Name: conventional bodipy conjugates for live-cell super-resolution microscopy and single-molecule tracking
Uploaded: 2020-06-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Conventional BODIPY Conjugates for Live-Cell Super-Resolution Microscopy and Single-Molecule Tracking at JoVE.com

La investigación reportada en esta publicación fue apoyada por el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales de los Institutos Nacionales de Salud bajo el número de premio R21GM127965.

NOTA: Para la clonación de levadura y el etiquetado endógeno, consulte nuestra reciente publicación10.
1. Preparación de muestras de células de levadura para imágenes
<ol><li>Preparar un cultivo líquido durante la noche de una cepa de levadura w303. Usando un palo de madera estéril, detecte una pequeña cantidad de células de levadura de una placa de agar que contiene extracto de levadura–peptona-dextrosa en un tubo de cultivo con 2 ml de dextrosa completa ...

<ol>
	<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature Methods. 3 (10), 793-796 (2006).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Manley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-density+mapping+of+single-molecule+trajectories+with+photoactivated+localization+microscopy.">High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy.</a> Nature Methods. 5 (2), 155-157 (2008).</li><li>Wu, C. -. Y., Roybal, K. T., Puchner, E. M., Onuffer, J., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+control+of+therapeutic+T+cells+through+a+small+molecule-gated+chimeric+receptor.">Remote control of therapeutic T cells through a small molecule-gated chimeric receptor.</a> Science. 350 (6258), 4077 (2015).</li><li>Heilemann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subdiffraction-resolution+fluorescence+imaging+with+conventional+fluorescent+probes.">Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes.</a> Angewandte Chemie. 47 (33), 6172-6176 (2008).</li><li>Cordes, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+single-molecule+assembled+patterns+with+superresolution+blink-microscopy.">Resolving single-molecule assembled patterns with superresolution blink-microscopy.</a> Nano Letters. 10 (2), 645-651 (2010).</li><li>Smith, E. M., Gautier, A., Puchner, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Localization+Microscopy+with+the+Fluorescence-Activating+and+Absorption-Shifting+Tag+(FAST)+System.">Single-Molecule Localization Microscopy with the Fluorescence-Activating and Absorption-Shifting Tag (FAST) System.</a> ACS chemical biology. 14 (6), 1115-1120 (2019).</li><li>Yan, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+microscopy+using+noncovalent+fluorogen+activation+by+genetically+encoded+fluorogen-activating+proteins.">Localization microscopy using noncovalent fluorogen activation by genetically encoded fluorogen-activating proteins.</a> Chemphyschem: A: European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 15 (4), 687-695 (2014).</li><li>Jungmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+super-resolution+imaging+with+qPAINT.">Quantitative super-resolution imaging with qPAINT.</a> Nature Methods. 13 (5), 439-442 (2016).</li><li>Adhikari, S., Moscatelli, J., Smith, E. M., Banerjee, C., Puchner, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+localization+microscopy+and+tracking+with+red-shifted+states+of+conventional+BODIPY+conjugates+in+living+cells.">Single-molecule localization microscopy and tracking with red-shifted states of conventional BODIPY conjugates in living cells.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).</li><li>Bergstr&#246;m, F., Mikhalyov, I., H&#228;ggl&#246;f, P., Wortmann, R., Ny, T., Johansson, L. B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimers+of+dipyrrometheneboron+difluoride+(BODIPY)+with+light+spectroscopic+applications+in+chemistry+and+biology.">Dimers of dipyrrometheneboron difluoride (BODIPY) with light spectroscopic applications in chemistry and biology.</a> Journal of the American Chemical Society. 124 (2), 196-204 (2002).</li><li>Br&#246;ring, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bis(BF2)-2,2'-bidipyrrins+(BisBODIPYs):+highly+fluorescent+BODIPY+dimers+with+large+stokes+shifts.">Bis(BF2)-2,2'-bidipyrrins (BisBODIPYs): highly fluorescent BODIPY dimers with large stokes shifts.</a> Chemistry (Weinheim an Der Bergstrasse, Germany). 14 (10), 2976-2983 (2008).</li><li>Mikhalyov, I., Gretskaya, N., Bergstr&#246;m, F., Johansson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electronic+ground+and+excited+state+properties+of+dipyrrometheneboron+difluoride+(BODIPY):+Dimers+with+application+to+biosciences.">Electronic ground and excited state properties of dipyrrometheneboron difluoride (BODIPY): Dimers with application to biosciences.</a> Physical Chemistry Chemical Physics. 4 (22), 5663-5670 (2002).</li><li>Pagano, R. E., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+BODIPY-labeled+sphingolipids+to+study+membrane+traffic+along+the+endocytic+pathway.">Use of BODIPY-labeled sphingolipids to study membrane traffic along the endocytic pathway.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 845, 152-160 (1998).</li><li>Bergstr&#246;m, F., H&#228;ggl&#246;f, P., Karolin, J., Ny, T., Johansson, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+site-directed+fluorophore+labeling+and+donor-donor+energy+migration+to+investigate+solution+structure+and+dynamics+in+proteins.">The use of site-directed fluorophore labeling and donor-donor energy migration to investigate solution structure and dynamics in proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (22), 12477-12481 (1999).</li><li>Kowada, T., Maeda, H., Kikuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BODIPY-based+probes+for+the+fluorescence+imaging+of+biomolecules+in+living+cells.">BODIPY-based probes for the fluorescence imaging of biomolecules in living cells.</a> Chemical Society Reviews. 44 (14), 4953-4972 (2015).</li><li>Rocha, J. M., Gahlmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Tracking+Microscopy+-+A+Tool+for+Determining+the+Diffusive+States+of+Cytosolic+Molecules.">Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (151), (2019).</li><li>Sage, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+fight+club:+assessment+of+2D+and+3D+single-molecule+localization+microscopy+software.">Super-resolution fight club: assessment of 2D and 3D single-molecule localization microscopy software.</a> Nature Methods. 16 (5), 387-395 (2019).</li><li>Ovesn&#253;, M., K&#345;&#237;&#382;ek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ThunderSTORM:+a+comprehensive+ImageJ+plug-in+for+PALM+and+STORM+data+analysis+and+super-resolution+imaging.">ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging.</a> Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).</li><li>Puchner, E. M., Walter, J. M., Kasper, R., Huang, B., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counting+molecules+in+single+organelles+with+superresolution+microscopy+allows+tracking+of+the+endosome+maturation+trajectory.">Counting molecules in single organelles with superresolution microscopy allows tracking of the endosome maturation trajectory.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 16015-16020 (2013).</li><li>Shim, S. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+fluorescence+imaging+of+organelles+in+live+cells+with+photoswitchable+membrane+probes.">Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (35), 13978-13983 (2012).</li><li>Hansen, A. S., Woringer, M., Grimm, J. B., Lavis, L. D., Tjian, R., Darzacq, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+model-based+analysis+of+single-particle+tracking+experiments+with+Spot-On.">Robust model-based analysis of single-particle tracking experiments with Spot-On.</a> eLife. 7, (2018).</li><li>Bittel, A. M., Saldivar, I. S., Dolman, N. J., Nan, X., Gibbs, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superresolution+microscopy+with+novel+BODIPY-based+fluorophores.">Superresolution microscopy with novel BODIPY-based fluorophores.</a> PLoS ONE. 13 (10), (2018).</li><li>Wijesooriya, C. S., Peterson, J. A., Shrestha, P., Gehrmann, E. J., Winter, A. H., Smith, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Photoactivatable+BODIPY+Probe+for+Localization-Based+Super-Resolution+Cellular+Imaging.">A Photoactivatable BODIPY Probe for Localization-Based Super-Resolution Cellular Imaging.</a> Angewandte Chemie (International Ed. in English). 57 (39), 12685-12689 (2018).</li><li>Laissue, P. P., Alghamdi, R. A., Tomancak, P., Reynaud, E. G., Shroff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+phototoxicity+in+live+fluorescence+imaging.">Assessing phototoxicity in live fluorescence imaging.</a> Nature Methods. 14 (7), (2017).</li><li>W&#228;ldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., van de Linde, S., Sauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+cell+damage+in+live-cell+super-resolution+microscopy.">Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 15348 (2015).</li><li>Grimm, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+method+to+fine-tune+fluorophores+for+live-cell+and+in+vivo+imaging.">A general method to fine-tune fluorophores for live-cell and in vivo imaging.</a> Nature methods. 14 (10), 987-994 (2017).</li></ol>

En este protocolo, demostramos cómo los conjugados BODIPY convencionales se pueden utilizar para obtener imágenes SMLM con una mejora del orden de magnitud en la resolución espacial. Este método se basa en la explotación de los estados DII previamente reportados y desplazados en rojo de los tintes BODIPY convencionales, que se forman transitoriamente a través de encuentros bimolemosos. Estos estados pueden ser específicamente excitados y detectados con longitudes de onda cambiadas en rojo y son lo sufic...

Las técnicas de microscopía de localización de una sola molécula (SMLM) como la microscopía de reconstrucción óptica estocástica (STORM) y la microscopía de localización fotoactivada (PALM) han surgido como métodos para generar imágenes de superresolución con información más allá del límite de difracción óptica de Abbe1,,2 y para el seguimiento de la dinámica de biomoléculas individuales3,,4. Uno de los requisitos para las sondas compatibles con SMLM es la capacidad de controlar el número de fluoróforos activos en cualquier momento para evitar la superposición espacial de sus funciones de propagación de puntos (PSF). En cada uno de los miles de marcos de adquisición de datos, la ubicación de cada fluoróforos fluorescentes se determina con una precisión de 20 nm ajustando su función de dispersión de puntos correspondiente. Tradicionalmente, el parpadeo de encendido y apagado de los fluoróforos se ha controlado a través de fotointerrupción estocástica1,2,5 o intermitente intrínseco inducido químicamente6. Otros enfoques incluyen la activación inducida de fluorógenos en la unión transitoria a una proteína activadora de fluorógeno7,8 y la unión programable-unión-desvinculación de oligómeros de ADN etiquetados en fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) o excitación de lámina de luz9. Recientemente, informamos de una novedosa y versátil estrategia de etiquetado para SMLM10 en la que previamente se informaba de dimeric de cambio en rojo (DII)estados de conjugados convencionales de boro di-pirametano (BODIPY)11,12,13 se forman transitoriamente y se excitan específicamente y se detectan con longitudes de onda cambiadas en rojo.
Los BODIPYs son tintes ampliamente utilizados con cientos de variantes que etiquetan específicamente compartimentos subcelulares y biomoléculas14,,15,,16. Debido a su facilidad de uso y aplicabilidad en células vivas, las variantes BODIPY están disponibles comercialmente para la microscopía de fluorescencia convencional. Aquí, describimos un protocolo detallado y optimizado sobre cómo los cientos de conjugados BODIPY disponibles comercialmente se pueden utilizar para SMLM de células vivas. Al ajustar la concentración de monómeros BODIPY y al optimizar los poderes del láser de excitación, los parámetros de diagnóstico por imágenes y datos, se obtienen imágenes de alta calidad de superresolución y datos de seguimiento de moléculas únicas en células vivas. Cuando se utilizan a baja concentración (25-100 nM), los conjugados BODIPY se pueden utilizar simultáneamente para SMLM en el canal de cambio rojo y para la microscopía de fluorescencia convencional correlativa en el canal de emisión convencional. Los datos obtenidos de una sola molécula se pueden analizar para cuantificar la organización espacial de las estructuras inmóviles y extraer los estados difusos de las moléculas en las células vivas17. La disponibilidad de sondas BODIPY en formas verdes y rojas permite obtener imágenes multicolor cuando se utilizan en la combinación correcta con otros fluoróforos compatibles.
En este informe, proporcionamos un protocolo optimizado para adquirir y analizar datos SMLM de células vivas utilizando BODIPY-C12,BODIPY (493/503), BODIPY-C12 rojo y lysotracker-green en múltiples colores. Resolvemos ácidos grasos y lípidos neutros en levaduras vivas y células de mamíferos con una resolución de 30 nm. Además, demostramos que las células de levadura regulan la distribución espacial de los ácidos grasos añadidos externamente dependiendo de su estado metabólico. Encontramos que los ácidos grasos BODIPY añadidos (FA) se localizan en el retículo endoplasmático (ER) y las gotas de lípidos (LD) en condiciones de alimentación, mientras que BODIPY-FAs forman racimos no LD en la membrana plasmática al en ayunar. Ampliamos aún más la aplicación de esta técnica para tomar imágenes de lisosomas y LDs en células de mamíferos vivos. Nuestro protocolo optimizado para SMLM utilizando conjugados BODIPY convencionales puede ser un recurso útil para estudiar los procesos biológicos a nanoescala con los innumerables conjugados BODIPY disponibles.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1009px;" width="1008">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">BODIPY C12</td>
			<td style="width:196px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:173px;">D3822</td>
			<td style="width:265px;">Green fatty acid analog</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">BODIPY C12 Red</td>
			<td style="width:196px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:173px;">D3835</td>
			<td>Red fatty acid analog</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">BODIPY(493/503)</td>
			<td style="width:196px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:173px;">D3922</td>
			<td>Neutral lipid marker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Concanavalin A</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:173px;">C2010</td>
			<td>Cell immobilization on glass surface</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Drop-out Mix Complete w/o nitrogen base</td>
			<td style="width:196px;">US Biological</td>
			<td style="width:173px;">D9515</td>
			<td>Amino acids for SCD</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Dextrose</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:173px;">G7021</td>
			<td>Carbon source for SCD</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Eight Well</td>
			<td style="width:196px;">Cellvis</td>
			<td style="width:173px;">C8-1.58-N</td>
			<td>Chambered Coverglasses</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Eight Well, Lb-Tek II</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td>Chambered Coverglasses</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">ET525/50</td>
			<td style="width:196px;">Chroma</td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td>Bandpass filter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">ET595/50</td>
			<td style="width:196px;">Chroma</td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td>Bandpass filter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">ET610/75</td>
			<td style="width:196px;">Chroma</td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td>Bandpass filter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:196px;">Gibco</td>
			<td style="width:173px;">26140079</td>
			<td>Serum</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">FF652</td>
			<td style="width:196px;">Semrock</td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td>Beam splitter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">FF731/137</td>
			<td style="width:196px;">Semrock</td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td>Bandpass filter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FluoroBrite DMEM</td>
			<td style="width:196px;">ThermoFisher</td>
			<td>A1896701</td>
			<td>Cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:375px;">Hal4000</td>
			<td style="width:196px;">Zhuang Lab, Harvard University</td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td>Data acquisition software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ixon89Ultra DU-897U</td>
			<td style="width:196px;">Andor</td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td>EMCCD camera for photon detection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Laser 405, 488, 561, 640 nm</td>
			<td style="width:196px;">CW-OBIS</td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td>Lasers for excitation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:375px;">Insight3</td>
			<td style="width:196px;">Zhuang Lab, Harvard University</td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td>Single molecule localization software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:196px;">Gibco</td>
			<td style="width:173px;">25030-081</td>
			<td>Amino acid required for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">live-cell imaging solution</td>
			<td style="width:196px;">ThermoFisher</td>
			<td>A14291DJ</td>
			<td>Imaging buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Lysotracker Green</td>
			<td style="width:196px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:173px;">L7526</td>
			<td>Bodipy based lysosome marker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mammalian ATCC U2OS cells (Manassas, VA)</td>
			<td colspan="2">Dr. Jochen Mueller (University of Minnesota)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nikon-CFI Apo 100 1.49 N.A</td>
			<td>Nikon</td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td>Oil immersion objective</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin streptomycin</td>
			<td style="width:196px;">Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Sodium Pyruvate</td>
			<td style="width:196px;">Gibco</td>
			<td style="width:173px;">11360-070</td>
			<td>Supplement for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">T562lpxr</td>
			<td style="width:196px;">Chroma</td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td>Beam splitter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:196px;">Gibco</td>
			<td>15400-054</td>
			<td>Dissociation of adherent cell</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">W303 MATa strain</td>
			<td style="width:196px;">Horizon-Dharmacon</td>
			<td style="width:173px;">YSC1058</td>
			<td>Parental yeast strain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Yeast Nitrogen Base</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:173px;">Y1250</td>
			<td>Nitrogen base without amino-acids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">zt405/488/561/640rdc</td>
			<td style="width:196px;">Chroma</td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td>Quadband dichroic mirror</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

conventional bodipy conjugates for live-cell super-resolution microscopy and single-molecule tracking

Las técnicas de microscopía de localización de molécula única (SMLM) superan el límite de difracción óptica de la microscopía de fluorescencia convencional y pueden resolver las estructuras intracelulares y la dinámica de las biomoléculas con una precisión de 20 nm. Un requisito previo para SMLM son los fluoróforos que pasan de un estado oscuro a un estado fluorescente para evitar la superposición espacio-temporal de sus funciones de propagación de puntos en cada uno de los miles de marcos de adquisición de datos. Los BODIPYs son tintes bien establecidos con numerosos conjugados utilizados en la microscopía convencional. La formación transitoria de dimers de estado de tierra BODIPY (DII)de cambio rojo da como resultado una emisión brillante de molécula única que permite la microscopía de localización de molécula única (SMLM). Aquí presentamos un protocolo simple pero versátil para SMLM con conjugados BODIPY convencionales en levaduras vivas y células de mamíferos. Este procedimiento se puede utilizar para adquirir imágenes de superresoría y para rastrear estados únicos BODIPY-DII para extraer información espacio-temporal de conjugados BODIPY. Aplicamos este procedimiento para resolver las gotas lipídicas (LD), los ácidos grasos y los lisosomas en las células vivas de levadura y mamíferos en la escala de longitud nanoscópica. Además, demostramos la capacidad de imagen multicolor con tintes BODIPY cuando se utilizan junto con otras sondas fluorescentes. Nuestros resultados representativos muestran la distribución espacial diferencial y la movilidad de los ácidos grasos BODIPY y los lípidos neutros en levaduras en condiciones de alimentación y ayuno. Este protocolo optimizado para SMLM se puede utilizar con cientos de conjugados BODIPY disponibles comercialmente y es un recurso útil para estudiar procesos biológicos a nanoescala mucho más allá de las aplicaciones de este trabajo.

Aquí, presentamos un procedimiento optimizado de preparación, adquisición y análisis de muestras para SMLM utilizando conjugados BODIPY basados en el protocolo anterior (Figura 1A). Para demostrar un ejemplo del flujo de trabajo para adquirir y analizar datos SMLM, empleamos BODIPY (493/503) en levadura para resolver LDs por debajo del límite de difracción óptica (Figura 1B-F). Ejemplos de los diferentes modos de imagen multicolor de BODI...

Watch this Scientific Journal Video about Conventional BODIPY Conjugates for Live-Cell Super-Resolution Microscopy and Single-Molecule Tracking at JoVE.com

Conventional BODIPY Conjugates for Live-Cell Super-Resolution Microscopy and Single-Molecule Tracking

Los conjugados BODIPY convencionales se pueden utilizar para la microscopía de localización de células vivas de una sola molécula (SMLM) a través de la explotación de sus dimers de estado de tierra de formación transitoria y cambio de rojo. Presentamos un protocolo SMLM optimizado para rastrear y resolver lípidos neutros subcelulares y ácidos grasos en mamíferos vivos y células de levadura a escala de longitud nanoscópica.

Conjugaciones BODIPY convencionales para microscopía de superresolución de células vivas y seguimiento de una sola molécula

Single molecule localization microscopy (SMLM) techniques overcome the optical diffraction limit of conventional fluorescence microscopy and can resolve ...

Nuestro protocolo describe el uso de tintes BODIPY convencionales para microscopía de superresor resolución utilizando sus estados dispersos y de cambio en rojo. Esto nos permite estudiar orgánulos y biomoléculas en células vivas con resolución de 30 nanómetros. La ventaja de este método es su simplicidad y la versatilidad de los diferentes conjugados BODIPY disponibles que proporcionan una fuente duradera de señales de molécula única.Nuestra aplicación demostrada podría llegar a ser importante para obtener información sobre enfermedades como la enfermedad del hígado graso o la diabetes tipo 2 mediante la resolución de gotas de lípidos y ácidos grasos por debajo del límite de difracción. Obtenemos información sobre la biología de ácidos grasos y gotas de lípidos en células de levadura y mamíferos. Sin embargo, esta técnica es aplicable a todos los demás tipos de celdas transparentes con fluorescencia de fondo baja.Cuando utilice la técnica por primera vez, asegúrese de optimizar las concentraciones de di y las potencias láser, para observar señales brillantes de molécula única. Una demostración visual de esta técnica es importante para ver cómo la concentración de di y la optimización de la potencia del láser resulta en señales brillantes de molécula única. Mantener las células U2OS de mamíferos en DMBM no fluorescente con 10%suero bovino fetal de cuatro glutamina milimolares, un piruvato de sodio mililitrolar y un porcentaje de antibióticos de estreptomicina de penicilina en un matraz T-25.Divida las celdas en 70 a 80% de confluencia a uno a cinco, y pipetee en un solo pozo de una placa de ocho pozos. Altere las células en la placa de ocho pozos durante 12 a 24 horas. Diez minutos antes de tomarlo por imágenes, añadir un Lysotracker verde BODIPY-C12 o y el otro conjugado BODIPY, añadir una concentración final de 100 nanomolares.Monte los conjuntos de filtros apropiados en la ruta de emisión en función del color de emisión de BODIPY que se esté utilizando. Encienda el microscopio. Etapa del microscopio, láseres de 488 nanómetros y 561 nanómetros, así como la cámara.Añadir una gota de aceite emergente en el objetivo del microscopio. Abra el software HAL4000 que controla la luz LED para obtener imágenes de campo brillante, potencias láser, persianas láser y ajustes de cámara para imágenes. Establezca la ganancia de EMCCD en 30 y la temperatura de la cámara en menos 68 grados centígrados.Prepare la cámara y el software correspondiente para grabar películas a 20 Hertz. Encienda el calentador de etapa del microscopio y establézcalo en una temperatura de 37 grados centígrados y a un nivel de dióxido de carbono del cinco por ciento. Ajuste el color de corrección objetivo en consecuencia.Monte la muestra en la etapa del microscopio y concéntrese hasta que el sistema de enfoque se enganche. Mueva el escenario con el controlador de etapa hasta que aparezcan celdas sanas en el campo de visión. Cargar secuencias de obturación láser para la excitación de monumus así como dimmers, a quienes se detectan poros de fluorescencia de molécula única en el canal de emisión de cambio rojo.Ajuste la potencia del láser entre el punto 035 y el punto 07 vatios por centímetro cuadrado para el láser de 488 nanómetros, de modo que la fluorescencia convencional aparezca en el canal de emisión verde. Elija una carpeta de destino para películas y grabe de 5000 a 20000 marcos de adquisición para recopilar suficientes localizaciones para reconstruir imágenes de super resolución. Muévase a diferentes campos de visión y repita para recopilar datos para más celdas.Cargue la película en un software de análisis de microscopía de localización de molécula única. Visualmente visualmente la película y ajuste los ajustes de contraste, de modo que el parpadeo fluorescente de una sola molécula sea visible. Establecer parámetros de identificación de molécula única para el montaje de los PSF gaussianos 2D.Visualmente a través de algunos marcos de ejemplo para comprobar los parámetros de identificación, y detectar de forma fiable las distintas ráfagas fluorescentes de molécula única. Análisis de prensa para realizar una microscopía de localización de molécula única imagine el análisis con los parámetros de identificación optimizados. Y luego, renderizar cada molécula como un gaussiano 2D cuya anchura está ponderada por la raíz cuadrada inversa del número detectado de fotones.Evaluar la calidad de los datos. Utilice rangos de trama restringidos para observar distribuciones de moléculas individuales en instancias y tiempo más específicos. Esto explica el movimiento del organel durante la adquisición de datos.En este estudio, presentamos un procedimiento optimizado de preparación, adquisición y análisis de muestras con microscopía de localización de molécula única utilizando conjugados BODIPY. Para demostrar un ejemplo del flujo de trabajo para adquirir y analizar datos de microscopía de localización de moléculas únicas, BODIPY en levadura se empleó para resolver gotas de lípidos por debajo del límite de difracción óptica. Aquí se muestran ejemplos de los diferentes modos de imagen multicolor de BODIPY en conjugación con otras sondas como GFP y mEos2.BODIPY-C12 formado en racimos móviles de gotas no lipídicas en la periferia celular en ayunas, en contraste con su incorporación en gotas de lípidos en condiciones de alimentación. Para ampliar aún más la capacidad de microscopía de localización de molécula única de los conjugados BODIPY a las células de mamíferos, se tomaron imágenes de BODIPY-C12 y Lysotracker verdes en células U2OS vivas. La optimización de la concentración de BODIPY, así como la excitación de las potencias láser son pasos críticos con el fin de visualizar señales brillantes de molécula única, y para reconstruir imágenes de super resolución.Este método se puede utilizar con cualquier otro conjugado BODIPY para obtener información de alta resolución, en la distribución temporal especial de biomoléculas específicas dentro de las células vivas. Nuestra técnica allanó el camino.para seguir interrogando la gota de lípidos y la biología de los ácidos grasos en la escala de lentes nanoscópicas. Sin embargo, esta aplicación va mucho más allá de los filopectetos específicos debido a la disponibilidad de varios conjugados funcionales BODIPY.Por favor, asegúrese de seguir los procedimientos de operación estándar para el manejo de las muestras biológicas y tintes, y también ser nuestros coberturas obligadas y seguir los procedimientos de seguridad láser.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Single-molecule Super-resolution Imaging of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the Plasma Membrane with Novel Fluorescent Probes

Single-molécula de super-resolución de imagen de fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato en la membrana plasmática con la novela fluorescentes Sondas

Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a ...

Investigación

Bioquímica

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

FRET de alta precisión a nivel de molécula única para la determinación de estructuras de biomoléculas

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

Manipulación de una sola molécula de G-quadruplexes por pinzas magnéticas

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Inmovilización covalente de las proteínas para la espectroscopia de fuerza sola molécula

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Cuantificación de todo el proteoma de etiquetado homogeneidad en el nivel de molécula única

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

Microscopía de seguimiento de una sola molécula - Una herramienta para determinar los estados difusos de las moléculas citosólicas

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Producción de Conjuntos de Motores de Dynein y Kinesin en Nanoestructuras de Origami de ADN para Observación de MoléculaS Simples

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy

Síntesis enzimática mediada por OaAEP1 e inmovilización de proteína polimerizada para espectroscopia de fuerza de una sola molécula

Chemical and bio-conjugation techniques have been developed rapidly in recent years and allow the building of protein polymers. However, a controlled ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Análisis unicelular de alelos transcripcionalmente activos por FISH de molécula única

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

Realización de mediciones FRET precisas y precisas de una sola molécula utilizando el smfBox de código abierto

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...