamanho consistente da gotícula ao longo do tempo.As gotículas foram estáveis à temperatura ambiente sem perda de evaporação ou contaminação cruzada entre gotículas por pelo menos 24 horas. A proteína fluorescente mNeonGreen foi sintetizada em FemDA. E os dados da imagem da pilha foram analisados com o auxílio da imagem de campo brilhante desfocado concomitante.Como a intensidade de fluorescência de cada gotícula é medida de seu rendimento proteico, o histograma sugere fortemente números desiguais de moléculas de DNA por gotícula. A probabilidade de gotículas contendo diferentes números de moléculas de DNA foi perfeita para uma distribuição de Poisson. A síntese da enzima fosfattase alcalina também foi realizada em FemDA com imagens capturadas a cada cinco minutos.A reação mostrou uma distribuição discreta semelhante da intensidade de fluorescência das gotículas em momentos anteriores e os resultados do histograma verificaram que os números desiguais das moléculas de DNA nas gotículas. Uma única molécula de DNA encapsulada em gotículas individuais pode ser ainda mais recuperada, amplificada e sequenciada, torná-la a maior triagem de proteínas possível. Uma técnica de gotícula com volume pequeno e alta estabilidade permite um diagnóstico molecular rápido e preciso de doenças cancerígenas com biomarcadores específicos.

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Síntese de Cd-livre InP / ZnS Quantum Dots Indicado para aplicações biomédicas

Fluorescent nanocrystals, specifically quantum dots, have been a useful tool for many biomedical applications. For successful use in biological systems, ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Síntese de Bioconjugados de proteínas<em&gt; via</em&gt; Química cisteína-maleimida

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Synthesis of a Water-soluble Metal&#8211;Organic Complex Array

Síntese de uma matriz de complexo de metal-orgânicos solúveis em água

We demonstrate a method for the synthesis of a water-soluble multimetallic peptidic array containing a predetermined sequence of metal centers such as ...

Chemo-enzymatic Synthesis of N-glycans for Array Development and HIV Antibody Profiling

Chemo-enzymatic Synthesis of N-glycans for Array Development and HIV Antibody Profiling

Quimio-enzimático síntese de N- os glicanos para desenvolvimento de matriz e anticorpos de HIV de criação de perfil

We present a highly efficient way for the rapid preparation of a wide range of N-linked oligosaccharides (estimated to exceed 20,000 structures) that are ...

Synthesis and Performance Characterizations of Transition Metal Single Atom Catalyst for Electrochemical CO2 Reduction

Synthesis and Performance Characterizations of Transition Metal Single Atom Catalyst for Electrochemical CO2 Reduction

Síntese e caracterizações de desempenho de catalisador de átomo de Metal de transição para redução de eletroquímica CO2

This protocol presents both the synthesis method of the Ni single atom catalyst, and the electrochemical testing of its catalytic activity and selectivity ...

Stable DNA Motifs, 1D and 2D Nanostructures Constructed from Small Circular DNA Molecules

Motivos de DNA estável, 1D e 2D nanoestruturas construídas a partir de moléculas de DNA Circular pequeno

This article presents a detailed protocol for synthesis of small circular DNA molecules, annealing of circular DNA motifs, and construction of 1D and 2D ...