Name: conventional bodipy conjugates for live-cell super-resolution microscopy and single-molecule tracking
Uploaded: 2020-06-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Conventional BODIPY Conjugates for Live-Cell Super-Resolution Microscopy and Single-Molecule Tracking at JoVE.com

A pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada pelo Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais dos Institutos Nacionais de Saúde sob o prêmio número R21GM127965.

NOTA: Para clonagem de levedura e marcação endógena, consulte nossa publicação recente10.
1. Preparação de amostras de células de levedura para imagem
<ol><li>Prepare uma cultura líquida durante a noite de uma cepa de levedura w303. Usando uma vara de madeira estéril, localmente uma pequena quantidade de células de levedura de uma placa de ágar contendo extrato de levedura -peptone-dextrose em um tubo de cultura com ~2 mL de meio sintético de dextrose com...

<ol>
	<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature Methods. 3 (10), 793-796 (2006).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Manley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-density+mapping+of+single-molecule+trajectories+with+photoactivated+localization+microscopy.">High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy.</a> Nature Methods. 5 (2), 155-157 (2008).</li><li>Wu, C. -. Y., Roybal, K. T., Puchner, E. M., Onuffer, J., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+control+of+therapeutic+T+cells+through+a+small+molecule-gated+chimeric+receptor.">Remote control of therapeutic T cells through a small molecule-gated chimeric receptor.</a> Science. 350 (6258), 4077 (2015).</li><li>Heilemann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subdiffraction-resolution+fluorescence+imaging+with+conventional+fluorescent+probes.">Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes.</a> Angewandte Chemie. 47 (33), 6172-6176 (2008).</li><li>Cordes, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+single-molecule+assembled+patterns+with+superresolution+blink-microscopy.">Resolving single-molecule assembled patterns with superresolution blink-microscopy.</a> Nano Letters. 10 (2), 645-651 (2010).</li><li>Smith, E. M., Gautier, A., Puchner, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Localization+Microscopy+with+the+Fluorescence-Activating+and+Absorption-Shifting+Tag+(FAST)+System.">Single-Molecule Localization Microscopy with the Fluorescence-Activating and Absorption-Shifting Tag (FAST) System.</a> ACS chemical biology. 14 (6), 1115-1120 (2019).</li><li>Yan, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+microscopy+using+noncovalent+fluorogen+activation+by+genetically+encoded+fluorogen-activating+proteins.">Localization microscopy using noncovalent fluorogen activation by genetically encoded fluorogen-activating proteins.</a> Chemphyschem: A: European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 15 (4), 687-695 (2014).</li><li>Jungmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+super-resolution+imaging+with+qPAINT.">Quantitative super-resolution imaging with qPAINT.</a> Nature Methods. 13 (5), 439-442 (2016).</li><li>Adhikari, S., Moscatelli, J., Smith, E. M., Banerjee, C., Puchner, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+localization+microscopy+and+tracking+with+red-shifted+states+of+conventional+BODIPY+conjugates+in+living+cells.">Single-molecule localization microscopy and tracking with red-shifted states of conventional BODIPY conjugates in living cells.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).</li><li>Bergstr&#246;m, F., Mikhalyov, I., H&#228;ggl&#246;f, P., Wortmann, R., Ny, T., Johansson, L. B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimers+of+dipyrrometheneboron+difluoride+(BODIPY)+with+light+spectroscopic+applications+in+chemistry+and+biology.">Dimers of dipyrrometheneboron difluoride (BODIPY) with light spectroscopic applications in chemistry and biology.</a> Journal of the American Chemical Society. 124 (2), 196-204 (2002).</li><li>Br&#246;ring, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bis(BF2)-2,2'-bidipyrrins+(BisBODIPYs):+highly+fluorescent+BODIPY+dimers+with+large+stokes+shifts.">Bis(BF2)-2,2'-bidipyrrins (BisBODIPYs): highly fluorescent BODIPY dimers with large stokes shifts.</a> Chemistry (Weinheim an Der Bergstrasse, Germany). 14 (10), 2976-2983 (2008).</li><li>Mikhalyov, I., Gretskaya, N., Bergstr&#246;m, F., Johansson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electronic+ground+and+excited+state+properties+of+dipyrrometheneboron+difluoride+(BODIPY):+Dimers+with+application+to+biosciences.">Electronic ground and excited state properties of dipyrrometheneboron difluoride (BODIPY): Dimers with application to biosciences.</a> Physical Chemistry Chemical Physics. 4 (22), 5663-5670 (2002).</li><li>Pagano, R. E., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+BODIPY-labeled+sphingolipids+to+study+membrane+traffic+along+the+endocytic+pathway.">Use of BODIPY-labeled sphingolipids to study membrane traffic along the endocytic pathway.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 845, 152-160 (1998).</li><li>Bergstr&#246;m, F., H&#228;ggl&#246;f, P., Karolin, J., Ny, T., Johansson, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+site-directed+fluorophore+labeling+and+donor-donor+energy+migration+to+investigate+solution+structure+and+dynamics+in+proteins.">The use of site-directed fluorophore labeling and donor-donor energy migration to investigate solution structure and dynamics in proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (22), 12477-12481 (1999).</li><li>Kowada, T., Maeda, H., Kikuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BODIPY-based+probes+for+the+fluorescence+imaging+of+biomolecules+in+living+cells.">BODIPY-based probes for the fluorescence imaging of biomolecules in living cells.</a> Chemical Society Reviews. 44 (14), 4953-4972 (2015).</li><li>Rocha, J. M., Gahlmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Tracking+Microscopy+-+A+Tool+for+Determining+the+Diffusive+States+of+Cytosolic+Molecules.">Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (151), (2019).</li><li>Sage, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+fight+club:+assessment+of+2D+and+3D+single-molecule+localization+microscopy+software.">Super-resolution fight club: assessment of 2D and 3D single-molecule localization microscopy software.</a> Nature Methods. 16 (5), 387-395 (2019).</li><li>Ovesn&#253;, M., K&#345;&#237;&#382;ek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ThunderSTORM:+a+comprehensive+ImageJ+plug-in+for+PALM+and+STORM+data+analysis+and+super-resolution+imaging.">ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging.</a> Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).</li><li>Puchner, E. M., Walter, J. M., Kasper, R., Huang, B., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counting+molecules+in+single+organelles+with+superresolution+microscopy+allows+tracking+of+the+endosome+maturation+trajectory.">Counting molecules in single organelles with superresolution microscopy allows tracking of the endosome maturation trajectory.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 16015-16020 (2013).</li><li>Shim, S. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+fluorescence+imaging+of+organelles+in+live+cells+with+photoswitchable+membrane+probes.">Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (35), 13978-13983 (2012).</li><li>Hansen, A. S., Woringer, M., Grimm, J. B., Lavis, L. D., Tjian, R., Darzacq, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+model-based+analysis+of+single-particle+tracking+experiments+with+Spot-On.">Robust model-based analysis of single-particle tracking experiments with Spot-On.</a> eLife. 7, (2018).</li><li>Bittel, A. M., Saldivar, I. S., Dolman, N. J., Nan, X., Gibbs, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superresolution+microscopy+with+novel+BODIPY-based+fluorophores.">Superresolution microscopy with novel BODIPY-based fluorophores.</a> PLoS ONE. 13 (10), (2018).</li><li>Wijesooriya, C. S., Peterson, J. A., Shrestha, P., Gehrmann, E. J., Winter, A. H., Smith, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Photoactivatable+BODIPY+Probe+for+Localization-Based+Super-Resolution+Cellular+Imaging.">A Photoactivatable BODIPY Probe for Localization-Based Super-Resolution Cellular Imaging.</a> Angewandte Chemie (International Ed. in English). 57 (39), 12685-12689 (2018).</li><li>Laissue, P. P., Alghamdi, R. A., Tomancak, P., Reynaud, E. G., Shroff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+phototoxicity+in+live+fluorescence+imaging.">Assessing phototoxicity in live fluorescence imaging.</a> Nature Methods. 14 (7), (2017).</li><li>W&#228;ldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., van de Linde, S., Sauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+cell+damage+in+live-cell+super-resolution+microscopy.">Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 15348 (2015).</li><li>Grimm, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+method+to+fine-tune+fluorophores+for+live-cell+and+in+vivo+imaging.">A general method to fine-tune fluorophores for live-cell and in vivo imaging.</a> Nature methods. 14 (10), 987-994 (2017).</li></ol>

Neste protocolo, demonstramos como conjugados BODIPY convencionais podem ser usados para obter imagens SMLM com uma ordem de melhoria de magnitude na resolução espacial. Este método baseia-se na exploração de estados DII previamente relatados de corantes BODIPY convencionais, que se formam transitoriamente através de encontros bi-moleculares. Esses estados podem ser especificamente animados e detectados com comprimentos de onda com mudanças vermelhas e são esparsos e de curta duração suficiente para ...

Técnicas de microscopia de localização de molécula única (SMLM), como microscopia de reconstrução óptica estocástica (STORM) e microscopia de localização ativada por foto (PALM) surgiram como métodos para gerar imagens de super-resolução com informações além do limite de difração óptica da Abbe1,,2 e para o rastreamento da dinâmica de biomoléculas únicas3,,4. Um dos requisitos para sondas compatíveis com SMLM é a capacidade de controlar o número de fluoroforos ativos a qualquer momento para evitar a sobreposição espacial de suas funções de propagação de ponto (PSF). Em cada um dos milhares de quadros de aquisição de dados, a localização de cada fluoroforos fluorescentes é então determinada com precisão de ~20 nm, encaixando sua função de propagação de ponto correspondente. Tradicionalmente, o piscar on-off de fluoroforos tem sido controlado através de fotostocásticas1,,2,5 ou quimicamente induzido piscando6. Outras abordagens incluem a ativação induzida de fluorogens sobre a ligação transitória a uma proteína ativante de fluorogen7,8 e a vinculação programável de oligômeros de DNA rotulados em fluorescência de reflexão interna total (TIRF) ou excitação de folha de luz9. Recentemente, relatamos uma nova e versátil estratégia de rotulagem para o SMLM10, na qual os estados diméricos de mudança vermelha (DII)anteriormente relatados de boro di-pirometano convencional (BODIPY) conjugados11,,12,13 estão se formando transitoriamente e tornam-se especificamente animados e detectados com comprimentos de onda de mudança vermelha.
BODIPYs são corantes amplamente utilizados com centenas de variantes que rotulam especificamente compartimentos subcelulares e biomoléculas14,,15,,16. Devido à sua facilidade de uso e aplicabilidade em células vivas, as variantes BODIPY estão comercialmente disponíveis para microscopia de fluorescência convencional. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado e otimizado sobre como as centenas de conjugados BODIPY disponíveis comercialmente podem ser usados para SMLM de células vivas. Ao ajustar a concentração de monômeros BODIPY e otimizando os poderes de laser de excitação, os parâmetros de análise de imagens e dados, imagens de super-resolução de alta qualidade e dados de rastreamento de moléculas únicas são obtidos em células vivas. Quando utilizados em baixa concentração (25-100 nM), os conjugados BODIPY podem ser usados simultaneamente para SMLM no canal de mudança vermelha e para microscopia de fluorescência convencional correlativa no canal de emissão convencional. Os dados de molécula única obtidos podem ser analisados para quantificar a organização espacial de estruturas imóveis e extrair os estados difusivos de moléculas em células vivas17. A disponibilidade de sondas BODIPY em formas verde e vermelha permite imagens multicoloridos quando usadas na combinação certa com outros fluoroforos compatíveis.
Neste relatório, fornecemos um protocolo otimizado para aquisição e análise de dados SMLM de células vivas usando BODIPY-C12, BODIPY (493/503), BODIPY-C12 vermelho e verde-lysotracker em múltiplas cores. Resolvemos ácidos graxos e lipídios neutros em leveduras vivas e células mamíferas com resolução de ~30 nm. Demonstramos ainda que as células de levedura regulam a distribuição espacial de ácidos graxos adicionados externamente, dependendo de seu estado metabólico. Descobrimos que os ácidos graxos BODIPY (FA) adicionados localizam-se ao ânticulo endoplasmático (ER) e gotículas lipídicas (LDs) sob condições alimentadas, enquanto bodipy-FAs formam aglomerados não-LD na membrana plasmática após o jejum. Estendemos ainda mais a aplicação dessa técnica a líssomos de imagem e LDs em células de mamíferos vivos. Nosso protocolo otimizado para SMLM usando conjugados BODIPY convencionais pode ser um recurso útil para estudar processos biológicos na nanoescala com a miríade de conjugados BODIPY disponíveis.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1009px;" width="1008">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">BODIPY C12</td>
			<td style="width:196px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:173px;">D3822</td>
			<td style="width:265px;">Green fatty acid analog</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">BODIPY C12 Red</td>
			<td style="width:196px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:173px;">D3835</td>
			<td>Red fatty acid analog</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">BODIPY(493/503)</td>
			<td style="width:196px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:173px;">D3922</td>
			<td>Neutral lipid marker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Concanavalin A</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:173px;">C2010</td>
			<td>Cell immobilization on glass surface</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Drop-out Mix Complete w/o nitrogen base</td>
			<td style="width:196px;">US Biological</td>
			<td style="width:173px;">D9515</td>
			<td>Amino acids for SCD</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Dextrose</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:173px;">G7021</td>
			<td>Carbon source for SCD</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Eight Well</td>
			<td style="width:196px;">Cellvis</td>
			<td style="width:173px;">C8-1.58-N</td>
			<td>Chambered Coverglasses</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Eight Well, Lb-Tek II</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td>Chambered Coverglasses</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">ET525/50</td>
			<td style="width:196px;">Chroma</td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td>Bandpass filter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">ET595/50</td>
			<td style="width:196px;">Chroma</td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td>Bandpass filter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">ET610/75</td>
			<td style="width:196px;">Chroma</td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td>Bandpass filter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:196px;">Gibco</td>
			<td style="width:173px;">26140079</td>
			<td>Serum</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">FF652</td>
			<td style="width:196px;">Semrock</td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td>Beam splitter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">FF731/137</td>
			<td style="width:196px;">Semrock</td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td>Bandpass filter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FluoroBrite DMEM</td>
			<td style="width:196px;">ThermoFisher</td>
			<td>A1896701</td>
			<td>Cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:375px;">Hal4000</td>
			<td style="width:196px;">Zhuang Lab, Harvard University</td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td>Data acquisition software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ixon89Ultra DU-897U</td>
			<td style="width:196px;">Andor</td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td>EMCCD camera for photon detection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Laser 405, 488, 561, 640 nm</td>
			<td style="width:196px;">CW-OBIS</td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td>Lasers for excitation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:375px;">Insight3</td>
			<td style="width:196px;">Zhuang Lab, Harvard University</td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td>Single molecule localization software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:196px;">Gibco</td>
			<td style="width:173px;">25030-081</td>
			<td>Amino acid required for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">live-cell imaging solution</td>
			<td style="width:196px;">ThermoFisher</td>
			<td>A14291DJ</td>
			<td>Imaging buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Lysotracker Green</td>
			<td style="width:196px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:173px;">L7526</td>
			<td>Bodipy based lysosome marker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mammalian ATCC U2OS cells (Manassas, VA)</td>
			<td colspan="2">Dr. Jochen Mueller (University of Minnesota)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nikon-CFI Apo 100 1.49 N.A</td>
			<td>Nikon</td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td>Oil immersion objective</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin streptomycin</td>
			<td style="width:196px;">Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Sodium Pyruvate</td>
			<td style="width:196px;">Gibco</td>
			<td style="width:173px;">11360-070</td>
			<td>Supplement for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">T562lpxr</td>
			<td style="width:196px;">Chroma</td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td>Beam splitter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:196px;">Gibco</td>
			<td>15400-054</td>
			<td>Dissociation of adherent cell</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">W303 MATa strain</td>
			<td style="width:196px;">Horizon-Dharmacon</td>
			<td style="width:173px;">YSC1058</td>
			<td>Parental yeast strain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Yeast Nitrogen Base</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:173px;">Y1250</td>
			<td>Nitrogen base without amino-acids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">zt405/488/561/640rdc</td>
			<td style="width:196px;">Chroma</td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td>Quadband dichroic mirror</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

conventional bodipy conjugates for live-cell super-resolution microscopy and single-molecule tracking

As técnicas de microscopia de localização de moléculas únicas (SMLM) superam o limite de difração óptica da microscopia convencional de fluorescência e podem resolver estruturas intracelulares e a dinâmica das biomoléculas com precisão de ~20 nm. Um pré-requisito para SMLM são fluoroforos que transitam de um estado escuro para um fluorescente, a fim de evitar a sobreposição espátula-temporal de suas funções de spread de ponto em cada um dos milhares de quadros de aquisição de dados. BodipYs são corantes bem estabelecidos com numerosos conjugados usados na microscopia convencional. A formação transitória de dimers de estado terrestre BODIPY de mudança vermelha (DII) resulta em emissão de molécula única brilhante permitindo microscopia de localização de moléculas únicas (SMLM). Aqui apresentamos um protocolo simples, mas versátil para SMLM com conjugados BODIPY convencionais em leveduras vivas e células de mamíferos. Este procedimento pode ser usado para adquirir imagens de super-resolução e para rastrear estados bodipy-DII únicos para extrair informações espáteris-temporais de conjugados BODIPY. Aplicamos este procedimento para resolver gotículas lipídicas (LDs), ácidos graxos e lisosomos em leveduras vivas e células mamíferas na escala de comprimento nanoscópico. Além disso, demonstramos a capacidade de imagem multicolorido com corantes BODIPY quando usados em conjunto com outras sondas fluorescentes. Nossos resultados representativos mostram a distribuição espacial diferencial e a mobilidade dos ácidos graxos BODIPY e lipídios neutros na levedura sob condições alimentadas e jejuadas. Este protocolo otimizado para SMLM pode ser usado com centenas de conjugados BODIPY disponíveis comercialmente e é um recurso útil para estudar processos biológicos na nanoescala muito além das aplicações deste trabalho.

Aqui, apresentamos um procedimento otimizado de preparação amostral, aquisição de dados e análise para SMLM utilizando conjugados BODIPY com base no protocolo acima(Figura 1A). Para demonstrar um exemplo do fluxo de trabalho para aquisição e análise de dados SMLM, empregamos BODIPY (493/503) em leveduras para resolver LDs abaixo do limite de difração óptica(Figura 1B-F). Exemplos dos diferentes modos de imagem multicoloridos do BODIPY...

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Conventional BODIPY Conjugates for Live-Cell Super-Resolution Microscopy and Single-Molecule Tracking

Conjugados BODIPY convencionais podem ser usados para microscopia de localização de moléculas únicas de células vivas (SMLM) através da exploração de seus dimers de estado terrestre transitoriamente formados. Apresentamos um protocolo SMLM otimizado para rastrear e resolver lipídios neutros subcelulares e ácidos graxos em células de mamíferos vivos e leveduras na escala de comprimento nanoscópico.

Conjugados BODIPY convencionais para microscopia de super-resolução de células vivas e rastreamento de moléculas únicas

Single molecule localization microscopy (SMLM) techniques overcome the optical diffraction limit of conventional fluorescence microscopy and can resolve ...

Nosso protocolo descreve o uso de corantes BODIPY convencionais para microscopia de super-resolução usando seus estados esparsos e vermelhos. Isso nos permite estudar organelas e biomoléculas em células vivas com resolução de 30 nanômetros. A vantagem deste método é sua simplicidade e a versatilidade de diferentes conjugados BODIPY disponíveis que fornecem uma fonte duradoura de sinais de molécula única.Nossa aplicação demonstrada pode se tornar importante para obter insights sobre doenças como doença hepática gordurosa ou diabetes tipo 2, resolvendo gotículas lipídicas e ácidos graxos abaixo do limite de difração. Nós ganhamos insights em ácido graxo e biologia de gotículas lipídicas em células de levedura e mamíferos. No entanto, essa técnica é aplicável a todos os outros tipos de células transparentes com baixa fluorescência de fundo.Ao usar o técnico pela primeira vez, certifique-se de otimizar as concentrações di e os poderes laser, para observar sinais de molécula única brilhante. Uma demonstração visual deste técnico é importante para ver como a concentração di e otimização da potência laser resulta em sinais brilhantes de molécula única. Mantenha as células U2OS mamianas em DMBM não fluorescentes com soro bovino 10% bovino 4 milimolar glutamina, um piruato de sódio milimolar, e um por cento de antibióticos de estreptomicina de penicilina em um frasco T-25.Divida as células em 70 a 80% de confluência para um a cinco, e pipeta em um único poço de uma placa de oito poços. Altere as células na placa de oito poços por 12 a 24 horas. Dez minutos antes de imagens, adicione um bodipy-C12 Lysotracker verde ou o outro conjugado BODIPY, adicione uma concentração final de 100 nanomolar.Monte os conjuntos de filtros apropriados no caminho de emissão com base na cor de emissão do BODIPY que está sendo utilizado. Ligue o microscópio. Estágio do microscópio, 488 nanômetros e lasers de 561 nanômetros, assim como a câmera.Adicione uma gota de óleo emergente no objetivo do microscópio. Abra o software HAL4000 que controla a luz LED para imagens de campo brilhante, poderes de laser, persianas a laser e configurações de câmera para imagens. Defina o ganho do EMCCD para 30 e a temperatura da câmera para menos 68 graus Celsius.Prepare a câmera e o software correspondente para gravar filmes em 20 Hertz. Ligue o aquecedor do estágio do microscópio e coloque-o em temperatura de 37 graus celsius e a um nível de dióxido de carbono de 5%. Ajuste a cor de correção objetiva de acordo.Monte a amostra no estágio do microscópio e concentre-se até que o sistema de foco se envolva. Mova o estágio usando o controlador de palco até que as células saudáveis apareçam no campo de visão. Carregue sequências de obturadores laser para a excitação de monumus, bem como dimmers, a quem a potência laser do laser de 561 nanômetros para entre 821 quilowatts por centímetro quadrado para uma microscopia de localização de uma única molécula, de tal forma que, poros de fluorescência de molécula única são detectados no canal de emissão deslocada para o vermelho.Ajuste a potência do laser entre o ponto 035 e o ponto 07 watts por centímetro quadrado para o laser de 488 nanômetros, de modo que a fluorescência convencional apareça no canal de emissão verde. Escolha uma pasta de destino para filmes e grave quadros de aquisição de 5000 a 20000 para coletar localizações suficientes para reconstruir imagens de super resolução. Mova-se para diferentes campos de visão e repita para coletar dados para mais células.Carregue o filme em um único software de análise de microscopia de localização de moléculas. Visualmente tela o filme e ajustar configurações de contraste, de modo que uma única molécula fluorescente piscando é visível. Para definir parâmetros de identificação de moléculas únicas para a montagem do gaussiano 2D, PSFs.Visualmente tela através de alguns quadros de exemplo para verificar os parâmetros de identificação, e detectar de forma confiável as distintas rajadas fluorescentes de molécula única. Análise de imprensa para realizar microscopia de localização de moléculas únicas imagine a análise com os parâmetros de identificação otimizados. E então, torne cada molécula como um gaussiano 2D cuja largura é ponderada pela raiz quadrada inversa do número detectado de fótons.Avalie a qualidade dos dados. Use faixas de quadros restritas para observar distribuições de moléculas únicas em instâncias e tempo mais específicos. Isso explica a movimentação de organelas durante a aquisição de dados.Neste estudo, apresentamos um procedimento otimizado de preparação da amostra, aquisição e análise de dados com microscopia de localização de molécula única utilizando conjugados BODIPY. Para demonstrar um exemplo do fluxo de trabalho para aquisição e análise de dados de microscopia de localização de moléculas únicas, o BODIPY na levedura foi empregado para resolver gotículas lipídicas abaixo do limite de difração óptica. Exemplos dos diferentes modos de imagem multicoloridos do BODIPY em conjugação com outras sondas como GFP e mEos2 são mostrados aqui.BODIPY-C12 formou-se em aglomerados móveis de gotículas não lipídicas na periferia celular após o jejum, em contraste com sua incorporação em gotículas lipídicas sob condições alimentadas. Para estender ainda mais a capacidade de microscopia de localização de moléculas únicas de conjugados BODIPY para células mamíferas, BODIPY-C12 e Lysotracker verde em células U2OS vivas foram imagens. Otimizar a concentração do BODIPY, bem como excitar os poderes de laser são passos críticos para visualizar sinais brilhantes de molécula única e reconstruir imagens de super resolução.Este método pode ser usado com qualquer outro conjugado BODIPY para obter uma visão de alta resolução, na distribuição temporal especial de bio-moléculas específicas dentro de células vivas. Nossa técnica abriu caminho.para interrogar ainda mais a gotícula lipídica e a biologia dos ácidos graxos na escala das lentes nanoscópicas. No entanto, esta aplicação vai muito além dos filopectetes específicos devido à disponibilidade de vários conjugados BODIPY funcionais.Por favor, não deixe de seguir os procedimentos operacionais padrão para o manuseio das amostras biológicas e corantes, e também ser nossos hedgers obrigados e seguir os procedimentos de segurança a laser.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Single-molecule Super-resolution Imaging of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the Plasma Membrane with Novel Fluorescent Probes

Única molécula-Super-Resolution Imaging da fosfatidilinositol 4,5-bifosfato na membrana plasmática com o romance fluorescentes Sondas

Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a ...

Bioquímica

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

FRET de alta precisão em nível de molécula única para determinação de estrutura de biomoléculas

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

Manipulação de único-molécula de G-quadruplexes por pinça magnética

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Imobilização covalente de proteínas para a espectroscopia de força única molécula

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Quantificação de Proteome-largo de rotulagem homogeneidade a nível da molécula

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

Microscopia de seguimento da único-molécula-uma ferramenta para determinar os Estados diffusive de moléculas cytosolic

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Produção de conjuntos de motor de dynein e de Kinesin em nanostructures do ADN origami para a única observação da molécula

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy

Síntese Enzimática Mediada oOAEP1 e Imobilização de Proteína Polimerizada para Espectroscopia de Força De Molécula Única

Chemical and bio-conjugation techniques have been developed rapidly in recent years and allow the building of protein polymers. However, a controlled ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Análise celular única de alelos ativos transcricionralmente por peixe de molécula única

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

Fazendo medições de FRET de molécula única precisas e precisas usando o smfBox de código aberto

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...