Name: conventional bodipy conjugates for live-cell super-resolution microscopy and single-molecule tracking
Uploaded: 2020-06-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Conventional BODIPY Conjugates for Live-Cell Super-Resolution Microscopy and Single-Molecule Tracking at JoVE.com

Den forskning som redovisas i denna publikation stöddes av National Institute of General Medical Sciences vid National Institutes of Health under tilldelningsnummer R21GM127965.

OBS: För jäst kloning och endogen märkning se vår senaste publikation10.
1. Beredning av jästcellprover för bildbehandling
<ol><li>Förbered en flytande över natten kultur av en w303 jäst stam. Använd en steril träpinne, upptäck en liten mängd jästceller från en agar platta som innehåller jästextrakt-pepton-dextros till en kultur rör med ~ 2 ml syntetiskt komplett dextros (SCD) medium. Inkubera röret över natten i en skakande inkubator vid 270 varv/...

<ol>
	<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature Methods. 3 (10), 793-796 (2006).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Manley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-density+mapping+of+single-molecule+trajectories+with+photoactivated+localization+microscopy.">High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy.</a> Nature Methods. 5 (2), 155-157 (2008).</li><li>Wu, C. -. Y., Roybal, K. T., Puchner, E. M., Onuffer, J., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+control+of+therapeutic+T+cells+through+a+small+molecule-gated+chimeric+receptor.">Remote control of therapeutic T cells through a small molecule-gated chimeric receptor.</a> Science. 350 (6258), 4077 (2015).</li><li>Heilemann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subdiffraction-resolution+fluorescence+imaging+with+conventional+fluorescent+probes.">Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes.</a> Angewandte Chemie. 47 (33), 6172-6176 (2008).</li><li>Cordes, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+single-molecule+assembled+patterns+with+superresolution+blink-microscopy.">Resolving single-molecule assembled patterns with superresolution blink-microscopy.</a> Nano Letters. 10 (2), 645-651 (2010).</li><li>Smith, E. M., Gautier, A., Puchner, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Localization+Microscopy+with+the+Fluorescence-Activating+and+Absorption-Shifting+Tag+(FAST)+System.">Single-Molecule Localization Microscopy with the Fluorescence-Activating and Absorption-Shifting Tag (FAST) System.</a> ACS chemical biology. 14 (6), 1115-1120 (2019).</li><li>Yan, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+microscopy+using+noncovalent+fluorogen+activation+by+genetically+encoded+fluorogen-activating+proteins.">Localization microscopy using noncovalent fluorogen activation by genetically encoded fluorogen-activating proteins.</a> Chemphyschem: A: European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 15 (4), 687-695 (2014).</li><li>Jungmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+super-resolution+imaging+with+qPAINT.">Quantitative super-resolution imaging with qPAINT.</a> Nature Methods. 13 (5), 439-442 (2016).</li><li>Adhikari, S., Moscatelli, J., Smith, E. M., Banerjee, C., Puchner, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+localization+microscopy+and+tracking+with+red-shifted+states+of+conventional+BODIPY+conjugates+in+living+cells.">Single-molecule localization microscopy and tracking with red-shifted states of conventional BODIPY conjugates in living cells.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).</li><li>Bergstr&#246;m, F., Mikhalyov, I., H&#228;ggl&#246;f, P., Wortmann, R., Ny, T., Johansson, L. B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimers+of+dipyrrometheneboron+difluoride+(BODIPY)+with+light+spectroscopic+applications+in+chemistry+and+biology.">Dimers of dipyrrometheneboron difluoride (BODIPY) with light spectroscopic applications in chemistry and biology.</a> Journal of the American Chemical Society. 124 (2), 196-204 (2002).</li><li>Br&#246;ring, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bis(BF2)-2,2'-bidipyrrins+(BisBODIPYs):+highly+fluorescent+BODIPY+dimers+with+large+stokes+shifts.">Bis(BF2)-2,2'-bidipyrrins (BisBODIPYs): highly fluorescent BODIPY dimers with large stokes shifts.</a> Chemistry (Weinheim an Der Bergstrasse, Germany). 14 (10), 2976-2983 (2008).</li><li>Mikhalyov, I., Gretskaya, N., Bergstr&#246;m, F., Johansson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electronic+ground+and+excited+state+properties+of+dipyrrometheneboron+difluoride+(BODIPY):+Dimers+with+application+to+biosciences.">Electronic ground and excited state properties of dipyrrometheneboron difluoride (BODIPY): Dimers with application to biosciences.</a> Physical Chemistry Chemical Physics. 4 (22), 5663-5670 (2002).</li><li>Pagano, R. E., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+BODIPY-labeled+sphingolipids+to+study+membrane+traffic+along+the+endocytic+pathway.">Use of BODIPY-labeled sphingolipids to study membrane traffic along the endocytic pathway.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 845, 152-160 (1998).</li><li>Bergstr&#246;m, F., H&#228;ggl&#246;f, P., Karolin, J., Ny, T., Johansson, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+site-directed+fluorophore+labeling+and+donor-donor+energy+migration+to+investigate+solution+structure+and+dynamics+in+proteins.">The use of site-directed fluorophore labeling and donor-donor energy migration to investigate solution structure and dynamics in proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (22), 12477-12481 (1999).</li><li>Kowada, T., Maeda, H., Kikuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BODIPY-based+probes+for+the+fluorescence+imaging+of+biomolecules+in+living+cells.">BODIPY-based probes for the fluorescence imaging of biomolecules in living cells.</a> Chemical Society Reviews. 44 (14), 4953-4972 (2015).</li><li>Rocha, J. M., Gahlmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Tracking+Microscopy+-+A+Tool+for+Determining+the+Diffusive+States+of+Cytosolic+Molecules.">Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (151), (2019).</li><li>Sage, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+fight+club:+assessment+of+2D+and+3D+single-molecule+localization+microscopy+software.">Super-resolution fight club: assessment of 2D and 3D single-molecule localization microscopy software.</a> Nature Methods. 16 (5), 387-395 (2019).</li><li>Ovesn&#253;, M., K&#345;&#237;&#382;ek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ThunderSTORM:+a+comprehensive+ImageJ+plug-in+for+PALM+and+STORM+data+analysis+and+super-resolution+imaging.">ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging.</a> Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).</li><li>Puchner, E. M., Walter, J. M., Kasper, R., Huang, B., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counting+molecules+in+single+organelles+with+superresolution+microscopy+allows+tracking+of+the+endosome+maturation+trajectory.">Counting molecules in single organelles with superresolution microscopy allows tracking of the endosome maturation trajectory.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 16015-16020 (2013).</li><li>Shim, S. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+fluorescence+imaging+of+organelles+in+live+cells+with+photoswitchable+membrane+probes.">Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (35), 13978-13983 (2012).</li><li>Hansen, A. S., Woringer, M., Grimm, J. B., Lavis, L. D., Tjian, R., Darzacq, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+model-based+analysis+of+single-particle+tracking+experiments+with+Spot-On.">Robust model-based analysis of single-particle tracking experiments with Spot-On.</a> eLife. 7, (2018).</li><li>Bittel, A. M., Saldivar, I. S., Dolman, N. J., Nan, X., Gibbs, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superresolution+microscopy+with+novel+BODIPY-based+fluorophores.">Superresolution microscopy with novel BODIPY-based fluorophores.</a> PLoS ONE. 13 (10), (2018).</li><li>Wijesooriya, C. S., Peterson, J. A., Shrestha, P., Gehrmann, E. J., Winter, A. H., Smith, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Photoactivatable+BODIPY+Probe+for+Localization-Based+Super-Resolution+Cellular+Imaging.">A Photoactivatable BODIPY Probe for Localization-Based Super-Resolution Cellular Imaging.</a> Angewandte Chemie (International Ed. in English). 57 (39), 12685-12689 (2018).</li><li>Laissue, P. P., Alghamdi, R. A., Tomancak, P., Reynaud, E. G., Shroff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+phototoxicity+in+live+fluorescence+imaging.">Assessing phototoxicity in live fluorescence imaging.</a> Nature Methods. 14 (7), (2017).</li><li>W&#228;ldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., van de Linde, S., Sauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+cell+damage+in+live-cell+super-resolution+microscopy.">Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 15348 (2015).</li><li>Grimm, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+method+to+fine-tune+fluorophores+for+live-cell+and+in+vivo+imaging.">A general method to fine-tune fluorophores for live-cell and in vivo imaging.</a> Nature methods. 14 (10), 987-994 (2017).</li></ol>

I detta protokoll visade vi hur konventionella BODIPY konjugat kan användas för att få SMLM bilder med en storleksordning förbättring i rumslig upplösning. Denna metod är baserad på att utnyttja tidigare rapporterade, röd-skiftade DII stater konventionella BODIPY färgämnen, som övergående form genom bi-molekylära möten. Dessa tillstånd kan vara särskilt upphetsad och upptäcks med röd-skiftade våglängder och är glesa och kortlivade nog för SMLM. Genom att justera koncentrationen av BODIPY...

Single-molecule localization microscopy (SMLM) tekniker såsom stokastiska optisk rekonstruktion mikroskopi (STORM) och foto-aktiverad lokalisering mikroskopi (PALM) har dykt upp som metoder för att generera super-upplösning bilder med information utöver Abbe optiska diffraktion gräns1,2 och för att spåra dynamiken i enda biomolekyler3,4. Ett av kraven för sonder som är kompatibla med SMLM är möjligheten att kontrollera antalet aktiva fluoroforeer när som helst för att undvika rumslig överlappning av deras punktspridningsfunktioner (POLYESTERSTAPELS). I var och en av de tusentals datainsamlingsramar bestäms platsen för varje fluorescerande fluorofores med ~20 nm precision genom att montera motsvarande punktspridningsfunktion. Traditionellt har on-off blinkning av fluorofores kontrolleras genom stokastiska photoswitching1,2,,5 eller kemiskt inducerad inneboende blinkande6. Andra metoder är aktivering av fluorogener vid transientbindning till ett fluorogenaktiverande protein7,,8 och den programmerbara bindnings-unbinding av märkta DNA-oligomererer i total intern reflektionfluorescens (TIRF) eller ljusplåts excitation9. Nyligen rapporterade vi en ny och mångsidig märkning strategi för SMLM10 där tidigare rapporterade röd-skiftade dimeric (DII)stater konventionella bor di-pyrometan (BODIPY) conjugates11,12,13 är övergående bildar och blir specifikt upphetsad och upptäcks med röd-skiftade våglängder.
BODIPYs används ofta färgämnen med hundratals varianter som specifikt etikett subcellulära fack och biomolekyler14,15,16. På grund av deras användarvänlighet och tillämplighet i levande celler, BODIPY varianter är kommersiellt tillgängliga för konventionell fluorescensmikroskopi. Här beskriver vi ett detaljerat och optimerat protokoll om hur de hundratals kommersiellt tillgängliga BODIPY konjugat kan användas för live-cell SMLM. Genom att justera koncentrationen av BODIPY monomerer och genom att optimera excitation laserkrafter, bildbehandling och dataanalysparametrar, högkvalitativa superupplösningsbilder och enda molekylspårningsdata erhålls i levande celler. Vid låg koncentration (25-100 nM) kan BODIPY-konjugat samtidigt användas för SMLM i den rödförskjutna kanalen och för korrelerad konventionell fluorescensmikroskopi i den konventionella utsläppskanalen. De erhållna enskilda molekyldata kan analyseras för att kvantifiera den rumsliga organisationen av orörliga strukturer och för att extrahera de diffusiva tillstånden hos molekyler i levande celler17. Tillgången på BODIPY-sonder i både gröna och röda former möjliggör flerfärgsavbildning när de används i rätt kombination med andra kompatibla fluorofores.
I den här rapporten tillhandahåller vi ett optimerat protokoll för att förvärva och analysera live-cell SMLM-data med BODIPY-C12, BODIPY (493/503), BODIPY-C12 röd och lysotracker-grön i flera färger. Vi löser fettsyror och neutrala lipider i levande jäst- och däggdjursceller med ~30 nm upplösning. Vi visar vidare att jästceller reglerar den rumsliga fördelningen av externt tillsatta fettsyror beroende på deras metaboliska tillstånd. Vi finner att la BODIPY-fettsyror (FA) lokalisera till endoplasmic reticulum (ER) och lipid droppar (LDs) under utfodras villkor medan BODIPY-FAs form icke-LD kluster i plasma membran vid fasta. Vi utökar tillämpningen av denna teknik ytterligare till bildlysosomer och LDs i levande däggdjursceller. Vårt optimerade protokoll för SMLM med konventionella BODIPY konjugat kan vara en användbar resurs för att studera biologiska processer på nanoskala med de otaliga tillgängliga BODIPY konjugat.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1009px;" width="1008">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">BODIPY C12</td>
			<td style="width:196px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:173px;">D3822</td>
			<td style="width:265px;">Green fatty acid analog</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">BODIPY C12 Red</td>
			<td style="width:196px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:173px;">D3835</td>
			<td>Red fatty acid analog</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">BODIPY(493/503)</td>
			<td style="width:196px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:173px;">D3922</td>
			<td>Neutral lipid marker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Concanavalin A</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:173px;">C2010</td>
			<td>Cell immobilization on glass surface</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Drop-out Mix Complete w/o nitrogen base</td>
			<td style="width:196px;">US Biological</td>
			<td style="width:173px;">D9515</td>
			<td>Amino acids for SCD</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Dextrose</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:173px;">G7021</td>
			<td>Carbon source for SCD</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Eight Well</td>
			<td style="width:196px;">Cellvis</td>
			<td style="width:173px;">C8-1.58-N</td>
			<td>Chambered Coverglasses</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Eight Well, Lb-Tek II</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td>Chambered Coverglasses</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">ET525/50</td>
			<td style="width:196px;">Chroma</td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td>Bandpass filter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">ET595/50</td>
			<td style="width:196px;">Chroma</td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td>Bandpass filter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">ET610/75</td>
			<td style="width:196px;">Chroma</td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td>Bandpass filter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:196px;">Gibco</td>
			<td style="width:173px;">26140079</td>
			<td>Serum</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">FF652</td>
			<td style="width:196px;">Semrock</td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td>Beam splitter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">FF731/137</td>
			<td style="width:196px;">Semrock</td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td>Bandpass filter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FluoroBrite DMEM</td>
			<td style="width:196px;">ThermoFisher</td>
			<td>A1896701</td>
			<td>Cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:375px;">Hal4000</td>
			<td style="width:196px;">Zhuang Lab, Harvard University</td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td>Data acquisition software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ixon89Ultra DU-897U</td>
			<td style="width:196px;">Andor</td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td>EMCCD camera for photon detection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Laser 405, 488, 561, 640 nm</td>
			<td style="width:196px;">CW-OBIS</td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td>Lasers for excitation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:375px;">Insight3</td>
			<td style="width:196px;">Zhuang Lab, Harvard University</td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td>Single molecule localization software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:196px;">Gibco</td>
			<td style="width:173px;">25030-081</td>
			<td>Amino acid required for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">live-cell imaging solution</td>
			<td style="width:196px;">ThermoFisher</td>
			<td>A14291DJ</td>
			<td>Imaging buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Lysotracker Green</td>
			<td style="width:196px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:173px;">L7526</td>
			<td>Bodipy based lysosome marker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mammalian ATCC U2OS cells (Manassas, VA)</td>
			<td colspan="2">Dr. Jochen Mueller (University of Minnesota)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nikon-CFI Apo 100 1.49 N.A</td>
			<td>Nikon</td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td>Oil immersion objective</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin streptomycin</td>
			<td style="width:196px;">Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Sodium Pyruvate</td>
			<td style="width:196px;">Gibco</td>
			<td style="width:173px;">11360-070</td>
			<td>Supplement for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">T562lpxr</td>
			<td style="width:196px;">Chroma</td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td>Beam splitter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:196px;">Gibco</td>
			<td>15400-054</td>
			<td>Dissociation of adherent cell</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">W303 MATa strain</td>
			<td style="width:196px;">Horizon-Dharmacon</td>
			<td style="width:173px;">YSC1058</td>
			<td>Parental yeast strain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Yeast Nitrogen Base</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:173px;">Y1250</td>
			<td>Nitrogen base without amino-acids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">zt405/488/561/640rdc</td>
			<td style="width:196px;">Chroma</td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td>Quadband dichroic mirror</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

conventional bodipy conjugates for live-cell super-resolution microscopy and single-molecule tracking

Single molecule localization microscopy (SMLM) tekniker övervinna den optiska diffraktion gränsen för konventionell fluorescensmikroskopi och kan lösa intracellulära strukturer och dynamiken i biomolekyler med ~ 20 nm precision. En förutsättning för SMLM är fluorofores som övergår från ett mörkt till ett fluorescerande tillstånd för att undvika spatio-temporal överlappning av deras punktspridningsfunktioner i var och en av de tusentals datainsamlingsramarna. BODIPYs är väletablerade färgämnen med många konjugat som används i konventionell mikroskopi. Den övergående bildandet av rödförskjutna BODIPY marktillståndsdimmer (DII)resulterar i ljust enda molekylutsläpp som möjliggör enmolekyllokaliseringsmikroskopi (SMLM). Här presenterar vi ett enkelt men mångsidigt protokoll för SMLM med konventionella BODIPY konjugat i levande jäst och däggdjursceller. Denna procedur kan användas för att förvärva super-upplösning bilder och att spåra enda BODIPY-DII stater att extrahera spatio-temporal information om BODIPY konjugat. Vi tillämpar detta förfarande för att lösa lipiddroppar (LD), fettsyror och lysosomer i levande jäst- och däggdjursceller på nanoskopisk längdskala. Dessutom visar vi multi-color imaging kapacitet med BODIPY färgämnen när de används tillsammans med andra fluorescerande sonder. Våra representativa resultat visar differentiell rumslig fördelning och rörlighet av BODIPY-fettsyror och neutrala lipider i jäst under utfodras och fasted villkor. Detta optimerade protokoll för SMLM kan användas med hundratals kommersiellt tillgängliga BODIPY konjugat och är en användbar resurs för att studera biologiska processer på nanoskala långt utöver tillämpningarna av detta arbete.

Här presenterar vi ett optimerat urval beredning, datainsamling och analys förfarande för SMLM med BODIPY konjugat baserat på protokollet ovan (figur 1A). För att visa ett exempel på arbetsflödet för att förvärva och analysera SMLM-data använder vi BODIPY (493/503) i jäst för att lösa LD:er under den optiska diffraktionsgränsen (figur 1B-F). Exempel på de olika flerfärgsbildslägena för BODIPY tillsammans med andra sonder som G...

Watch this Scientific Journal Video about Conventional BODIPY Conjugates for Live-Cell Super-Resolution Microscopy and Single-Molecule Tracking at JoVE.com

Conventional BODIPY Conjugates for Live-Cell Super-Resolution Microscopy and Single-Molecule Tracking

Konventionella BODIPY konjugat kan användas för levande-cell single-molekyl lokalisering mikroskopi (SMLM) genom utnyttjande av deras övergående bildar, röd-skiftade mark tillstånd dimers. Vi presenterar ett optimerat SMLM-protokoll för att spåra och lösa subcellulära neutrala lipider och fettsyror i levande däggdjurs- och jästceller på den nanoskopiska längdskalan.

Konventionella BODIPY konjugat för Live-Cell Super-Resolution Mikroskopi och single-molecule tracking

Single molecule localization microscopy (SMLM) techniques overcome the optical diffraction limit of conventional fluorescence microscopy and can resolve ...

Vårt protokoll beskriver användningen av konventionella BODIPY färgämnen för super-upplösning mikroskopi med hjälp av deras glesa, röd-skiftade stater. Detta gör det möjligt för oss att studera organeller och biomolekyler i levande celler med 30-nanometerupplösning. Fördelen med denna metod är dess enkelhet och mångsidigheten hos olika tillgängliga BODIPY konjugater som ger en långvarig källa till enstaka molekylsignaler.Vår visade ansökan kan bli viktigt att få insikter i sjukdomar som fettlever eller typ 2 diabetes genom att lösa lipiddroppar och fettsyra under diffraktion gränsen. Vi får insikt i fettsyra och lipiddroppbiologi i jäst och däggdjursceller. Denna teknik är dock tillämplig på alla andra transparenta celltyper med låg bakgrundsfluorescens.När du använder den technic för första gången, se till att optimera di koncentrationer och laser befogenheter, att observera ljusa single molecule signaler. En visuell demonstration av denna technic är viktigt att se hur di koncentration och optimering av laserkraft resulterar i ljusa enstaka molekylsignaler. Bibehålla cellerna i däggdjur U2OS i icke-fluorescerande DMBM med 10%fetalt bovint serum fyra millimolar glutamin, en millimolar natriumpyuvat och en procent penicillin streptomycin antibiotika i en T-25 kolv.Dela cellerna på 70 till 80%konfluency till en till fem, och pipetter i en enda brunn av en åtta brunnsplatta. Förändra cellerna i åtta brunnsplattan i 12 till 24 timmar. Tio minuter före imaging det, lägga till en BODIPY-C12 Lysotracker grön eller och den andra BODIPY konjugat, lägga till en slutlig koncentration av 100 nanomolar.Montera lämpliga filteruppsättningar i emissionsbanan baserat på den emissionsfärg av BODIPY som används. Sätt på mikroskopet. Mikroskopet skede, 488 nanometer och 561-nanometerlasrar, samt kameran.Tillsätt en droppe ny olja på mikroskop målet. Öppna PROGRAMVARAN HAL4000 som styr LED-ljuset för ljust fältavbildning, laserkrafter, laserluckor och kamerainställningar för bildtagning. Ställ in EMCCD-förstärkningen till 30 och kameratemperaturen till minus 68 grader Celsius.Förbered kameran och motsvarande programvara för att spela in filmer på 20 Hertz. Slå på mikroskopet scenen värmaren och ställ in den på temperatur på 37 grader celsius och till en koldioxidnivå på fem procent. Justera den objektiva korrigeringsfärgen därefter.Montera provet på mikroskopet scenen och fokusera tills fokuseringssystemet engagerar. Flytta scenen med hjälp av scenstyrenheten tills friska celler visas i synfältet. Ladda laser slutare sekvenser för excitation av monumus samt dimmers, till vem laserkraft av 561-nanometer laser till mellan 821 kilowatt per kvadratcentimeter för en enda molekyl lokalisering mikroskopi, så att, enda molekyl fluorescens porer detekteras i rödförskjutna utsläpp kanal.Justera lasereffekten mellan punkt 035 och punkt 07 watt per kvadratcentimeter för 488-nanometerlasern, så att konventionell fluorescens visas i den gröna utsläppskanalen. Välj en målmapp för filmer och spela in 5000 till 20000 förvärvsramar för att samla tillräckligt med lokaliseringar för att rekonstruera superupplösningsbilder. Flytta till olika fält av vy och upprepa för att samla in data för fler celler.Ladda filmen i en enda molekyl lokalisering mikroskopi analys programvara. Screena filmen visuellt och justera kontrastinställningar, så att enmolekylfluorescerande blinkande är synlig. Att ställa in enmolekyl identifiering parametrar för montering av 2D Gaussian, PSFs.Visuellt skärm genom några exempel ramar för att kontrollera identifieringsparametrar, och tillförlitligt upptäcka de distinkta enda molekyl fluorescerande skurar. Tryck analys för att utföra enstaka molekyl lokaliseringsmikroskopi föreställa analys med de optimerade identifiering parametrar. Och sedan, göra varje enskild molekyl som en 2D Gaussian vars bredd är viktad av den omvända kvadratroten av det upptäckta antalet fotoner.Bedöma uppgifternas kvalitet. Använd begränsade ramintervall för att observera enstaka molekylfördelningar vid mer specifika instanser och tid. Detta står för organell rörelse under datainsamling.I denna studie presenterade vi en optimerad prov beredning, data förvärv och analys förfarande med enda molekyl lokalisering mikroskopi med hjälp av BODIPY konjugater. För att visa ett exempel på arbetsflödet för att förvärva och analysera single molecule lokaliseringsmikroskopi data, var BODIPY i jäst anställd för att lösa lipiddroppar under den optiska diffraktion gränsen. Exempel på de olika multicolor bildlägena av BODIPY i konjugering med andra sonder som GFP och mEos2 visas här.BODIPY-C12 bildas i mobila icke-lipiddropp kluster i cell periferi vid fasta, i motsats till deras införlivande i lipiddroppar under fed förhållanden. För att ytterligare utöka den enda molekylen lokalisering mikroskopi förmåga BODIPY konjugater till däggdjur celler, VAR BODIPY-C12 och Lysotracker grönt i levande U2OS celler avbildas. Optimera BODIPY koncentration samt spännande laserkrafterna är kritiska steg för att visualisera ljusa enmolekylsignaler, och för att rekonstruera superupplösningsbilder.Denna metod kan användas med någon annan BODIPY konjugat för att få hög upplösning insikt, i den speciella temporala fördelningen av specifika biomolekyler inuti levande celler. Vår technic banade väg, att ytterligare förhöra lipiddropp och fettsyrabiologi på nanoskopisk lins skala. Men går denna ansökan långt utöver de specifika philopectetes på grund av tillgången på olika funktionella BODIPY konjugater.Var noga med att följa de standarda driftsrutinerna för hantering av de biologiska proverna och färgämnena, och också vara våra förpliktade hedgers och följa lasersäkerhetsrutinerna.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Single-molecule Super-resolution Imaging of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the Plasma Membrane with Novel Fluorescent Probes

Enda molekyl Super-upplösning avbildning av Fosfatidylinositol 4,5-bisfosfat i plasmamembranet med nya fluorescerande Probes

Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

Hög precision FRET vid en-molekylnivå för biomolekylstrukturbestämning

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

Singel-molekyl Manipulation av G-quadruplexes av magnetisk pincett

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Kovalent immobilisering av proteiner för den enda molekyl kraft spektroskopin

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteom-wide kvantifiering av märkning homogenitet på nivån enda molekyl

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

Single-molekyl tracking mikroskopi-ett verktyg för att bestämma Diffusiva stater cytosoliska molekyler

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Produktion av dynein och Kinesin motor ensembler på DNA origami nanostrukturer för enkel molekyl observation

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy

OaAEP1-medierad enzymatisk syntes och immobilisering av polymeriserat protein för enmolekylkraftsspektroskopi

Chemical and bio-conjugation techniques have been developed rapidly in recent years and allow the building of protein polymers. However, a controlled ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Encellsanalys av transkriptionellt aktiva alleler med enmolekylig FISK

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

Göra exakta och exakta enmolekyliga FRET-mätningar med hjälp av SmfBox med öppen källkod

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...