6.4K Views
•
07:02 min
•
October 6th, 2020
DOI :
October 6th, 2020
•0:04
Introduction
0:34
Control and High Carbon Dioxide (CO2) Water
1:56
Fish Preparation
3:54
Electrophysiological Recording
5:18
Results: Representative Multi-Unit and Concentration Response Curves
6:25
Conclusion
Transcript
Detta är den mest robusta och känsliga metoden för att bedöma luktkänslighet hos marina fiskar eftersom den registrerar en rent sensorisk signal före bearbetning av CNS. De främsta fördelarna med denna teknik är dess känslighet och att den lätt kan överföras till en annan art än en annan miljö oberoende av yttre salthalt. För att förbereda kontrollvattnet, samla en liter kol-filtrerat havsvatten och använda en pH-sond för att kontrollera pH.,
PH-värdet ska vara runt 8,2. Om det inte är det, bubbla havsvattnet med atmosfärisk luft tills ett pH på 8,2 nås. Därefter använder en alkalinitet titrator för att mäta alkaliniteten i vattnet, sedan mäta vattentemperaturen och salthalten.
För att förbereda hög koldioxid vatten, filtrera en liter havsvatten genom partikelpartikel inaktiverade kolfilter innan bubblar med koldioxid tills önskat pH-värde nås. Använd en pH-sond för att kontrollera pH, som bör vara runt 7,7, sedan använda en alkalinitet titrator för att mäta alkalinitet av vattnet och mäta vattentemperaturen och salthalten. För att bestämma koldioxidtrycket i både kontroll och hög koldioxid vatten, öppna ett program som syftar till att beräkna koldioxid parametrar i vatten och lägga till vattensalthalten, temperatur, tryck, total alkalinitet, och pH-värden i ingångsfönstret.
Välj sedan konstanterna, skalorna och enheterna och klicka på process för att bestämma koldioxidtrycket. Efter att ha bekräftat en lämplig nivå av sedering av en brist på svar på svansen nypa, placera den sövda fisken på en kudde stöd anpassade för modellen och placera ett lämpligt storlek kiselrör i fiskens mun. Röret är anslutet till en dränkbar pump och en reservoar av bedövningsmedel som innehåller luftat havsvatten och vatten pumpas över gälarna i en cirka 100 milliliter per minut per kilogramhastighet.
Därefter sätter du in en jordningstapp i flankmuskeln och ansluter stiftet till förstärkarens huvudstadium. Täck fisken med fuktig trasa med endast huvudet exponerat och placera röret med stimulusleveranssystemet inom näsborren. För att exponera luktnerverna, använd en borr och ett dissekerande mikroskop för att ta bort skallens hud och ben mellan ögonen.
När du använder en havsbraxen, använd en cirkelsåg för att ta bort den del av skallen omedelbart ovanför ögonen för att bara posteriora till ögonen och använda borren för att ta bort benet mellan ögonen. När tillräckligt ben har rensats, använd fina tlys för att ta bort fett och bindväv överliggande luktnerverna utan att skada nerverna eller kärlen. Rengör elektroderna före användning genom att ansluta dem till den negativa polen på en tre volts likströmskälla och placera spetsen i fysiologisk saltlösning i 20 till 30 sekunder.
En stadig ström av små bubblor bör ses som kommer från spetsen. Anslut parylenbelagda volframelektroder till huvudstadiet av en växelströms växelströmsförförstärkare. När luktnerverna har exponerats, använd mikromanipulatorer för att föra in elektroderna i lämplig luktnerven i en position som ger ett maximalt svar på standarden och ett minimalt svar på blankt.
Förutsatt att dissekering har gått smidigt, är det kritiska steget att få elektroderna i rätt läge. Detta kan ta tid och innebär en viss grad av trial and error. För att erhålla elektrofysiologiska avläsningar, använd en solenoid drivs trevägsventil för att inrätta ett stimulans leveranssystem för att möjliggöra den snabba övergången från rent bakgrundsvatten till stimulans som innehåller vatten och ansluta den gemensamma utlopp till röret som transporterar vatten till luktrost.
Placera den ena linjen i bakgrundssjövatten och den andra i testlösningen. Anslut ventildrivrutinen till utlösaren för en analog digital omvandlare och konfigurera programvaran så att den börjar spela in vid utlösningshändelsen och att fortsätta under en förutbestämd period. För att kontrollera preparatens stabilitet registrerar och mäter upprepade gånger amplituden för det integrerade svaret upprepade gånger med den standard som tillåter en minut att förflyta mellan på varandra följande stimuli.
Därefter spela in luktnerven svar på aminosyror i kontroll havsvatten, och låt en minut att förflyta mellan successiva stimuli, sedan spela in svaret på en gånger 10 till den negativa tredje molar serin i en kontroll vatten blank lösning. Sedan registrera luktnerven svar på aminosyror i hög koldioxid havsvatten. Svaret på en hög koldioxid vatten tomlösning och svaret på en gånger 10 till den negativa tredje molar serin i en kontroll vatten blank lösning.
Här visas typiska svar på positiva och negativa kontrollstimuli som registrerats från luktnerven hos en havsbraxen. Inom ungefär en sekund av stimulans ansökan, en snabb ökning av verksamheten kan observeras följt av en period av boende medan stimulansen är fortfarande närvarande och en återgång till baslinjen verksamhet när stimulansen har upphört. Däremot väcker en tom stimulans liten eller ingen respons.
I denna typiska koncentrationsresponskurva kan man observera att ökande koncentrationer av en luktant kan framkalla allt större ökningar av aktiviteten och därför amplitud av de integrerade svaren. Plottning av de normaliserade uppgifterna och motsvarande linjär regression möjliggör uppskattning av detektionströskeln för koncentrationssvaren hos varje djur eller en grupp av djur. Sigmoidal koncentrations respons kurvor kan ritas semi-logaritmically, möjliggör beräkning av odorant koncentrationen som framkallar vid 50%maximal respons.
Det är viktigt att hålla fisken så frisk som möjligt. Se till exempel till att gälarna är tillräckligt bevattnade och att luktepitelet hålls vått under inspelningen. Ett av våra mål är att spåra nervbanorna i hjärnan till där den sensoriska informationen förmedlas.
Extracellulär multi-enhetsregistrering från luktnerven är en känslig, robust och reproducerbar metod för bedömning av luktkänslighet hos marina fiskar. Den registrerar primär sensorisk ingång och är oberoende av extern salthalt.
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved