Name: a neurite outgrowth assay and neurotoxicity assessment with human neural progenitor cell-derived neurons
Uploaded: 2020-08-06T15:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Neurite Outgrowth Assay and Neurotoxicity Assessment with Human Neural Progenitor Cell-Derived Neurons at JoVE.com

Denne forskning blev finansieret af NIMAD forskningstilskud (940714) tildelt MAF.

Etik Erklæring: Føtale prøver blev modtaget fra Fødselsdefekter Research Laboratory ved University of Washington i Seattle gennem et væv distributionsprogram støttet af National Institute of Health (NIH). Fødselsdefekter Research Laboratory opnået passende skriftligt informeret samtykke fra forældrene og indkøb af væv blev overvåget af Den Institutionelle Review Board ved University of Washington. Alt arbejdet blev udført med godkendelse af Human Subject Research Office ved University of Miami<sup class="xre...

<ol>
	<li>Sherman, S. P., Bang, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screen+for+compounds+that+modulate+neurite+growth+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+neurons.">High-throughput screen for compounds that modulate neurite growth of human induced pluripotent stem cell-derived neurons.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 11 (2), (2018).</li><li>Al-Ali, H., Beckerman, S. R., Bixby, J. L., Lemmon, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+axon+regeneration.">In vitro models of axon regeneration.</a> Experimental Neurology. 287, 423-434 (2017).</li><li>Kudo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+neurite+outgrowth+in+PC12+cells+treated+with+temperature-controlled+repeated+thermal+stimulation.">Induction of neurite outgrowth in PC12 cells treated with temperature-controlled repeated thermal stimulation.</a> PloS One. 10 (4), 0124024 (2015).</li><li>Higgins, S., Lee, J. S., Ha, L., Lim, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducing+neurite+outgrowth+by+mechanical+cell+stretch.">Inducing neurite outgrowth by mechanical cell stretch.</a> BioResearch Open Access. 2 (3), 212-216 (2013).</li><li>Muramatsu, R., Ueno, M., Yamashita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+regenerative+mechanisms+of+central+nervous+system+neurons.">Intrinsic regenerative mechanisms of central nervous system neurons.</a> Bioscience Trends. 3 (5), (2009).</li><li>Read, D. E., Herbert, K. R., Gorman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat+shock+enhances+NGF-induced+neurite+elongation+which+is+not+mediated+by+Hsp25+in+PC12+cells.">Heat shock enhances NGF-induced neurite elongation which is not mediated by Hsp25 in PC12 cells.</a> Brain Research. 1221, 14-23 (2008).</li><li>Finan, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioactive+Compound+Screen+for+Pharmacological+Enhancers+of+Apolipoprotein+E+in+Primary+Human+Astrocytes.">Bioactive Compound Screen for Pharmacological Enhancers of Apolipoprotein E in Primary Human Astrocytes.</a> Cell Chemical Biology. 23 (12), 1526-1538 (2016).</li><li>Magistri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+transcriptomic+analysis+of+astrocytes+differentiation+from+human+neural+progenitor+cells.">A comparative transcriptomic analysis of astrocytes differentiation from human neural progenitor cells.</a> European Journal of Neuroscience. 44 (10), 2858-2870 (2016).</li><li>Bez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurosphere+and+neurosphere-forming+cells:+morphological+and+ultrastructural+characterization.">Neurosphere and neurosphere-forming cells: morphological and ultrastructural characterization.</a> Brain Research. 993 (1-2), 18-29 (2003).</li><li>Grandjean, P., Landrigan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurobehavioural+effects+of+developmental+toxicity.">Neurobehavioural effects of developmental toxicity.</a> The Lancet Neurology. 13 (3), 330-338 (2014).</li><li>Finkbeiner, S., Frumkin, M., Kassner, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-based+screening:+extracting+meaning+from+complex+data.">Cell-based screening: extracting meaning from complex data.</a> Neuron. 86 (1), 160-174 (2015).</li><li>An, W. F., Tolliday, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-based+assays+for+high-throughput+screening.">Cell-based assays for high-throughput screening.</a> Molecular Biotechnology. 45 (2), 180-186 (2010).</li><li>Astashkina, A., Mann, B., Grainger, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+evaluation+of+in+vitro+cell+culture+models+for+high-throughput+drug+screening+and+toxicity.">A critical evaluation of in vitro cell culture models for high-throughput drug screening and toxicity.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 134 (1), 82-106 (2012).</li><li>Swinney, D. C., Anthony, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+were+new+medicines+discovered.">How were new medicines discovered.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10 (7), 507 (2011).</li><li>Ryan, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurite+outgrowth+in+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+neurons+as+a+high-throughput+screen+for+developmental+neurotoxicity+or+neurotoxicity.">Neurite outgrowth in human induced pluripotent stem cell-derived neurons as a high-throughput screen for developmental neurotoxicity or neurotoxicity.</a> Neurotoxicology. 53, 271-281 (2016).</li><li>Magistri, M., Velmeshev, D., Makhmutova, M., Faghihi, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomics+profiling+of+Alzheimer's+disease+reveal+neurovascular+defects,+altered+amyloid-&#946;+homeostasis,+and+deregulated+expression+of+long+noncoding+RNAs.">Transcriptomics profiling of Alzheimer's disease reveal neurovascular defects, altered amyloid-&#946; homeostasis, and deregulated expression of long noncoding RNAs.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 48 (3), 647-665 (2015).</li><li>Darbinyan, A., Kaminski, R., White, M. K., Darbinian, N., Khalili, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+propagation+of+primary+human+and+rodent+embryonic+neural+progenitor+cells+and+cortical+neurons.">Isolation and propagation of primary human and rodent embryonic neural progenitor cells and cortical neurons.</a> Neuronal Cell Culture. , 45-54 (2013).</li><li>Gil-Perot&#237;n, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+neural+stem+cells+from+the+subventricular+zone:+a+review+of+the+neurosphere+assay.">Adult neural stem cells from the subventricular zone: a review of the neurosphere assay.</a> The Anatomical Record. 296 (9), 1435-1452 (2013).</li><li>Ebert, A. D., McMillan, E. L., Svendsen, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating,+expanding,+and+infecting+human+and+rodent+fetal+neural+progenitor+cells.">Isolating, expanding, and infecting human and rodent fetal neural progenitor cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 6 (1), 2 (2008).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676 (2012).</li><li>Collins, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ+for+microscopy.">ImageJ for microscopy.</a> Biotechniques. 43 (1), 25-30 (2007).</li><li>Bagheri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDAC+Inhibitors+Induce+BDNF+Expression+and+Promote+Neurite+Outgrowth+in+Human+Neural+Progenitor+Cells-Derived+Neurons.">HDAC Inhibitors Induce BDNF Expression and Promote Neurite Outgrowth in Human Neural Progenitor Cells-Derived Neurons.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (5), 1109 (2019).</li><li>Sartor, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+BDNF+expression+and+memory+by+HDAC+inhibition+requires+BET+bromodomain+reader+proteins.">Enhancement of BDNF expression and memory by HDAC inhibition requires BET bromodomain reader proteins.</a> Journal of Neuroscience. 39 (4), 612-626 (2019).</li><li>Conde, C., C&#225;ceres, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+assembly,+organization+and+dynamics+in+axons+and+dendrites.">Microtubule assembly, organization and dynamics in axons and dendrites.</a> Nature Reviews Neuroscience. 10 (5), 319 (2009).</li><li>Schmitz, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+analysis+of+neuronal+morphology,+synapse+number+and+synaptic+recruitment.">Automated analysis of neuronal morphology, synapse number and synaptic recruitment.</a> Journal of Neuroscience Methods. 195 (2), 185-193 (2011).</li><li>Grandjean, P., Landrigan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+neurotoxicity+of+industrial+chemicals.">Developmental neurotoxicity of industrial chemicals.</a> The Lancet. 368 (9553), 2167-2178 (2006).</li><li>Dragunow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adult+human+brain+in+preclinical+drug+development.">The adult human brain in preclinical drug development.</a> Nature reviews Drug Discovery. 7 (8), 659 (2008).</li><li>Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+brain+in+a+dish:+the+promise+of+iPSC-derived+neurons.">The human brain in a dish: the promise of iPSC-derived neurons.</a> Cell. 145 (6), 831-834 (2011).</li><li>Pan, C., Kumar, C., Bohl, S., Klingmueller, U., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+proteomic+phenotyping+of+cell+lines+and+primary+cells+to+assess+preservation+of+cell+type-specific+functions.">Comparative proteomic phenotyping of cell lines and primary cells to assess preservation of cell type-specific functions.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 8 (3), 443-450 (2009).</li><li>Alge, C. S., Hauck, S. M., Priglinger, S. G., Kampik, A., Ueffing, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+protein+profiling+of+primary+versus+immortalized+human+RPE+cells+identifies+expression+patterns+associated+with+cytoskeletal+remodeling+and+cell+survival.">Differential protein profiling of primary versus immortalized human RPE cells identifies expression patterns associated with cytoskeletal remodeling and cell survival.</a> Journal of Proteome Research. 5 (4), 862-878 (2006).</li><li>Yeo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Embryonic+Stem+Cell-Derived+Neural+Lineages+as+In+Vitro+Models+for+Screening+the+Neuroprotective+Properties+of+Lignosus+rhinocerus+(Cooke)+Ryvarden.">Human Embryonic Stem Cell-Derived Neural Lineages as In Vitro Models for Screening the Neuroprotective Properties of Lignosus rhinocerus (Cooke) Ryvarden.</a> BioMed Research International. 2019, (2019).</li></ol>

Denne protokol er en af de få offentliggjorte papirer, der beskriver testen for neurite længde ved behandling med testforbindelser. Desuden beskriver vi, hvordan man bruger hNPC'er til en neurite outgrowth assay og neurotoxicity vurdering. Ved at udnytte denne neurite outgrowth assay og neurotoxicity vurdering på hNPCs-afledte neuroner, det neurogene potentiale af en kategori af epigenetiske små-molekyle forbindelser, HDAC hæmmere, i inducerende neurite udvækst er påvist22. Endvidere, i et ...

Neurite vækst er en proces, der er grundlæggende for dannelsen af det neuronale netværk og nerve regenerering1,2. Efter en skade, neurite udvækst spiller en central rolle i regenerering af nervesystemet. Neurite udvækst er også et vigtigt element i den ekstracellulære signalering i inducerende neuronal regenerative aktiviteter for at forbedre resultaterne for neurodegenerative lidelser og neuronal skade3,,4,5,6.
Ved at opretholde deres differentieringspotentiale i produktionen af forskellige neurale slægter, menneskelige neurale stamceller (hNPC'er) kunne give en model system for undersøgelser af centralnervesystemet (CNS) funktion og udvikling7,8,9. Høj translationel potentiale og fysiologisk relevans af hNPC'er som en primær human celle model giver en betydelig fordel i neurite udvækst-relaterede drug discovery screenings. Vedligeholdelse og skalering af primærcellemodellerne til analyser med høj kapacitet kan dog være tidskrævende og arbejdskrævende10,11,12,13.
Ud over anvendelsen af den præsenterede metode i neurite udvækstundersøgelser er neurotoksicitetsvurdering en anden anvendelse ved hjælp af hNPC-afledte neuroner. Der er tusindvis af kommercielle kemiske forbindelser, der enten ikke undersøges eller med dårligt forstået neurotoksicitet potentiale. Derfor, mere pålidelige og effektive screening eksperimenter til at vurdere, skelne, og rang forbindelser baseret på deres potentiale til at fremkalde udviklingsmæssige neurotoksicitet er i høj efterspørgsel14. Stigningen i prævalens og forekomst af neurologiske lidelser sammen med den overflod af uprøvede forbindelser i miljøet nødvendiggør udvikling af mere troværdige og effektive eksperimenter til at identificere farlige miljøforbindelser, der kan udgøre neurotoksicitet15.
Den præsenterede metode heri kan udnyttes til at screene for evne til forbindelser til at fremkalde neurite udvækst og neurotoksicitet ved at drage fordel af den menneskelige neurale stamfader celle-afledte neuroner, en celle model tæt repræsenterer den menneskelige biologi.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-well Glass Chamber Slides</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PEZGS0816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R37117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#946;-Tubulin III</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>MA1-118X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>17504001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 - minus vitamin A</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>450-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G7572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolCell</td>
			<td>Corning</td>
			<td>432000</td>
			<td>Cell freezing containers ensuring standardized controlled-rate -1&#8451;/minute cell freezing in a -80&#8451; freezer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoStor CS10</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>7930</td>
			<td>Cryopreservation medium containing 10% DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>34869-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG6015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>FB002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>450-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>L-alanyl-L-glutamine supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Serum</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>50062Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>375095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A92902-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L5501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM non-essential amino acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mFreSR</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>5854</td>
			<td>Serum-free cryopreservation medium designed for the cryopreservation of human embryonic and induced pluripotent stem cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 384-Well Polystyrene White Microplates</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>164610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>10010-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly&#8208;L&#8208;lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5899-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>P10144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Accutase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>Cell dissociation reagent containing proteolytic and collagenolytic enzymes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synaptophysin</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>MA5-14532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10708976001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a neurite outgrowth assay and neurotoxicity assessment with human neural progenitor cell-derived neurons

Neurite outgrowth assay og neurotoksicitet vurdering er to store undersøgelser, der kan udføres ved hjælp af den præsenterede metode heri. Denne protokol giver pålidelig analyse af neuronal morfologi sammen med kvantitative målinger af modifikationer på neurite længde og synaptisk protein lokalisering og overflod ved behandling med små molekyle forbindelser. Ud over anvendelsen af den præsenterede metode i neurite udvækstundersøgelser kan der foretages en neurotoksicitetsvurdering for at vurdere, skelne og rangordne kommercielle kemiske forbindelser baseret på deres potentielle udviklingsmæssige neurotoksicitetseffekt.
Selv om cellelinjer er i dag udbredt i sammensatte screening assays i neurovidenskab, de ofte adskiller sig genetisk og fænotypisk fra deres væv oprindelse. Primære celler, på den anden side, opretholde vigtige markører og funktioner observeret in vivo. Derfor, på grund af oversættelsen potentiale og fysiologiske relevans, at disse celler kunne tilbyde neurite outgrowth assay og neurotoksicitet vurdering kan betydeligt drage fordel af at bruge humane neurale progenitor celler (hNPC' er) som den primære menneskelige celle model.
Den præsenterede metode heri kan bruges til at screene for evne til forbindelser til at fremkalde neurite udvækst og neurotoksicitet ved at drage fordel af den menneskelige neurale stamfader celle-afledte neuroner, en celle model tæt repræsenterer den menneskelige biologi.

Den protokol , der præsenteres i manuskriptet , er med succes blevet anvendt i to nyligt offentliggjortedokumenter 22,23. Figur 3 viser brugen af hNPC'er-afledte neuroner til at undersøge effekten af HDAC-hæmmere som epigenetiske forbindelser på forlængelsen af neurites som en markør for neurite udvækst og efterfølgende neurogen evne af små molekyleforbindelser.
Endvidere vurderes neurotoksicitete...

Watch this Scientific Journal Video about A Neurite Outgrowth Assay and Neurotoxicity Assessment with Human Neural Progenitor Cell-Derived Neurons at JoVE.com

A Neurite Outgrowth Assay and Neurotoxicity Assessment with Human Neural Progenitor Cell-Derived Neurons

Den fremlagte protokol beskriver en metode til en neurite outgrowth assay og neurotoksicitet vurdering af små molekyle forbindelser.

En Neurite Outgrowth Assay og Neurotoxicity Vurdering med Human Neural Progenitor Cell-Derived Neuroner

Neurite outgrowth assay and neurotoxicity assessment are two major studies that can be performed using the presented method herein. This protocol provides ...

Den præsenterede protokol, der beskriver neurite outgrowth assay, der er yderst relevant for human biologi og neurotoksicitet vurdering af et lille molekyle forbindelser. Høj translationelt potentiale og fysiologisk relevans af menneskelige neurale progenitor celler som den primære menneskelige celle model giver en betydelig fordel i neurite udvækst-relaterede lægemiddel opdagelse screening og neurotoksicitet vurdering. Ved hjælp af den præsenterede protokol kan humane inducerede pluripotente stamceller og humane embryonale stamceller afledte neuroner også anvendes som til alternative cellekilder til neurite outgrowth assay og neurotoksicitet vurdering.Begynd med at indsamle medierne med flydende neurosfærer og overføre det til en 50 milliliter konisk rør. Centrifuge røret ved 300 til 400 gange g i tre minutter. Derefter forsigtigt aspirere supernatant.og resuspenderede kuglerne i 500 mikroliter af optøet celle dissociation reagens. Inkuber kuglerne ved 37 grader Celsius i fem til 15 minutter. Derefter tilsættes fem til 10 milliliter forvarmte kulturmedier og centrifuge røret ved 300 til 400 gange g i fem minutter for at sedimentere neurosfærerne.Inspirer supernatanten og tilsæt to milliliter kulturelle medier pipettering op og ned med en 1000 mikroliterpipette, indtil neurosfærerne danner en enkelt cellesuspension. Efter optælling af cellerne, tilføje to til 3 millioner celler til en T25 kolbe i 10 milliliter af kultur medier. Udskift halvdelen af kulturmediet hver tredje dag.Brug kommercielt tilgængelige kryopræservering medium til at fryse cellerne. Overfør neurosfærerne til et 50 milliliterrør og lad kuglerne slå sig ned i bunden. Brug en 200 eller 1000 mikroliter pipettespids til at overføre de store neurosfærer til et nyt 50 milliliterrør, før de passerer.Centrifuge de resterende neurosfærer ved 300 til 400 gange g i tre minutter og forsigtigt fjerne supernatant. Opslæm op til 1000 kugler i en milliliter kryopræserveringsregense og overfør det til et kryorør. Opbevar røret natten over på minus 80 grader Celsius, og flyt det derefter til flydende nitrogen til langtidsopbevaring.For at måle neuronal udvækst skal du åbne billedet i Fiji og vælge Analysér, Værktøjer og ROI Manager. Højreklik på det femte ikon i værktøjslinjen Lige og skift til Frihåndslinje. Du kan også dobbeltklikke på det samme ikon for at ændre linjebredden til 10.Derefter spore den længste neurite begynder nær cellekroppen og strækker sig til spidsen. Tryk på Control og T derefter F for at føje målingen til ROI Manager og fremhæve den målte neuron. Vælg alle tal i investeringsafkastet.Klik på Målér, og kopiér og indsæt derefter målingerne i et regneark. Hvis du vil måle fluorescensintensiteten af markerede celler, skal du klikke på det fjerde ikon på værktøjslinjen Frihåndsmarke markeringer og tegne cellens form. Klik på Analysér og angiv målinger.Sørg derefter for, at Område, Middelgråværdi, Min max grå værdi og Integreret tæthed er valgt. Klik på Analysér og målér. Markér området ud for cellen som baggrund.Og klik derefter analysere og måle. Markér alle måledata, og kopiér, indsæt dem i et regneark. At pels pladen tilføje 30 mikroliter af poly-L-lysin i hver brønd af en 384-brønd plade og inkubere pladen ved stuetemperatur i en time.Vask det to gange med PBS og lad det tørre i ca. 30 minutter. Tilføj 30 mikroliter af laminine til hver brønd, derefter inkubere pladen ved 37 grader Celsius i to timer. Gentag vaskene med PBS og fortsæt med at plating cellerne.Tilføj 20,000 encellede neurosfærer i 25 mikroliter af differentieringsmedier til hver brønd af 384-brøndpladen og inkuber pladen ved 37 grader Celsius i fem dage. Hight precision pipettering færdigheder er nødvendige for plating det nøjagtige antal neurosfærer, der er alle adskilt i enkelte celler. Derfor anbefales det at differentiere neurosfærerne til neuroner før plating for at opnå mere reproducerbare resultater.Efter inkubationen tilsættes fem mikroliter testforbindelse til hver brønd ved seks gange den ønskede koncentration. Og inkuber cellerne i yderligere 24 timer. For at udføre cellens levedygtighed essay, tilføje 30 mikroliter af selvlysende reagens til hver brønd.Og lad pladen være på en shaker i to minutter. Centrifuge pladen ved 300 til 400 gange g i 30 sekunder, derefter inkubere pladen ved stuetemperatur i 10 minutter, beskytte den mod lys. Efter inkubationen måles luminescensen på en mikropladelæser.De humane neurale progenitor celle-afledte neuroner blev brugt til at undersøge effekten af HDAC-hæmmere som små molekyle epigene forbindelser til udvidelse af neurites og efterfølgende neurogene evne til små molekyleforbindelser. HDAC-hæmmernes neurotoksicitet blev også vurderet efter at have differentieret de neurale progenitorceller i 384-brøndsplader, hvilket viste muligheden for at skalere protokollen for et højere antal forbindelser. I en anden undersøgelse blev måling af den neuronale cellefluorescensintensitet anvendt til at kvantificere forekomsten af histon H4-lysin fem acetylation som en histonmarkør efter behandling af neuronerne med epigenetiske modifikatorforbindelser.Derudover, denne protokol er blevet brugt til at visualisere en præ-synaptisk protein, synaptophysin, at kontrollere for mulige synaptogeniske virkninger af små molekyle forbindelser. Ved hjælp af den præsenterede metode kan neurites tal, intensitet, længde og bredde sammen med synaptiske egenskaber, herunder præ- og postsynaptiske proteinmodifikationer, måles pålideligt.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells

Direkte Induktion af humane neurale stamceller fra perifert blod hæmatopoietiske stamceller

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to ...

Isolation of Neural Stem/Progenitor Cells from the Periventricular Region of the Adult Rat and Human Spinal Cord

Isolering af neurale stam- / progenitorceller fra Periventricular Region Adult Rat and Human Spinal Cord

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of ...

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

Dyrkning Menneskelig pluripotente og neurale stamceller i en Lukket Cell Culture System for Basic og Prækliniske Research

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

Epikardial Udvækst Kultur Assay og<em&gt; Ex vivo</em&gt; Vurdering af Epikardial-afledt cellemigration

A single layer of epicardial cells lines the heart, providing paracrine factors that stimulate cardiomyocyte proliferation and directly contributing ...

Maturation of Human Stem Cell-derived Cardiomyocytes in Biowires Using Electrical Stimulation

Modning af humane stamceller afledt Cardiomyocytter i Biowires Brug af elektrisk stimulering

Human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hPSC-CMs) have been a promising cell source and have thus encouraged the investigation of their ...

Protocol for the Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Mixed Cultures of Neurons and Glia for Neurotoxicity Testing

Protokol for differentieringen af ​​humane inducerede pluripotente stamceller i blandede kulturer af neuroner og glia til neurotoksicitetstestning

Human pluripotent stem cells can differentiate into various cell types that can be applied to human-based in vitro toxicity assays. One major advantage is ...

Three-dimensional Rendering and Analysis of Immunolabeled, Clarified Human Placental Villous Vascular Networks

Tre-dimensionelle gengivelse og analyse af Immunolabeled, klarere menneskelige placenta villøs vaskulære netværk

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocyte-like Cells for Drug Discovery

Ved hjælp af menneskelige induceret pluripotente stamceller-afledt hepatocyt-lignende celler for Drug Discovery

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn ...

A Familial Hypercholesterolemia Human Liver Chimeric Mouse Model Using Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocytes

En familiær hyperkolesterolæmi menneskelige lever kimære musen Model ved hjælp af induceret pluripotente stamceller-afledt hepatocytter

Familial hypercholesterolemia (FH) is mostly caused by low-density lipoprotein receptor (LDLR) mutations and results in an increased risk of early-onset ...

Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Synaptic dataloger modellering med 3D Cocultures astrocytter og neuroner fra humane pluripotente stamceller

A barrier to our understanding of how various cell types and signals contribute to synaptic circuit function is the lack of relevant models for studying ...