Name: extracellular multi-unit recording from the olfactory nerve of teleosts
Uploaded: 2020-10-06T12:30:00
Duration: 7 min 2 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extracellular Multi-Unit Recording from the Olfactory Nerve of Teleosts at JoVE.com

Работа в лаборатории авторов поддерживается Funda'o para a Ci'ncia e Tecnologia (FCT), Португалия, проектами PTDC/BIA-BMA/30262/2017 и UID/Multi/04326/2019 и контрактной программой DL57/2016/CP1361/CT0041 к ЗВ.

Авторов нечего раскрывать.

Текущее исследование описывает использование многофункциональных (внеклеточных) записи из обонятельного нерва морского волокна(S. aurata), морской спарид большое значение в аквакультуре. Однако этот экспериментальный подход может широко применяться к другим рыбам; хирургическое вмешательство и точное размещение электродов будет явно зависеть от анатомии обонятельной системы, а выбор и концентрация анестезии может зависеть от изучаемого вида. Например, обонятельный нерв золотой рыбки(Carassius auratus)короток; в этом случае, запись ЭЭГ из обонятельной лампы было бы проще. Выбор одоранта может также зависеть, в некоторой степени, от вида. В текущем исследовании использовались аминокислоты. Насколько известно авторам, все исследуемые на сегодняшний день виды рыб имеют обонятельную чувствительность каминокислотам 1,,18. Эта чувствительность была вовлечена в различные процессы, такие как расположение пищи, химическая связь и признание натальных вод19,,20,,21,,22,,23. Тем не менее, чувствительность различных видов, в широком смысле, довольно похожи и не зависят от образа жизни или среды обитания. Они также являются четко определенными молекулами и дешево и легко доступны. Эти причины делают их идеальными тестовыми стимулами для исследований по олфакции у рыб, особенно тех, которые изучают влияние антропогенных нарушений (например, подкисления или загрязнения), где результаты можно легко сравнить междувидами 24.
В зависимости от вида, о котором идет речь, подготовка к многоразовой записи может оставаться стабильной в течение нескольких часов; амплитуда ответа на внутренний стандарт (10-3 M L-серин в текущем исследовании) не должна варьироваться более чем на 10% между последовательными тестами. Любое значительное отклонение от этого правила может быть связано с: i) движение рыбы, и, следовательно, перемещение электродов и / или нос-трубки; ii) загрязнение воды, например, при контакте с руками экспериментатора (особенно если более низкие концентрации данного одоранта дают более крупные реакции, чем более высокие концентрации); или (iii) ухудшение состояния здоровья препарата). В случае i) рыба должна быть проверена на наличие перемещенной; если это так, переместить его, и добавить больше анестезии в воду и / или дать еще одну дозу триэтиодида галламина. Разрешить 5 мин и повторно протестировать стандарт. Если ответ еще меньше, то перепозиционировать электроды и / или нос трубки до тех пор, пока достаточно большой ответ записывается. В случае (ii), просто переделать свежие серии разбавления одоранта, используя чистую стеклянную посуду и воду. В случае (iii), убедитесь, что поток воды над жабры рыбы является адекватным, что вода течет над жабры (т.е., выходя через оперкулу, а не рот), и вода хорошо газированные. Различные виды рыб имеют различные температурные предпочтения; обеспечить, чтобы температура в лаборатории (и воды в контакте с рыбой) как можно ближе к температуре, что рыба хранится на насколько это возможно. Убедитесь также, что рыба не подчеркнул, и избежать перемещения их (даже из одного резервуара в другой) по крайней мере за неделю до записи. Электрический шум, конечно, бич жизни электрофизиолога; однако нынешняя статья не является подходящим средством для обсуждения того, как преодолеть/уменьшить это. Тем не менее, "Axon Guide" (доступно свободно в качестве PDF для скачивания с веб-сайта производителя) является источником практических советов по минимизации шума. После того, как большой, стабильный ответ вызывается стандартным стимулом, и концентрация серии дает концентрациозависимых увеличение амплитуды, с минимальной реакцией на пустой, запись ответов на тест стимулы могут начаться. Некоторые авторы дают тот же стимул три раза, и вычислить арифметическое среднее для последующего анализа данных. Тем не менее, это технические репликации, и этот подход увеличит время записи сессии занимает в три раза. Нынешние авторы предпочитают один раз протестировать данный одорант, но всегда являются частью кривой реакции на концентрацию. Это не только позволяет вычислить порог обнаружения или EC50 (как описано), но и гарантирует, что концентрации, близкие к тем, что рыба будет испытывать в своей природной среде проверяются (это не всегда известно). Кроме того, любые выбросы ответы, в связи с загрязнением, например, легче обнаружить; они могут быть повторены с помощью свежеприготовленного образца, если это необходимо.
Многоразовая запись из обонятельного нерва может быть инвазивной, но она более чувствительна, чем EOG призаписи в морской воде 7, так как она не зависит от внешней солености. Поэтому он может быть использован для оценки обонятельной чувствительности к запахам, таким как кальций и натрий, изменения в концентрациях которых также влияют на проводимость и, следовательно,напряжение, записанное 15. В качестве оценки количества ОРН, реагирующих на данный запах (т.е. потенциалы действия, перемещающиеся по аксонам ORN от обонятельного эпителия до лампочки), он представляет собой необработанный, необработанный сигнал (начальная обработка обонятельного ввода начинается в луковицах). Таким образом, это лучший параметр для оценки прямого воздействия загрязняющих веществ, таких как тяжелые металлы, и изменения окружающей среды, такие как рН, на обонятельную систему, чем EOG илиЭЭГ 24,25. Запись из обонятельной лампы в морской воде с высоким PCO2 (и, следовательно, низкий рН) могут быть затронуты центральным воздействием рН на нейронной обработки; «Теория рецепторовГАМК» подкисления океана 26, в результате чего сокращение рН воды вызывает перераспределение Cl- и HCO3- ион в CSF и последующий сдвиг ГАМК активации от ингибитора (гиперполяризации) к возбуждающей (деполяризации). Кроме того, в таких исследованиях важно оценить воздействие подкисления или загрязняющих веществ с использованием концентраций одорантов, аналогичных тем, с которыми рыба может столкнуться в своей природной среде. Для аминокислот, это в нано до микромолярского диапазона27,28,29; близко к порогу обнаружения этих соединений урыб 1,,18. Оценка порога обнаружения данного запаха может дать некоторое представление о важности и/или биологической роли обонятельной чувствительности. Например, морской минога(Petromyzon marinus) имеет высокую обонятельную чувствительность к специфическим желчным кислотам, высвобождаемым личинками до порога 10-13 M30; эта чувствительность позволяет взрослым найти и определить подходящие нерестилища, и, следовательно, выступать в качестве миграционного феромона на большие расстояния. Аналогичным образом, спелые самки морского минога имеют высокую обонятельную чувствительность к спермину(порог 10 -14 M), полиамин выпущен в милт самцов, который затем привлекает их в гнезда сперматозоидов мужчин31. Другие рыбы также имеют обонятельнуючувствительность к полиаминам 32,,33,,34,,35,но не с достаточно низкими порогами обнаружения для поддержки аналогичной феромональной роли; вместо этого предлагается избегать разлагающейся рыбы. Тем не менее, при такой высокой обонятельной чувствительности, можно себе представить, что небольшое снижение чувствительности (т.е. увеличение порога), даже если амплитуда реакции резко не уменьшается, может вызвать серьезные проблемы длярыбы 24.
При построении полу-logarithmically, концентрация реакции кривых на запахи могут быть экспоненциальными, линейные или сигмоидные18. В случае аминокислот такие полулогаритмические кривые концентрации-реакции являются либо линейными (т.е. логаритмическими), сигмоидными, либо силовымифункциями 7. То, что не наблюдается насыщения реакции (т.е. нет плато в кривой концентрации реакции, даже при над-экологических концентрациях), вероятно, связано с несколькими рецепторами, связывающимися с отдельными аминокислотами, в зависимости от их концентрации, а не каждой аминокислотой, связывающейся с конкретным рецептором; как концентрация данной аминокислоты увеличивается, больше рецепторов способны связать его и, следовательно, реагировать. Тем не менее, рыба может различать смеси аминокислот36,,37,,38,,39; это, вероятно, из-за комбинаторных моделей активности, вызванных в обонятельных луковиц12,40; аксоны всех ORNs, выражают тот же белок рецепторов прекратить в том же glomeruli в обонятельных луковиц41,42, и одна аминокислота может активировать более одного glomerulus.
Тем не менее, высокоспецифические одоранты, такие как феромоны, могут вызывать сигмоидные или квазигимоидные кривыеконцентрации реакции 43,44. Вывод, хотя и не эмпирически протестированы, является то, что эти обонятельные ответы из-за весьма специфических рецепторов, которые связывают молекулы феромона и немного другое. Таким образом, выше данной концентрации, все рецепторы заняты, и дальнейшее увеличение не вызовет никаких дальнейших реакций в других ORNs. Таким образом, эти данные могут быть установлены на трех параметров Хилл участка, и максимальный ответ, EC50 и Хиллсо-эффективных могут быть рассчитаны 15,45,46. Это может дать ценную информацию, такую как кажущееся сродство и явное число рецепторов, которые линейные или экспоненциальные кривые реакции концентрации не могут дать.

Рыбы в значительной степени полагаются на olfaction для многих аспектов их жизни, включая поиск пищи, избегая хищников, оценки потенциальных товарищейи миграции, среди прочего 1,2,3. Поэтому, оценивая обонятельную чувствительность у рыб (что они пахнут? Насколько они чувствительны к этим соединениям?) имеет жизненно важное значение для полного понимания этих процессов. Кроме того, антропогенное воздействие на окружающую среду, такое как подкисление океана и загрязнение окружающей среды, может иметь глубокие последствия для обонятельной системы, даже на сублетных уровнях, потому что она обязательно находится в непосредственном контакте с окружающейводой 4. В виво электрофизиология является экспериментальным подходом выбора для оценки обонятельной чувствительности у рыб. Доступны три основных метода: электро-олфактограмма (EOG), электроэнцефалограмма (ЭЭГ), записанная из обонятельной лампы, и многоа блоке записи из обонятельногонерва 5.
EOG является наиболее широко используемым из этих трех6. Это прямой ток (DC) полевой потенциал, записанный выше обонятельного эпителия и, как полагают, подытожил генератор потенциалов этих обонятельных рецепторов нейронов (ORNs) в ответ на данный запах. Однако, как записано в воде, а не внутри рыбы, амплитуда реакции зависит не только от сигнала, генерируемого рыбой, но и от проводимости окружающей воды; чем выше проводимость (или чем ниже сопротивление), тем ниже будет амплитуда. Это может означать, что EOG является менее чувствительным методом в морской воде, чем преснаявода 7.
ЭЭГ, записанный из обонятельной луковицы, также широко используется в исследовании ольфакции у рыб. Тем не менее, обонятельная лампа является центром обработки первого порядка для обонятельного сенсорного ввода8; он высоко организован в гломерули, и, следовательно, записанный ответ сильно зависит от положения записывающих электродов. Например, вход от ORNs обнаружения аминокислот обрабатывается glomeruli в боковой области обонятельных луковиц, в то время как из конспецифических полученных химических веществ направлен в медиальнойобласти 9,10,11,12. Феромональный вход может быть направлен на высоко локализованный гломерули в обонятельной лампе. В зависимости также от анатомии вида, о котором идет речь, идеальное положение записи для данного запаха не может быть легко доступны.
Многодиа блоке записи от обонятельного нерва обходит основные проблемы с EOG и ЭЭГ, изложенные выше. Как он записывает действия потенциалов, проходящих вниз аксонов ORNs от эпителия к лампе, это основной сенсорный сигнал. И так как это записано внутри рыбы, амплитуда реакции не зависит от внешней солености. Тем не менее, конечно, у него есть некоторые недостатки. Во-первых, в зависимости от анатомии вида, требуется более обширная операция, чтобы разоблачить обонятельный нерв, чем для EOG. Во-вторых, поскольку сигнал меньше EOG, он требует чуть более сложного и, следовательно, дорогостоящего оборудования. Общее описание других экспериментальных подходов дается Джоном Каприо5. Цель этой статьи состоит в том, чтобы изложить, как записывать внеклеточные многофункциональные реакции от обонятельного нерва морского волокна (Sparus aurata) in vivo к аминокислотным запахам в качестве примера этого метода, и как определить и преодолеть некоторые из наиболее распространенных проблем, с которыми сталкиваются в таком эксперименте.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AC pre-amplifier</td>
			<td>Digitimer Ltd (Welwyn Garden City, UK)</td>
			<td>NL104</td>
			<td>Neurolog pre-amplifier specifically designed for this type of recording.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digidata</td>
			<td>Molecular Devices, LLC. (San Jose, CA, USA)</td>
			<td>1440A</td>
			<td>Analogue-digital converter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMG Integrator</td>
			<td>Digitimer Ltd (Welwyn Garden City, UK)</td>
			<td>NL703</td>
			<td>Leaky&#39; electrical integrator to integrate raw activity of the nerve.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faraday cage</td>
			<td>Made in-house</td>
			<td></td>
			<td>To reduce electrical noise.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter</td>
			<td>Digitimer Ltd (Welwyn Garden City, UK)</td>
			<td>NL125/6</td>
			<td>Filter module for electrophysiological recording.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gallamine triethiodide</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Portugal)</td>
			<td>G8134</td>
			<td>Neuromuscular blocker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Portugal)</td>
			<td>G3126</td>
			<td>Amino acid used as odorant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-leucine</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Portugal)</td>
			<td>L80000</td>
			<td>Amino acid used as odorant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-serine</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Portugal)</td>
			<td>S4500</td>
			<td>Amino acid used as odorant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metalic base-plate</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td>Provides base for micro-manipulators.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-hematocrit tubes</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td>To position water supply to the olfactory epithelium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-manipulators</td>
			<td>Narishige International Ltd (London, UK)</td>
			<td>M-152</td>
			<td>Position electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS222 (ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate salt)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Portugal)</td>
			<td>E10505</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH probe</td>
			<td>Hanna instruments (P&#243;voa de Varzim, Portugal)</td>
			<td>HI12302</td>
			<td>Probe to measure pH of water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refractometer</td>
			<td>Hanna instruments (P&#243;voa de Varzim, Portugal)</td>
			<td>HI96822</td>
			<td>Refractometer to measure water salinity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Portugal)</td>
			<td>746398</td>
			<td>For saline solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solenoid valves</td>
			<td>The Lee Co. (Essex, CT, USA)</td>
			<td>LFAA1201618H</td>
			<td>For switching between background water and stimuus solutions (no longer available)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo-microscope</td>
			<td>Zeiss, Leica, Olympus</td>
			<td>Any suitable model.</td>
			<td>For dissection and placement of electrodes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titrator</td>
			<td>Hanna instruments (P&#243;voa de Varzim, Portugal)</td>
			<td>HI84531</td>
			<td>Titrator to measure water alkalinity, pH and temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten micro-electrodes 0.1 M&#937;</td>
			<td>World Precision Instruments (Hitchin, UK)</td>
			<td>TM31A10</td>
			<td>Extracellular electrodes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valve Driver</td>
			<td>Made in-house</td>
			<td></td>
			<td>12 V DC source for operating solenoid valves.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water pump (submersible)</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td>To supply anesthetic-containing water to the gills of the fish.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extracellular multi-unit recording from the olfactory nerve of teleosts

Недавние исследования показали, что подкисление океана влияет на обонятельное поведение рыб. Отчасти это может быть связано со снижением обонятельной чувствительности в воде с высоким содержанием PCO2/lowpH. Для оценки последствий подкисления океана, или обонятельной чувствительности в морских рыб в целом, мы предлагаем, чтобы внеклеточная многоступенчатая запись из обонятельного нерва является методом выбора. Несмотря на инвазивность, он чувствителен, надежн, воспроизводим и не зависит от внешней солености (в отличие, например, от электроолфактограммы. Кроме того, он записывает первичный сенсорный вход в ЦНС, до любой центральной обработки. Мы показываем, что этот метод может показать снижение обонятельной чувствительности, которая является временной и зависит от запаха, используя ряд аминокислот для построения кривых реакции концентрации и расчета пороговых значений обнаружения.

Типичная реакция на положительный контроль (10-3 M L-серин; Рисунок 4A)и отрицательный контроль (пустой; Рисунок 4B), записанный из обонятельного нерва морского брима, показан на рисунке 4. При наличии стимула (черный горизонтальный бар; в обонятельной полости, в контакте с обонятельным эпителием), обратите внимание на быстрое увеличение активности (отражается в восходящем отклонении интегрированного сигнала) до пика в течение примерно одной секунды начала стимула, а затем период размещения (в то время как стимул все еще присутствует), и возвращение к базовой активности, как только стимул закончился. Абсолютная амплитуда реакции сильно зависит от положения электрода; если зафиксирована низкая амплитуда реакции, попробуйте изменить положение электрода. Более медленный рост пиковой активности может быть связан с трубкой, несущей стимулосодержащую воду к обонятельному эпителию, помещенной слишком далеко от эпителия; попробуйте приблизить носовую трубку к (но не касаясь) эпителия. Обратите внимание, что, напротив, пробел вызывает мало или в отсутствие ответа. Значительный положительный ответ (т.е. увеличение активности) на пробел может свидетельствовать о загрязнении воды, используемой для разбавления стимулов; сделать свежие разбавления с чистой водой (и стеклянной посуды) должны решить эту проблему. В этом случае может потребоваться более тщательная очистка системы водоснабжения (включая фильтры с активированным углем). Отрицательный ответ (т.е. снижение активности) может свидетельствовать о незначительном изменении скорости потока при переключелении клапана из-за, например, закупорки клапана.
Типичная кривая концентрации реакции (построенная полулогаритмически), в данном случае L-лейцин (10-7 М до 10-3 М), показана на рисунке 5A. Обратите внимание, что увеличение концентраций одоранта вызывает все большее увеличение активности, а значит, и амплитуды интегрированных реакций. Сюжет нормализованных данных и их соответствующая линейная регрессия показаны на рисунке 5B. Предполагаемый порог обнаружения может быть x рассчитан из значения x, когда y 0.1761 (т.е. журнал1.5; где N No 0). В этом случае это значение составляет -7,48; то есть рассчитанный порог для L-лейцина в этой рыбе составляет 10-7,48 М. Экспонент q можно аналогичным образом оценить по линейной регрессии нормализованных данных на участке журнала; бревенчатый журналN и «логодорант» и константа. Затем этот фактор дает увеличение концентрации одорантов, необходимых для увеличения амплитуды реакции на одну единицу журнала; то есть, это оценка крутизны кривой концентрации реакции17. В этом примере, No 0,277 и No 3,61; таким образом, чтобы увеличить амплитуду отклика в десять раз (т.е. один бревенчатый блок; журнал10 и 1), концентрация стимулов должна быть увеличена в 103,61раза (4074 раза).
Типичная сигмоидная кривая концентрации реакции(рисунок 6A) при построении полу-логартмически, в данном случае L-глутамин, показан на рисунке 6B. Наблюдается аналогичное увеличение амплитуды реакции, зависящее от концентрации; однако, при более высоких концентрациях, это увеличение становится меньше, так что амплитуда отклика достигает максимума (Nмакс). Это позволяет приуставить данные к уравнению Хилла с тремя параметрами: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60962/60962eq1.jpg">
Таким образом,можно рассчитать EC 50 (концентрация одоранта, при которой вызывается 50% максимальный ответ) и со-эффективность Холма (мера крутизны наклона линейной части сигмоидной кривой).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60962/60962fig1.jpg"> Рисунок 1: Программное обеспечение скриншот, показывающий входное окно из программы CO2Calc. Выделенные (красные ящики) — поля, необходимые для расчета карбонатных параметров. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60962/60962fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60962/60962fig2.jpg"> Рисунок 2: Скриншот программного обеспечения, показывающий окно ввода для соответствующих констант, единиц и весов. Значения, показанные, рекомендуются для условий, при которых были проведены описанные эксперименты; они могут измениться. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60962/60962fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60962/60962fig3.jpg"> Рисунок 3: Программное обеспечение скриншот, показывающий результаты окна. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60962/60962fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60962/60962fig4.jpg"> Рисунок 4: Типичные многофункциональные реакции, записанные внеклеточно от обонятельного нерва морского брима in vivo в ответ на 10-3 M L-серин (A) и пустой (B). Верхние следы показывают интегрированные реакции и более низкие следы показывают сырцовой (нервный) сигнал. Стимулы применялись к обонятельному эпителию (горизонтальным прутьям). Обратите внимание на быстрый рост активности в течение 1 с воздействия, пик активности, а затем период размещения (в то время как запах по-прежнему доставляется в эпителий) и возвращение к базовым уровням, как только доставка запаха прекратилась. Мало или в отсутствие увеличения активности наблюдается после стимуляции с водой рассматривается так же, как разбавления пахантов, за исключением добавления любого запаха (пустой). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60962/60962fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60962/60962fig5.jpg"> Рисунок 5: Типичная кривая концентрации реакции для L-лейцина, записанная внеклеточно от обонятельного нерва in vivo. (A) По мере того как концентрация L-лейцина, применяемая к обонятельному эпителию (горизонтальным брусьям), увеличивается с 10-7 Мдо 10 -3 М, в нерве наблюдается сопутствующий рост активности. Верхние следы показывают интегрированные реакции и более низкие следы показывают сырцовой (нервный) сигнал. (B) Линейная регрессия (R2 и 0.97) нормализованных данных, построенных полулогаритмически для расчета порога обнаружения в качестве значения для журнала «L-leucine» прижурнале (N No 1.5) 0.1761 (т.е. где N No 0). В этом примере это значение составляет -7,48; Оценочный порог обнаружения L-лейцина в этой рыбе составляет, следовательно, 10-7,48 М. Пожалуйста, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60962/60962fig5large.jpg" target="_blank">нажмите здесь, чтобы просмотреть более широкую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60962/60962fig6.jpg"> Рисунок 6: Типичная кривая концентрации реакции на L-глутамин регистрируется внеклеточно от обонятельного нерва in vivo. (A) По мере того как концентрация L-глутамина, применяемого к обонятельному эпителию (горизонтальным прутьям), увеличивается с 10-7 Мдо 10 -3 М, в нерве наблюдается сопутствующий рост активности. Верхние следы показывают интегрированные реакции и более низкие следы показывают сырцовой (нервный) сигнал. (B)Полулогаритмический участок нормализованных данных, приспособленных к уравнению холмас тремя параметрами (R 2 и 0.99). Для этого примера, рассчитанный EC50 и 3.11 МКМ, и Холм со-эффективный 0,565). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60962/60962fig6large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Extracellular Multi-Unit Recording from the Olfactory Nerve of Teleosts at JoVE.com

Extracellular Multi-Unit Recording from the Olfactory Nerve of Teleosts

Внеклеточная многоразовая запись обонятельного нерва является чувствительным, надежным и воспроизводимым методом оценки обонятельной чувствительности морских рыб. Он записывает первичный сенсорный вход и не зависит от внешней солености.

Внеклеточная многоразовая запись с обонятельного нерва телеостов

Recent studies have shown that ocean acidification affects olfactory-driven behavior in fish. This may be due in part to a reduction in olfactory ...

Это наиболее надежный и чувствительный метод оценки обонятельной чувствительности морских рыб, поскольку он записывает чисто сенсорный сигнал до любой обработки ЦНС. Основными преимуществами этой техники являются ее чувствительность и то, что она может быть легко передана другому виду из другой среды, независимой от внешней солености. Чтобы подготовить контрольную воду, соберите один литр угольной фильтрованной морской воды и используйте рН зонд для проверки рН.РН должен быть около 8,2. Если это не так, пузырь морской воды с атмосферным воздухом, пока рН 8,2 не будет достигнута. Далее используйте щелочность титратор для измерения щелочности воды, а затем измерить температуру воды и соленость.Чтобы подготовить воду с высоким содержанием углекислого газа, фильтруем один литр морской воды через фильтры для инактивированного древесного угля, прежде чем пузыриться углекислым газом до достижения желаемого рН. Используйте рН зонд для проверки рН, который должен быть около 7,7, а затем использовать щелочности titrator для измерения щелочности воды и измерения температуры воды и солености. Для определения давления двуокиси углерода как в контрольной, так и в высокоуглеродной воде откройте программу, предназначенную для расчета параметров двуокиси углерода в воде и добавления солености воды, температуры, давления, общей щелочности и значений рН в входное окно.Затем выберите константы, весы и единицы, и нажмите процесс, чтобы определить давление углекислого газа. После подтверждения соответствующего уровня sedation из-за отсутствия реакции на щепотку хвоста, поместите анестезировалую рыбу на подушку поддержки настроены для модели и место соответствующим размером кремниевой трубки в рот рыбы. Трубка соединена с подводным насосом, а резервуар анестезии, содержащий газированную морскую воду и воду, перекачивается по жабрам примерно на 100 миллилитров в минуту в килограмм.Затем вставьте земляной штифт в фланговую мышцу и соедините штифт с головной стадией усилителя. Обложка рыбы влажной тканью только с головой подвергаются и положение трубки с системой доставки стимула в ноздрю. Чтобы разоблачить обонятельные нервы, используйте дрель и рассечение микроскопа, чтобы удалить кожу и кость черепа между глазами.При использовании морского леща, использовать циркулярную пилу, чтобы удалить часть черепа непосредственно над глазами, чтобы просто задний глаза и использовать дрель для удаления кости между глазами. После того, как достаточная кость была очищена, используйте тонкие миппы, чтобы удалить жир и соединительную ткань, переодейляющие обонятельные нервы, не повреждая нервы или сосуды. Очистите электроды перед использованием, подключив их к отрицательному полюсу трехвольтного источника постоянного тока и поместив наконечник в физиологический солевой раствор на 20-30 секунд.Устойчивый поток небольших пузырьков следует рассматривать исходя из кончика. Подключите электроды вольфрама с покрытием парилена к головной стадии преамплификатора переменного тока переменного тока. После того, как обонятельные нервы подверглись воздействию, используйте микро-манипуляторы, чтобы вставить электроды в соответствующий обонятельный нерв в положении, которое дает максимальную реакцию на стандарт и минимальную реакцию на пробел.При условии, что вскрытие прошло гладко, критическим шагом является получение электродов в правильное положение. Это может занять некоторое время и включает в себя определенную степень проб и ошибок. Для получения электрофизиологических показаний используйте солоноидный трехпрофильной клапан для настройки системы доставки стимулов, чтобы позволить быстрое переключение с чистой фоновой воды на стимул, содержащий воду, и подключить общую розетку к трубе, несущей воду, к обонятельной розетке.Поместите одну линию в фоновую морскую воду, а другую в тестовое решение. Подключите драйвер клапана к спусковому крючку аналогового цифрового преобразователь и настройте программное обеспечение, чтобы начать запись на триггерном событии и продолжить в течение определенного периода. Чтобы проверить стабильность препарата, неоднократно записывать и измерять амплитуду комплексного ответа неоднократно со стандартом позволяет одну минуту, чтобы прошло между последовательными стимулами.Далее, запись обонятельных нервных реакций на аминокислоты в управлении морской водой, и позволяют одну минуту, чтобы прошло между последовательными стимулами, а затем записать ответ на один раз 10 к отрицательной третий молир серин в контроле воды пустой раствор. Затем записывают обонятельные нервные реакции на аминокислоты в морской воде с высоким содержанием углекислого газа. Реакция на раствор с высоким содержанием углекислого газа и реакция на один раз 10 на отрицательный третий молярный серин в контрольном водном растворе.Здесь показаны типичные реакции на положительные и отрицательные контрольные стимулы, записанные с обонятельного нерва морского леща. В течение примерно одной секунды применения стимула, быстрый рост активности может наблюдаться следуют период размещения в то время как стимул все еще присутствует и возвращение к базовой активности, как только стимул закончился. В отличие от этого, пустой стимул вызывает мало или в отсутствие ответа.В этой типичной кривой реакции концентрации, можно за наблюдать, что увеличение концентрации запаха может вызвать все большее увеличение активности и, следовательно, амплитуды интегрированных ответов. Планирование нормализованных данных и соответствующая линейная регрессия позволяют оценить порог обнаружения реакций концентрации каждого животного или группы животных. Сигмоидные кривые реакции концентрации могут быть построены полу-logarithmically, что позволяет расчет концентрации одоранта, который вызывает на 50%максимальный ответ.Важно, чтобы рыба была как можно более здоровой. Например, убедитесь, что жабры адекватно орошаются и что обонятельный эпителий держится влажным во время записи. Одна из наших целей заключается в том, чтобы проследить нервные пути в головном мозге, где сенсорная информация передается.

Research

JoVE Journal

Environment

Determination of Microbial Extracellular Enzyme Activity in Waters, Soils, and Sediments using High Throughput Microplate Assays

Определение микробной внеклеточной ферментативной активности в вод, почв и донных отложений с использованием высокой пропускной MICROPLATE Анализы

Much of the nutrient cycling and carbon  processing in natural environments occurs through the activity of extracellular  enzymes released by ...

High-throughput Fluorometric Measurement of Potential Soil Extracellular Enzyme Activities

Высокая пропускная Флуорометрический Измерение Потенциал почвы внеклеточных активности ферментов

Microbes in soils and other environments produce extracellular enzymes to depolymerize and hydrolyze organic macromolecules so that they can be ...

A Fish-feeding Laboratory Bioassay to Assess the Antipredatory Activity of Secondary Metabolites from the Tissues of Marine Organisms

Рыба вскармливания Лаборатория биоанализа для оценки состояния Antipredatory активность вторичных метаболитов из тканей морских организмов

Marine chemical ecology is a young discipline, having emerged from the collaboration of natural products chemists and marine ecologists in the 1980s with ...

Automated Gel Size Selection to Improve the Quality of Next-generation Sequencing Libraries Prepared from Environmental Water Samples

Выбор размера Автоматизированная гель для улучшения качества секвенирования библиотек следующего поколения, полученного из окружающей среды проб воды

Next-generation sequencing of environmental samples can be challenging because of the variable DNA quantity and quality in these samples. High quality DNA ...

An Optimized Enrichment Technique for the Isolation of Arthrobacter Bacteriophage Species from Soil Sample Isolates

An Optimized Enrichment Technique for the Isolation of Arthrobacter Bacteriophage Species from Soil Sample Isolates

Оптимизированная Техника по обогащению для изоляции<em&gt; Arthrobacter</em&gt; Бактериофаг Виды из образца почвы изолирует

Bacteriophage isolation from environmental samples has been performed for decades using principles set forth by pioneers in microbiology. The isolation of ...

The Use of an Automated System (GreenFeed) to Monitor Enteric Methane and Carbon Dioxide Emissions from Ruminant Animals

The Use of an Automated System GreenFeed to Monitor Enteric Methane and Carbon Dioxide Emissions from Ruminant Animals

Использование автоматизированной системы (GreenFeed) для мониторинга Кишечная метана и диоксида углерода выбросов из жвачных животных

Ruminant animals (domesticated or wild) emit methane (CH4) through enteric fermentation in their digestive tract and from decomposition of manure during ...

Alternative Method of Removing Otoliths from Sturgeon

Альтернативный метод удаления Отолиты из осетрины

Extracting the otoliths (ear bones) from fish that have very thick skulls can be difficult and very time consuming. The common practice of making a ...

Extraction of Structural Extracellular Polymeric Substances from Aerobic Granular Sludge

Добыча структурной внеклеточной полимерных веществ из аэробного Гранулированный Sludge

To evaluate and develop methodologies for the extraction of gel-forming extracellular polymeric substances (EPS), EPS from aerobic granular sludge (AGS) ...

Evaluating the Effect of Environmental Chemicals on Honey Bee Development from the Individual to Colony Level

Оценка Влияние окружающей среды химических веществ на Honey Bee развития от личности до уровня колонии

The presence of pesticides in the beekeeping environment is one of the most serious problems that impacts the life of a honey bee. Pesticides can be ...

Extraction of Organochlorine Pesticides from Plastic Pellets and Plastic Type Analysis

Экстракция органохлоридных пестицидов из пластиковых гранул и анализ пластического типа

Plastic resin pellets, categorized as microplastics (&#8804;5 mm in diameter), are small granules that can be unintentionally released to the environment ...