6.4K Views
•
07:02 min
•
October 6th, 2020
DOI :
October 6th, 2020
•0:04
Introduction
0:34
Control and High Carbon Dioxide (CO2) Water
1:56
Fish Preparation
3:54
Electrophysiological Recording
5:18
Results: Representative Multi-Unit and Concentration Response Curves
6:25
Conclusion
Transcript
Dette er den mest robuste og følsomme metoden for å vurdere olfaktorisk følsomhet hos marin fisk, da den registrerer et rent sensorisk signal før cns behandler. De viktigste fordelene med denne teknikken er dens følsomhet og at den enkelt kan overføres til en annen art fra et annet miljø uavhengig av ekstern saltholdighet. For å forberede kontrollvannet, samle en liter kullfiltrert sjøvann og bruk en pH-sonde til å sjekke pH.
PH bør være rundt 8.2. Hvis det ikke er det, boble sjøvannet med atmosfærisk luft til en pH på 8,2 er nådd. Deretter bruker du en alkalitetstitreator for å måle alkaliteten til vannet, og deretter måle vanntemperaturen og saltholdigheten.
For å forberede høyt karbondioksidvann, filtrer en liter sjøvann gjennom partikkelaktiverte kullfiltre før boblende med karbondioksid til ønsket pH er nådd. Bruk en pH-probe til å kontrollere pH-en, som skal være rundt 7,7, og bruk deretter en alkalitetstitreator for å måle alkaliteten til vannet og måle vanntemperaturen og saltholdigheten. For å bestemme karbondioksidtrykket i både kontroll- og høyt karbondioksidvann, åpne et program som er utformet for å beregne karbondioksidparametere i vann og tilsett vannsliniteten, temperaturen, trykket, total alkalitet og pH-verdier i inngangsvinduet.
Velg deretter konstanter, vekter og enheter, og klikk prosessen for å bestemme karbondioksidtrykket. Etter å ha bekreftet et passende nivå av sedasjon ved mangel på respons på haleklemmen, plasser den bedøvede fisken på en putestøtte tilpasset modellen og plasser et silikonrør i riktig størrelse i fiskens munn. Røret er koblet til en nedsenkbar pumpe og et reservoar av bedøvelse som inneholder luftet sjøvann og vann pumpes over gjellene i en ca. 100 milliliter per minutt per kilo hastighet.
Deretter setter du inn en jordingspinne i flankemuskelen og kobler pinnen til hodet scenen av forsterkeren. Dekk fisken med fuktig klut med bare hodet eksponert og plasser røret med stimulansleveringssystemet i neseboret. For å eksponere olfaktoriske nerver, bruk en drill og et dissekerende mikroskop for å fjerne huden og beinet i skallen mellom øynene.
Når du bruker en sjøbrasme, bruk en sirkelsag til å fjerne den delen av skallen rett over øynene for å bare bakre for øynene og bruke boret til å fjerne beinet mellom øynene. Når tilstrekkelig bein er ryddet, bruk fine tang for å fjerne fett og bindevev overliggende olfaktoriske nerver uten å skade nerver eller kar. Rengjør elektrodene før bruk ved å koble dem til den negative stangen på en tre volts DC-kilde og plassere spissen i fysiologisk saltvann i 20 til 30 sekunder.
En jevn strøm av små bobler bør sees kommer fra spissen. Koble parylenbelagte wolframelektroder til hodestadiet på en vekselstrøm vekselstrømforsterker. Når olfaktoriske nerver har blitt utsatt, bruk mikromanipulatorer til å sette elektrodene inn i riktig olfaktorisk nerve i en posisjon som gir maksimal respons på standarden og minimal respons på det tomme.
Forutsatt at disseksjonen har gått greit, er det kritiske trinnet å få elektrodene i riktig posisjon. Dette kan ta tid og innebærer en viss grad av prøving og feiling. For å oppnå elektrofysiologiske avlesninger, bruk en magnetdrevet treveisventil for å sette opp et stimulansleveringssystem for å tillate rask bytte fra rent bakgrunnsvann til stimulans som inneholder vann og koble det vanlige uttaket til røret som bærer vann til olfaktorisk rosett.
Plasser den ene linjen i bakgrunnen sjøvann og den andre i testløsningen. Koble ventildriveren til utløseren av en analog digital omformer og konfigurer programvaren for å starte opptaket ved utløserhendelsen og fortsette i en forhåndsbestemt periode. For å kontrollere stabiliteten til preparatet, gjentar og måler du gjentatte ganger amplituden til den integrerte responsen gjentatte ganger med standarden, slik at det kan gå ett minutt mellom påfølgende stimuli.
Deretter registrerer du olfaktoriske nerveresponser på aminosyrer i kontroll sjøvann, og la ett minutt gå mellom påfølgende stimuli, og registrer deretter responsen til en ganger 10 til den negative tredje molar serin i en kontroll vann tom løsning. Deretter registrerer du olfaktorisk nerverespons på aminosyrer i høyt karbondioksid sjøvann. Responsen på en høy karbondioksid vann blank løsning og responsen på en ganger 10 til den negative tredje molar serine i en kontroll vann tom løsning.
Her vises typiske svar på positive og negative kontrollstimuli registrert fra olfaktorisk nerve av en sjøbrasme. Innen omtrent ett sekund av stimulanssøknaden kan en rask økning i aktiviteten observeres etterfulgt av en overnattingsperiode mens stimulansen fortsatt er tilstede og en retur til baselineaktivitet når stimulansen er avsluttet. I motsetning fremkaller en tom stimulans liten eller ingen respons.
I denne typiske konsentrasjonsresponskurven kan det observeres at økende konsentrasjoner av lukt kan fremkalle stadig større økninger i aktiviteten og derfor amplituden til de integrerte svarene. Plotting av normaliserte data og tilsvarende lineær regresjon tillater estimering av terskelen for deteksjon for konsentrasjonsresponser av hvert dyr eller en gruppe dyr. Sigmoidal konsentrasjonsresponskurver kan plottes halv logaritmisk, slik at beregning av luktkonsentrasjonen som fremkaller ved 50% maksimal respons.
Det er viktig å holde fisken så sunn som mulig. For eksempel må du sørge for at gjellene er tilstrekkelig vannet og at olfaktoriske epitel holdes våt under opptaket. Et av våre mål er å spore nevrale veier i hjernen til der sensorisk informasjon er videresendt.
Ekstracellulær multi-enhet opptak fra olfactory nerve er en følsom, robust og reproduserbar metode for å vurdere olfaktorisk følsomhet i marine fisk. Den registrerer primære sensoriske innganger og er uavhengig av ekstern saltholdighet.
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved