Name: conventional bodipy conjugates for live-cell super-resolution microscopy and single-molecule tracking
Uploaded: 2020-06-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Conventional BODIPY Conjugates for Live-Cell Super-Resolution Microscopy and Single-Molecule Tracking at JoVE.com

Die in dieser Publikation berichtete Forschung wurde vom National Institute of General Medical Sciences der National Institutes of Health unter der Vergabenummer R21GM127965 unterstützt.

HINWEIS: Zum Hefeklonen und endogenen Tagging lesen Sie bitte unsere aktuelle Publikation10.
1. Herstellung von Hefezellproben zur Bildgebung
<ol><li>Bereiten Sie eine flüssige Nachtkultur eines w303 Hefestamms vor. Mit einem sterilen Holzstab, erkennen Sie eine kleine Menge von Hefezellen aus einer Agarplatte, die Hefeextrakt-Pepton-Dextrose in einem Kulturrohr mit 2 ml synthetischem Komplett-Dextrose-Medium (SCD) enthält. Inkubieren Sie die Röhre über Nacht in e...

<ol>
	<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature Methods. 3 (10), 793-796 (2006).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Manley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-density+mapping+of+single-molecule+trajectories+with+photoactivated+localization+microscopy.">High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy.</a> Nature Methods. 5 (2), 155-157 (2008).</li><li>Wu, C. -. Y., Roybal, K. T., Puchner, E. M., Onuffer, J., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+control+of+therapeutic+T+cells+through+a+small+molecule-gated+chimeric+receptor.">Remote control of therapeutic T cells through a small molecule-gated chimeric receptor.</a> Science. 350 (6258), 4077 (2015).</li><li>Heilemann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subdiffraction-resolution+fluorescence+imaging+with+conventional+fluorescent+probes.">Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes.</a> Angewandte Chemie. 47 (33), 6172-6176 (2008).</li><li>Cordes, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+single-molecule+assembled+patterns+with+superresolution+blink-microscopy.">Resolving single-molecule assembled patterns with superresolution blink-microscopy.</a> Nano Letters. 10 (2), 645-651 (2010).</li><li>Smith, E. M., Gautier, A., Puchner, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Localization+Microscopy+with+the+Fluorescence-Activating+and+Absorption-Shifting+Tag+(FAST)+System.">Single-Molecule Localization Microscopy with the Fluorescence-Activating and Absorption-Shifting Tag (FAST) System.</a> ACS chemical biology. 14 (6), 1115-1120 (2019).</li><li>Yan, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+microscopy+using+noncovalent+fluorogen+activation+by+genetically+encoded+fluorogen-activating+proteins.">Localization microscopy using noncovalent fluorogen activation by genetically encoded fluorogen-activating proteins.</a> Chemphyschem: A: European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 15 (4), 687-695 (2014).</li><li>Jungmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+super-resolution+imaging+with+qPAINT.">Quantitative super-resolution imaging with qPAINT.</a> Nature Methods. 13 (5), 439-442 (2016).</li><li>Adhikari, S., Moscatelli, J., Smith, E. M., Banerjee, C., Puchner, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+localization+microscopy+and+tracking+with+red-shifted+states+of+conventional+BODIPY+conjugates+in+living+cells.">Single-molecule localization microscopy and tracking with red-shifted states of conventional BODIPY conjugates in living cells.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).</li><li>Bergstr&#246;m, F., Mikhalyov, I., H&#228;ggl&#246;f, P., Wortmann, R., Ny, T., Johansson, L. B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimers+of+dipyrrometheneboron+difluoride+(BODIPY)+with+light+spectroscopic+applications+in+chemistry+and+biology.">Dimers of dipyrrometheneboron difluoride (BODIPY) with light spectroscopic applications in chemistry and biology.</a> Journal of the American Chemical Society. 124 (2), 196-204 (2002).</li><li>Br&#246;ring, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bis(BF2)-2,2'-bidipyrrins+(BisBODIPYs):+highly+fluorescent+BODIPY+dimers+with+large+stokes+shifts.">Bis(BF2)-2,2'-bidipyrrins (BisBODIPYs): highly fluorescent BODIPY dimers with large stokes shifts.</a> Chemistry (Weinheim an Der Bergstrasse, Germany). 14 (10), 2976-2983 (2008).</li><li>Mikhalyov, I., Gretskaya, N., Bergstr&#246;m, F., Johansson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electronic+ground+and+excited+state+properties+of+dipyrrometheneboron+difluoride+(BODIPY):+Dimers+with+application+to+biosciences.">Electronic ground and excited state properties of dipyrrometheneboron difluoride (BODIPY): Dimers with application to biosciences.</a> Physical Chemistry Chemical Physics. 4 (22), 5663-5670 (2002).</li><li>Pagano, R. E., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+BODIPY-labeled+sphingolipids+to+study+membrane+traffic+along+the+endocytic+pathway.">Use of BODIPY-labeled sphingolipids to study membrane traffic along the endocytic pathway.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 845, 152-160 (1998).</li><li>Bergstr&#246;m, F., H&#228;ggl&#246;f, P., Karolin, J., Ny, T., Johansson, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+site-directed+fluorophore+labeling+and+donor-donor+energy+migration+to+investigate+solution+structure+and+dynamics+in+proteins.">The use of site-directed fluorophore labeling and donor-donor energy migration to investigate solution structure and dynamics in proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (22), 12477-12481 (1999).</li><li>Kowada, T., Maeda, H., Kikuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BODIPY-based+probes+for+the+fluorescence+imaging+of+biomolecules+in+living+cells.">BODIPY-based probes for the fluorescence imaging of biomolecules in living cells.</a> Chemical Society Reviews. 44 (14), 4953-4972 (2015).</li><li>Rocha, J. M., Gahlmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Tracking+Microscopy+-+A+Tool+for+Determining+the+Diffusive+States+of+Cytosolic+Molecules.">Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (151), (2019).</li><li>Sage, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+fight+club:+assessment+of+2D+and+3D+single-molecule+localization+microscopy+software.">Super-resolution fight club: assessment of 2D and 3D single-molecule localization microscopy software.</a> Nature Methods. 16 (5), 387-395 (2019).</li><li>Ovesn&#253;, M., K&#345;&#237;&#382;ek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ThunderSTORM:+a+comprehensive+ImageJ+plug-in+for+PALM+and+STORM+data+analysis+and+super-resolution+imaging.">ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging.</a> Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).</li><li>Puchner, E. M., Walter, J. M., Kasper, R., Huang, B., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counting+molecules+in+single+organelles+with+superresolution+microscopy+allows+tracking+of+the+endosome+maturation+trajectory.">Counting molecules in single organelles with superresolution microscopy allows tracking of the endosome maturation trajectory.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 16015-16020 (2013).</li><li>Shim, S. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+fluorescence+imaging+of+organelles+in+live+cells+with+photoswitchable+membrane+probes.">Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (35), 13978-13983 (2012).</li><li>Hansen, A. S., Woringer, M., Grimm, J. B., Lavis, L. D., Tjian, R., Darzacq, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+model-based+analysis+of+single-particle+tracking+experiments+with+Spot-On.">Robust model-based analysis of single-particle tracking experiments with Spot-On.</a> eLife. 7, (2018).</li><li>Bittel, A. M., Saldivar, I. S., Dolman, N. J., Nan, X., Gibbs, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superresolution+microscopy+with+novel+BODIPY-based+fluorophores.">Superresolution microscopy with novel BODIPY-based fluorophores.</a> PLoS ONE. 13 (10), (2018).</li><li>Wijesooriya, C. S., Peterson, J. A., Shrestha, P., Gehrmann, E. J., Winter, A. H., Smith, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Photoactivatable+BODIPY+Probe+for+Localization-Based+Super-Resolution+Cellular+Imaging.">A Photoactivatable BODIPY Probe for Localization-Based Super-Resolution Cellular Imaging.</a> Angewandte Chemie (International Ed. in English). 57 (39), 12685-12689 (2018).</li><li>Laissue, P. P., Alghamdi, R. A., Tomancak, P., Reynaud, E. G., Shroff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+phototoxicity+in+live+fluorescence+imaging.">Assessing phototoxicity in live fluorescence imaging.</a> Nature Methods. 14 (7), (2017).</li><li>W&#228;ldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., van de Linde, S., Sauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+cell+damage+in+live-cell+super-resolution+microscopy.">Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 15348 (2015).</li><li>Grimm, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+method+to+fine-tune+fluorophores+for+live-cell+and+in+vivo+imaging.">A general method to fine-tune fluorophores for live-cell and in vivo imaging.</a> Nature methods. 14 (10), 987-994 (2017).</li></ol>

In diesem Protokoll haben wir gezeigt, wie herkömmliche BODIPY-Konjugate verwendet werden können, um SMLM-Bilder mit einer Größenordnungsverbesserung in der räumlichen Auflösung zu erhalten. Diese Methode basiert auf der Ausnutzung zuvorII gemeldeter, rot verschieber D-II-Zustände herkömmlicher BODIPY-Farbstoffe, die sich vorübergehend durch bimolekulare Begegnungen bilden. Diese Zustände können speziell angeregt und mit rot verschobenen Wellenlängen erkannt werden und sind spärlich und kurzlebig ...

Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie (SMLM) Techniken wie stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie (STORM) und photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie (PALM) haben sich als Methoden zur Erzeugung von hochauflösenden Bildern mit Informationen jenseits der optischen Beugungsgrenze1,2 und zur Verfolgung der Dynamik einzelner Biomoleküle3,4herauskristallisiert. Eine der Anforderungen für Sonden, die mit SMLM kompatibel sind, ist die Fähigkeit, die Anzahl der aktiven Fluorophore jederzeit zu kontrollieren, um räumliche Überschneidungen ihrer Punktstreufunktionen (PSF) zu vermeiden. In jedem der Tausenden von Datenerfassungsrahmen wird dann die Position der einzelnen fluoreszierenden Fluorophore mit einer Genauigkeit von 20 nm bestimmt, indem die entsprechende Punktstreufunktion angebracht wird. Traditionell wurde das On-Off-Blinken von Fluorophoren durch stochastisches Photoswitching1,2,5 oder chemisch induziertes intrinsisches Blinken6gesteuert. Weitere Ansätze sind die induzierte Aktivierung von Fluorogenen bei vorübergehender Bindung an ein fluorogen-aktivierendes Protein7,8 und die programmierbare bindungsfreie Bindung von markierten DNA-Oligomeren in der gesamten inneren Reflexionsfluoreszenz (TIRF) oder Lichtblattanregung9. Kürzlich berichteten wir über eine neuartige und vielseitige Etikettierungsstrategie für SMLM10, in der zuvor gemeldete rot verschiebte Dimer (DII) Zustände herkömmlicher Bor-Di-Pyromethan (BODIPY)-Konjugate11,12,13 vorübergehend bilden und speziell angeregt und mit rot verschobenen Wellenlängen erkannt werden.
BODIPYs sind weit verbreitete Farbstoffe mit Hunderten von Varianten, die speziell subzelluläre Kompartimente und Biomoleküle14,15,16kennzeichnen. Aufgrund ihrer Benutzerfreundlichkeit und Anwendbarkeit in lebenden Zellen sind BODIPY-Varianten für die konventionelle Fluoreszenzmikroskopie im Handel erhältlich. Hier beschreiben wir ein detailliertes und optimiertes Protokoll, wie die Hunderte von kommerziell erhältlichen BODIPY-Konjugaten für Live-Cell-SMLM verwendet werden können. Durch die Optimierung der Konzentration von BODIPY-Monomeren und die Optimierung der Anregungslaserkräfte, Bildgebungs- und Datenanalyseparameter werden hochwertige hochauflösende Bilder und Einzelmolekül-Tracking-Daten in lebenden Zellen gewonnen. Bei geringer Konzentration (25-100 nM) können BODIPY-Konjugate gleichzeitig für SMLM im rot verschiebten Kanal und für die korrelative konventionelle Fluoreszenzmikroskopie im konventionellen Emissionskanal eingesetzt werden. Die erhaltenen Einzelmoleküldaten können analysiert werden, um die räumliche Organisation unbeweglicher Strukturen zu quantifizieren und die diffusiven Zustände von Molekülen in lebenden Zellen zu extrahieren17. Die Verfügbarkeit von BODIPY-Sonden in grüner und roter Form ermöglicht eine mehrfarbige Bildgebung, wenn sie in der richtigen Kombination mit anderen kompatiblen Fluorophoren verwendet wird.
In diesem Bericht bieten wir ein optimiertes Protokoll zum Erfassen und Analysieren von Live-Zell-SMLM-Daten mit BODIPY-C12, BODIPY (493/503), BODIPY-C12 rot und Lysotracker-Grün in mehreren Farben. Wir lösen Fettsäuren und neutrale Lipide in lebenden Hefe- und Säugetierzellen mit einer Auflösung von 30 nm. Wir zeigen weiter, dass Hefezellen die räumliche Verteilung von extern zugesetzten Fettsäuren in Abhängigkeit von ihrem Stoffwechselzustand regulieren. Wir stellen fest, dass zugesetzte BODIPY-Fettsäuren (FA) das endoplasmatische Retikulum (ER) und Lipidtröpfchen (LDs) unter gefütterten Bedingungen lokalisieren, während BODIPY-FAs beim Fasten nicht-LD-Cluster in der Plasmamembran bilden. Wir erweitern die Anwendung dieser Technik auf Bildlysosomen und LDs in lebenden Säugetierzellen. Unser optimiertes Protokoll für SMLM mit herkömmlichen BODIPY-Konjugaten kann eine nützliche Ressource sein, um biologische Prozesse im Nanomaßstab mit den unzähligen verfügbaren BODIPY-Konjugaten zu untersuchen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1009px;" width="1008">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">BODIPY C12</td>
			<td style="width:196px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:173px;">D3822</td>
			<td style="width:265px;">Green fatty acid analog</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">BODIPY C12 Red</td>
			<td style="width:196px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:173px;">D3835</td>
			<td>Red fatty acid analog</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">BODIPY(493/503)</td>
			<td style="width:196px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:173px;">D3922</td>
			<td>Neutral lipid marker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Concanavalin A</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:173px;">C2010</td>
			<td>Cell immobilization on glass surface</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Drop-out Mix Complete w/o nitrogen base</td>
			<td style="width:196px;">US Biological</td>
			<td style="width:173px;">D9515</td>
			<td>Amino acids for SCD</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Dextrose</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:173px;">G7021</td>
			<td>Carbon source for SCD</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Eight Well</td>
			<td style="width:196px;">Cellvis</td>
			<td style="width:173px;">C8-1.58-N</td>
			<td>Chambered Coverglasses</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Eight Well, Lb-Tek II</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td>Chambered Coverglasses</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">ET525/50</td>
			<td style="width:196px;">Chroma</td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td>Bandpass filter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">ET595/50</td>
			<td style="width:196px;">Chroma</td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td>Bandpass filter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">ET610/75</td>
			<td style="width:196px;">Chroma</td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td>Bandpass filter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:196px;">Gibco</td>
			<td style="width:173px;">26140079</td>
			<td>Serum</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">FF652</td>
			<td style="width:196px;">Semrock</td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td>Beam splitter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">FF731/137</td>
			<td style="width:196px;">Semrock</td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td>Bandpass filter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FluoroBrite DMEM</td>
			<td style="width:196px;">ThermoFisher</td>
			<td>A1896701</td>
			<td>Cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:375px;">Hal4000</td>
			<td style="width:196px;">Zhuang Lab, Harvard University</td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td>Data acquisition software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ixon89Ultra DU-897U</td>
			<td style="width:196px;">Andor</td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td>EMCCD camera for photon detection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Laser 405, 488, 561, 640 nm</td>
			<td style="width:196px;">CW-OBIS</td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td>Lasers for excitation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:375px;">Insight3</td>
			<td style="width:196px;">Zhuang Lab, Harvard University</td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td>Single molecule localization software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:196px;">Gibco</td>
			<td style="width:173px;">25030-081</td>
			<td>Amino acid required for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">live-cell imaging solution</td>
			<td style="width:196px;">ThermoFisher</td>
			<td>A14291DJ</td>
			<td>Imaging buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Lysotracker Green</td>
			<td style="width:196px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:173px;">L7526</td>
			<td>Bodipy based lysosome marker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mammalian ATCC U2OS cells (Manassas, VA)</td>
			<td colspan="2">Dr. Jochen Mueller (University of Minnesota)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nikon-CFI Apo 100 1.49 N.A</td>
			<td>Nikon</td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td>Oil immersion objective</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin streptomycin</td>
			<td style="width:196px;">Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Sodium Pyruvate</td>
			<td style="width:196px;">Gibco</td>
			<td style="width:173px;">11360-070</td>
			<td>Supplement for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">T562lpxr</td>
			<td style="width:196px;">Chroma</td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td>Beam splitter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:196px;">Gibco</td>
			<td>15400-054</td>
			<td>Dissociation of adherent cell</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">W303 MATa strain</td>
			<td style="width:196px;">Horizon-Dharmacon</td>
			<td style="width:173px;">YSC1058</td>
			<td>Parental yeast strain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Yeast Nitrogen Base</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:173px;">Y1250</td>
			<td>Nitrogen base without amino-acids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">zt405/488/561/640rdc</td>
			<td style="width:196px;">Chroma</td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td>Quadband dichroic mirror</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

conventional bodipy conjugates for live-cell super-resolution microscopy and single-molecule tracking

Die Einzelmolekül-Lokalisierungsmikroskopie (SMLM)-Techniken überwinden die optische Beugungsgrenze der konventionellen Fluoreszenzmikroskopie und können intrazelluläre Strukturen und die Dynamik von Biomolekülen mit einer Genauigkeit von 20 nm auflösen. Eine Voraussetzung für SMLM sind Fluorophore, die von einem dunklen in einen fluoreszierenden Zustand übergehen, um eine räumlich-zeitliche Überlappung ihrer Punktausbreitungsfunktionen in jedem der Tausenden von Datenerfassungsrahmen zu vermeiden. BODIPYs sind etablierte Farbstoffe mit zahlreichen Konjugaten, die in der konventionellen Mikroskopie verwendet werden. Die transiente Bildung rot verschiebtiger BODIPY-Boden-Dimere (DII) führt zu einer hellen Einzelmolekülemission, die eine Einzelmolekül-Lokalisierungsmikroskopie (SMLM) ermöglicht. Hier präsentieren wir ein einfaches, aber vielseitiges Protokoll für SMLM mit konventionellen BODIPY-Konjugaten in lebenden Hefe- und Säugetierzellen. Dieses Verfahren kann verwendet werden, um hochauflösende Bilder zu erfassenII und einzelne BODIPY-D II-Zustände zu verfolgen, um räumlich-zeitliche Informationen von BODIPY-Konjugaten zu extrahieren. Wir wenden dieses Verfahren an, um Lipidtröpfchen (LDs), Fettsäuren und Lysosomen in lebenden Hefe- und Säugetierzellen auf der nanoskopischen Längenskala aufzulösen. Darüber hinaus demonstrieren wir die mehrfarbige Bildgebungsfähigkeit mit BODIPY-Farbstoffen in Verbindung mit anderen fluoreszierenden Sonden. Unsere repräsentativen Ergebnisse zeigen die differenzierte räumliche Verteilung und Mobilität von BODIPY-Fettsäuren und neutralen Lipiden in Hefe unter gefütterten und gefasteten Bedingungen. Dieses optimierte Protokoll für SMLM kann mit Hunderten von kommerziell erhältlichen BODIPY-Konjugaten verwendet werden und ist eine nützliche Ressource, um biologische Prozesse im Nanomaßstab weit über die Anwendungen dieser Arbeit hinaus zu untersuchen.

Hier stellen wir ein optimiertes Probenvorbereitungs-, Datenerfassungs- und Analyseverfahren für SMLM mit BODIPY-Konjugaten auf der Grundlage des obigen Protokolls vor (Abbildung 1A). Um ein Beispiel für den Workflow zum Erfassen und Analysieren von SMLM-Daten zu veranschaulichen, verwenden wir BODIPY (493/503) in Hefe, um LDs unterhalb der optischen Beugungsgrenze aufzulösen (Abbildung 1B-F). Beispiele für die verschiedenen mehrfarbigen Bil...

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Conventional BODIPY Conjugates for Live-Cell Super-Resolution Microscopy and Single-Molecule Tracking

Herkömmliche BODIPY-Konjugate können für die livezellige Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie (SMLM) durch Ausnutzung ihrer vorübergehend bildenden, rot verschiebeten Bodenzustandsdimer eingesetzt werden. Wir präsentieren ein optimiertes SMLM-Protokoll zur Verfolgung und Auflösung subzellulärer neutraler Lipide und Fettsäuren in lebenden Säugetier- und Hefezellen auf der nanoskopischen Längenskala.

Konventionelle BODIPY-Konjugate für Live-Cell Super-Resolution-Mikroskopie und Single-Molecule Tracking

Single molecule localization microscopy (SMLM) techniques overcome the optical diffraction limit of conventional fluorescence microscopy and can resolve ...

Unser Protokoll beschreibt die Verwendung herkömmlicher BODIPY-Farbstoffe für die superhochauflösende Mikroskopie mit ihren spärlichen, rot verschiebten Zuständen. So können wir Organellen und Biomoleküle in lebenden Zellen mit einer Auflösung von 30 Nanometern untersuchen. Der Vorteil dieser Methode ist ihre Einfachheit und die Vielseitigkeit verschiedener verfügbarer BODIPY-Konjugate, die eine langanhaltende Quelle für einzelne Molekülsignale bieten.Unsere nachgewiesene Anwendung könnte wichtig werden, um Erkenntnisse über Krankheiten wie Fettlebererkrankungen oder Typ-2-Diabetes zu gewinnen, indem Lipidtröpfchen und Fettsäure unterhalb der Beugungsgrenze gelöst werden. Wir gewinnen Einblicke in die Fettsäure- und Lipidtröpfchenbiologie in Hefe- und Säugetierzellen. Diese Technik ist jedoch auf alle anderen transparenten Zelltypen mit geringer Hintergrundfluoreszenz anwendbar.Wenn Sie die Technik zum ersten Mal verwenden, stellen Sie sicher, dass die Di-Konzentrationen und Laserkräfte optimiert werden, um helle Einzelmolekülsignale zu beobachten. Eine visuelle Demonstration dieser Technik ist wichtig, um zu sehen, wie die Di-Konzentration und Optimierung der Laserleistung zu hellen Einzelmolekülsignalen führt. Pflegen Sie die Säugetier-U2OS-Zellen in nicht fluoreszierenden DMBM mit 10% fetalem Rinderserum vier Millimolar-Glutamin, einem Millimolar-Natriumpyruvat und einem Prozent Penicillin-Streptomycin-Antibiotika in einem T-25-Kolben.Teilen Sie die Zellen bei 70 bis 80% Konfluenz auf ein bis fünf, und Pipette in einem einzigen Brunnen einer acht Brunnenplatte. Ändern Sie die Zellen in der acht Brunnenplatte für 12 bis 24 Stunden. Zehn Minuten vor der Abbildung fügen Sie ein BODIPY-C12 Lysotracker Grün oder das andere BODIPY-Konjugat hinzu, fügen Sie eine endgültige Konzentration von 100 Nanomolar hinzu.Montieren Sie die entsprechenden Filtersätze in den Emissionspfad, basierend auf der verwendeten Emissionsfarbe von BODIPY. Schalten Sie das Mikroskop ein. Mikroskopstufe, 488 Nanometer und 561-Nanometer-Laser, sowie die Kamera.Fügen Sie einen Tropfen aufkommenden Öl auf dem Mikroskop Objektiv. Öffnen Sie die HAL4000-Software, die das LED-Licht für Lichtfeld-Bildgebung, Laserleistungen, Laserläden und Kameraeinstellungen für die Bildgebung steuert. Stellen Sie den EMVCD-Gewinn auf 30 und die Kameratemperatur auf minus 68 Grad Celsius.Bereiten Sie die Kamera und die entsprechende Software vor, um Filme mit 20 Hertz aufzunehmen. Schalten Sie die Mikroskop-Bühnenheizung ein und stellen Sie sie auf eine Temperatur von 37 Grad Celsius und auf einen Kohlendioxidgehalt von fünf Prozent ein. Passen Sie die Objektivkorrekturfarbe entsprechend an.Montieren Sie die Probe auf der Mikroskopstufe und fokussieren Sie, bis das Fokussiersystem eingreift. Verschieben Sie die Bühne mit dem Stufencontroller, bis fehlerbesagte Zellen im Sichtfeld angezeigt werden. Laden Sie Laser-Shutter-Sequenzen zur Anregung von Monumus sowie Dimmern, denen die Laserleistung des 561-Nanometer-Lasers auf bis zu 821 Kilowatt pro Quadratzentimeter für eine einzelne Molekül-Lokalisierungsmikroskopie liegt, so dass im rot verschobenen Emissionskanal einzelne Molekülfluoreszenzporen nachgewiesen werden.Stellen Sie die Laserleistung zwischen Punkt 035 und Punkt 07 Watt pro Quadratzentimeter für den 488-Nanometer-Laser so ein, dass konventionelle Fluoreszenz im grünen Emissionskanal auftritt. Wählen Sie einen Zielordner für Filme aus, und zeichnen Sie 5000 bis 20000 Erfassungsframes auf, um genügend Lokalisierungen für die Rekonstruktion von Bildern mit super Auflösung zu sammeln. Wechseln Sie zu verschiedenen Sichtfeldern, und wiederholen Sie, um Daten für weitere Zellen zu sammeln.Laden Sie den Film in eine Software für die Analyse der Analyse der Mikromikroskopie mit einem einzigen Molekül. Den Film visuell abschirmen und Kontrasteinstellungen anpassen, so dass ein fluoreszierendes Blinzeln einzelner Moleküle sichtbar ist. So legen Sie einzelne Molekül-Identifikationsparameter für die Anpassung des 2D Gaußian, PSFs, fest.Zeigen Sie visuell durch einige Beispielrahmen, um die Identifikationsparameter zu überprüfen und die einzelnen Fluoreszenzausbrüche eines einzelnen Moleküls zuverlässig zu erkennen. Presseanalyse zur Durchführung der Einzelmolekül-Lokalisierungsmikroskopie stellen Sie sich eine Analyse mit den optimierten Identifikationsparametern vor. Und dann, rendern Jedes einzelne Molekül als 2D Gaußian, dessen Breite durch die umgekehrte Quadratwurzel der entdeckten Anzahl von Photonen gewichtet wird.Bewerten Sie die Qualität der Daten. Verwenden Sie eingeschränkte Rahmenbereiche, um einzelne Molekülverteilungen in spezifischeren Instanzen und zu bestimmten Zeiten zu beobachten. Dies ist für Organellenbewegungen während der Datenerfassung.In dieser Studie haben wir ein optimiertes Probenvorbereitungs-, Datenerfassungs- und Analyseverfahren mit Einzelmolekül-Lokalisierungsmikroskopie mit BODIPY-Konjugaten vorgestellt. Um ein Beispiel für den Workflow zum Erfassen und Analysieren von Daten zur Lokalisierung von Einzelmolekülen zu veranschaulichen, wurde BODIPY in Hefe eingesetzt, um Lipidtröpfchen unterhalb der optischen Beugungsgrenze aufzulösen. Hier werden Beispiele für die verschiedenen multicolor Imaging-Modi von BODIPY in Konjugation mit anderen Sonden wie GFP und mEos2 gezeigt.BODIPY-C12 bildete sich in mobilen nicht-lipid Tröpfchenclustern in der Zellperipherie beim Fasten, im Gegensatz zu ihrer Aufnahme in Lipidtröpfchen unter gefütterten Bedingungen. Um die Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopiefähigkeit von BODIPY-Konjugaten auf Säugetierzellen weiter auszubauen, wurden BODIPY-C12 und Lysotracker green in lebenden U2OS-Zellen abgebildet. Die Optimierung der BODIPY-Konzentration sowie die Erregender der Laserkräfte sind entscheidende Schritte, um helle Einzelmolekülsignale zu visualisieren und Bilder mit super Auflösung zu rekonstruieren.Diese Methode kann mit jedem anderen BODIPY-Konjugat verwendet werden, um hochauflösende Einblicke in die spezielle zeitliche Verteilung bestimmter Biomoleküle in lebenden Zellen zu gewinnen. Unsere Technik ebnete den Weg, um die Lipidtröpfchen- und Fettsäurebiologie auf der nanoskopischen Linsenskala weiter zu befragen. Diese Anwendung geht jedoch weit über die spezifischen philopectetes aufgrund der Verfügbarkeit von verschiedenen funktionellen BODIPY Konjugaten.Bitte beachten Sie die Standard-Betriebsverfahren für den Umgang mit den biologischen Proben und Farbstoffen, und seien Sie auch unsere verpflichteten Hedger und folgen Sie den Lasersicherheitsverfahren.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Single-molecule Super-resolution Imaging of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the Plasma Membrane with Novel Fluorescent Probes

Einzelmolekül-Super-Resolution Imaging von Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphat in der Plasmamembran mit neuartigen Fluoreszenzsonden

Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a ...

Forschung

Biochemie

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

Hochpräzisions-FRET auf Einzelmolekül-Niveau für die Bestimmung der Biomolekülstruktur

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

Einzelmolekül-Manipulation von G-Quadruplexe von magnetischen Pinzette

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Kovalente Immobilisierung von Proteinen für die Einzelmolekül-Spektroskopie Kraft

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteom-weite Quantifizierung des Benennens Homogenität auf der Ebene des einzelnen Moleküls

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

Single-Molecule Tracking-Mikroskopie - Ein Werkzeug zur Bestimmung der diffusiven Zustände von zytosolischen Molekülen

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Produktion von Dynein und Kinesin Motor Ensembles auf DNA Origami Nanostrukturen für die Einzelmolekülbeobachtung

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy

OaAEP1-Vermittelte enzymatische Synthese und Immobilisierung von polymerisiertem Protein für die Einzelmolekül-Kraftspektroskopie

Chemical and bio-conjugation techniques have been developed rapidly in recent years and allow the building of protein polymers. However, a controlled ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Einzelzellanalyse transkriptionell aktiver Allele mittels Einzelmolekül FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

Präzise und genaue Einzelmolekül-FRET-Messungen mit der Open-Source-smfBox

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...