Name: adaptable angled stereotactic approach for versatile neuroscience techniques
Uploaded: 2020-05-07T13:30:00
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Ce travail a été soutenu par les subventions F31-DK-113673 (C.L.F.), T32-GM-095421 (C.L.F.), DK-089056 (G.J.M.), un prix de science fondamentale innovante de l’American Diabetes Association (#1-19-IBS-192 à G.J.M.) et le Nutrition Obesity Research Center (DK-035816), le Diabetes Research Center (DK-017047) et diabetes, Subvention d’entraînement à l’obésité et au métabolisme T32 DK0007247 (T.H.M) à l’Université de Washington.

Toutes les procédures ont été approuvées conformément aux National Institutes of Health, au Guide for the Care and Use of Animals et ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) et environmental Health and Safety de l’Université de Washington.
1. Calcul des coordonnées inclinées
<ol><li>À l’aide d’un atlas du cerveau coronal, marquez un triangle rectangle afin que l’hypoténuse traverse la région cible d’intérêt. Dans l’exemple rep...

<ol>
	<li>King, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rise,+fall,+and+resurrection+of+the+ventromedial+hypothalamus+in+the+regulation+of+feeding+behavior+and+body+weight.">The rise, fall, and resurrection of the ventromedial hypothalamus in the regulation of feeding behavior and body weight.</a> Physiology and Behavior. 87, 221-244 (2006).</li><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale,+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).</li><li>Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DREADDs+for+Neuroscientists.">DREADDs for Neuroscientists.</a> Neuron. 89, 683-694 (2016).</li><li>Richevaux, L., Schenberg, L., Beraneck, M., Fricker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Intracerebral+Stereotaxic+Injections+for+Optogenetic+Stimulation+of+Long-Range+Inputs+in+Mouse+Brain+Slices.">In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices.</a> Journal of Visualized Experiments. , e59534 (2019).</li><li>Fricano-Kugler, C. J., Williams, M. R., Luikart, B., Salinaro, J. R., Li, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing,+packaging,+and+delivery+of+high+titer+crispr+retro+and+lentiviruses+via+stereotaxic+injection.">Designing, packaging, and delivery of high titer crispr retro and lentiviruses via stereotaxic injection.</a> Journal of Visualized Experiments. , e53783 (2016).</li><li>McSweeney, C., Mao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applying+Stereotactic+Injection+Technique+to+Study+Genetic+Effects+on+Animal+Behaviors.">Applying Stereotactic Injection Technique to Study Genetic Effects on Animal Behaviors.</a> Journal of Visualized Experiments. (99), e52653 (2015).</li><li>Lowell, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Neuroscience+of+Homeostasis+and+Drives+for+Food,+Water,+and+Salt.">New Neuroscience of Homeostasis and Drives for Food, Water, and Salt.</a> New England Journal of Medicine. 380, 459-471 (2019).</li><li>Sidor, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+optogenetic+stimulation+of+the+rodent+central+nervous+system.">In vivo optogenetic stimulation of the rodent central nervous system.</a> Journal of Visualized Experiments. , e51483 (2015).</li><li>Faber, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Neuronal+Projections+from+the+Hypothalamic+Ventromedial+Nucleus+Mediate+Glycemic+and+Behavioral+Effects.">Distinct Neuronal Projections from the Hypothalamic Ventromedial Nucleus Mediate Glycemic and Behavioral Effects.</a> Diabetes. 67, 2518-2529 (2018).</li><li>Berndt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+foundations+of+optogenetics:+Determinants+of+channelrhodopsin+ion+selectivity.">Structural foundations of optogenetics: Determinants of channelrhodopsin ion selectivity.</a> Proceedings of the National Academy of Scences. 113, 822-829 (2016).</li><li>Faber, C. L., Matsen, M. E., Meek, T. H., Krull, J. E., Morton, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+customizable+procedure+for+angled+stereotaxic+implantation+and+microinjection+in+the+rodent+brain.">A customizable procedure for angled stereotaxic implantation and microinjection in the rodent brain.</a> Kopf Carrier. 96, (2019).</li><li>Correia, P., Matias, S., Mainen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereotaxic+Adeno-associated+Virus+Injection+and+Cannula+Implantation+in+the+Dorsal+Raphe+Nucleus+of+Mice.">Stereotaxic Adeno-associated Virus Injection and Cannula Implantation in the Dorsal Raphe Nucleus of Mice.</a> Bio-Protocol. 7, 2549 (2017).</li><li>Cardozo Pinto, D. F., Lammel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hot+topic+in+optogenetics:+new+implications+of+in+vivo+tissue+heating.">Hot topic in optogenetics: new implications of in vivo tissue heating.</a> Nature Neuroscience. 22, 1039-1041 (2019).</li></ol>

Les progrès récents des neurosciences ont soutenu une compréhension et une compréhension avancées de l’activité et de la fonction des neurocircuits cérébraux. Cela comprend l’application de technologies optogénétiques et chimiogénétiques pour activer ou réduire au silence des populations neuronales discrètes et leurs sites de projection in vivo. Plus récemment, cela a inclus le développement d’indicateurs de calcium génétiquement codés (par exemple, GCaMP, RCaMP) et d’autres biocapteurs fluorom...

Le contrôle neuronal du comportement, de l’alimentation et du métabolisme implique la coordination de neurocircuits hautement complexes, intégratifs et redondants. L’un des ent objectifs du domaine des neurosciences est de disséquer la relation entre la structure et la fonction des circuits neuronaux. Bien que les outils classiques des neurosciences (c’est-à-dire les lésions, les injections pharmacologiques locales et la stimulation électrique) aient révélé des connaissances vitales concernant le rôle de régions cérébrales spécifiques qui contrôlent le comportement et le métabolisme, ces outils sont limités par leur manque de spécificité et de réversibilité1.
Les progrès récents dans le domaine des neurosciences ont considérablement amélioré la capacité d’interroger et de manipuler la fonction du circuit d’une manière spécifique au type cellulaire avec une résolution spatio-temporelle élevée. Les approches optogénétiques2 etchimiogénétiques 3, par exemple, permettent la manipulation rapide et réversible de l’activité dans des types cellulaires génétiquement définis d’animaux en mouvement libre. L’optogénétique implique l’utilisation de canaux ioniques sensibles à la lumière, appelés channelrhodopsines, pour contrôler l’activité neuronale. La clé de cette technique est l’administration génique de la channelrhodopsine et une source de lumière pour activer l’opsine. Une stratégie courante pour l’administration de gènes consiste à combiner 1) des souris génétiquement modifiées exprimant la Cre-recombinase dans des neurones discrets et 2) des vecteurs viraux dépendants de la Cre codant pour la channelrhodopsine.
Alors que l’optogénétique fournit un moyen élégant et très précis de contrôler l’activité neuronale, la méthode dépend de la micro-injection stéréotaxique réussie du vecteur viral et du placement de la fibre optique dans une région définie du cerveau. Bien que les procédures stéréotaxiques soient courantes dans le laboratoire de neurosciences moderne (et il existe plusieurs excellents protocoles décrivant cette procédure),4,5,6, être capable de cibler de manière cohérente et reproductible des régions cérébrales discrètes le long de la ligne médiane (c’est-à-dire l’hypothalamus médio-sasal, une zone du cerveau essentielle à la régulation des fonctions homéostatiques7) présente des défis supplémentaires. Ces défis comprennent l’évitement du sinus sagittal supérieur, du troisième ventricule et des noyaux hypothalamiques adjacents. En outre, il existe des limites spatiales importantes à l’implantation bilatérale du matériel nécessaire aux études d’inhibition. Avec ces défis à l’esprit, ce protocole présente ici une procédure modifiable pour cibler des régions cérébrales discrètes via une approche stéréotaxique inclinée.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fiberoptic Cannulae</td>
			<td>Doric Lenses</td>
			<td>MFC_200/230-0.57_###_MF1.25_FLT</td>
			<td>Customizable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kopf Model 1900 Stereotaxic Alignment System</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>Model 1900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kopf Model 1900-51 Center Height Gauge</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>Model 1900-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kopf Model 1905 Alignment Indicator</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>Model 1905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kopf Model 1911 Stereotaxic Drill</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>Model 1911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kopf Model 1915 Centering Scope</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>Model 1915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kopf Model 1922 60-Degree Non-Rupture Ear Bars</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>Model 1922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kopf Model 1923-B Mouse Gas Anesthesia Head Holder</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>Model 1923-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kopf Model 1940 Micro Manipulator</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>Model 1940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro4 Microinjection System</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse bone screws</td>
			<td>Plastics One</td>
			<td>00-96 X 1/16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic Cannula Holder, 1.25mm ferrule</td>
			<td>Thor Labs</td>
			<td>XCL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Drill</td>
			<td>Cell Point Scientific</td>
			<td>Ideal Micro Drill</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

adaptable angled stereotactic approach for versatile neuroscience techniques

La chirurgie stéréotaxique est un outil essentiel dans le laboratoire de neurosciences moderne. Cependant, la capacité de cibler avec précision et précision les régions cérébrales difficiles à atteindre présente toujours un défi, en particulier lorsqu’il s’il s’art de cibler les structures cérébrales le long de la ligne médiane. Ces défis comprennent l’évitement du sinus sagittal supérieur et du troisième ventricule et la capacité de cibler systématiquement les noyaux cérébraux sélectifs et discrets. En outre, les techniques de neurosciences plus avancées (par exemple, l’optogénétique, la photométrie des fibres et l’imagerie à deux photons) reposent sur l’implantation ciblée de matériel important dans le cerveau, et les limitations spatiales sont un obstacle courant. Présenté ici est un protocole modifiable pour le ciblage stéréotaxique des structures cérébrales des rongeurs en utilisant une approche coronale inclinée. Il peut être adapté à 1) des modèles de souris ou de rats, 2) diverses techniques de neurosciences et 3) plusieurs régions du cerveau. À titre d’exemple représentatif, il comprend le calcul des coordonnées stéréotaxiques pour le ciblage du noyau ventromédian hypothalamique (VMN) de souris pour une expérience d’inhibition optogénétique. Cette procédure commence par la micro-injection bilatérale d’un virus adéno-associé (AAV) encodant un canal chlorure sensible à la lumière (SwiChR++) sur un modèle murin dépendant de Cre, suivie de l’implantation bilatérale inclinée de canules à fibres optiques. En utilisant cette approche, les résultats montrent que l’activation d’un sous-ensemble de neurones VMN est nécessaire pour les réponses antirégulatrices du glucose intactes à l’hypoglycémie induite par l’insuline.

Ce protocole décrit une intervention chirurgicale pour effectuer des études optogénétiques afin d’interroger le rôle des neurones VMN hypothalamiques dans le contrôle glycémique9. La première utilisation a été une approche stéréotaxique standard (non inclinée) pour la microinjection bilatérale d’un virus inhibiteur de la channelrhodopsine au VMN. Bien qu’une approche inclinée convienne également, l’approche standard (non inclinée) a été choisie parce qu’elle est suffis...

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Adaptable Angled Stereotactic Approach for Versatile Neuroscience Techniques

Décrite ici est une procédure stéréotaxique qui peut cibler des régions cérébrales difficiles et difficiles à atteindre (en raison de limitations spatiales) en utilisant une approche coronale inclinée. Ce protocole est adaptable aux modèles de souris et de rats et peut être appliqué à diverses applications neuroscientifiques, y compris l’implantation de canules et les microinjections de constructions virales.

Approche stéréotaxique angulaire adaptable pour des techniques de neuroscience polyvalentes

Stereotactic surgery is an essential tool in the modern neuroscience lab. However, the ability to precisely and accurately target difficult-to-reach brain ...

This protocol is significant as it is an adaptable, stereotactic procedure that can be utilized in both mice and rats, and can be applied to many new neuroscientific techniques. The main advantage of this adaptable stereotactic procedure is it's ability to be used to target challenging and difficult-to-reach regions of the brain. Demonstrating the procedure will be Chelsea Faber, a young, talented post-doctoral research fellow in the laboratory.After confirming that the frame and micromanipulator have been calibrated, place the center height gauge into the socket of the head holder baseplate. Secure the centering scope in the tool holder and sight down the scope. Adjust the position of the micromanipulator until the crosshairs are aligned and focused on the gauge crosshairs, and place the ear bars into the holders such that the indicator lines on both sides are at zero.Use the medial-lateral and anterior-posterior knobs on the head holder to centerline the ear bars in the X and Y planes above the crosshair of the center height gauge. To align the ear bar position in the Z-axis, remove the ear bars from the holder and remove the center height gauge. Then, replace the ear bars and re-center the bars at zero.Then, sight down the scope again, and use the vertical shift and coronal tilt knobs respectively to lower and rotate the ear bars until the scope crosshairs remain centered between the ear bars throughout coronal rotation. To align the central axis of rotation for angled coordinates, secure the centering scope in the tool holder and position the micromanipulator to the calculated coordinate. Note that the right/left coordinate for the angled implantation corresponds to the length of side A.Sighting down the scope, mark this coordinate to represent the point at which the cannula will enter the brain, once the head is rotated.Reposition the micromanipulator over the midline, and use the coronal tilt knob to rotate the head to the calculated angle. If the scope crosshairs do not line up with the reference mark, use the vertical shift knob to adjust the head position in the Z-axis until the crosshairs line up as close as possible to the mark. At this point, the arbitrary point of rotation should be aligned with the center of rotation of the stereotax.Rotate the head back to the zero degree coronal position before proceeding to subsequent drilling and microinjection steps. After performing the microinjection, return the head to the zero degree level position, and use a hand drill to place two holes, anteriorly, and two holes, posteriorly, far enough from the angled coordinate burr holes to accommodate the ferrule portion of the fiberoptic that sits above the skull. When all of the holes have been drilled, use a small flathead screwdriver to insert the bone screws as gently as possible, such that they sit firmly in the skull without penetrating the brain.Clamp a fiberoptic cannula into the cannula holder, and place the cannula holder in the tool holder. Rotate the head to the calculated angle, noting that the coordinates of the micromanipulator do not apply to the new tool. Use the center of the angled burr holes as the implantation target.Lower the fiber optic until it just touches the dura within the center of the burr hole, and zero the micromanipulator in the Z-axis. Slowly lower the fiberoptic to the dorsal ventral angled coordinate, then use cyanoacrylate gel to connect the fiber optic ferrule to the ipsilateral anchor screws. Use a micropipette tip to apply an accelerant.Once the gel has completely hardened, gently loosen and raise the cannula holder until it is clear of the ferrule. Implant the second fiberoptic to the contralateral angled coordinate, then level the head. For extra security, use the cyanoacrylate gel and accelerant to make an additional connection between the two angled fiberoptic cannulas, and apply a small, relatively thin amount of dental cement to the surface of the skull, taking care to thoroughly cover the anchor screws and the base of the fiberoptic cannulas.To interrogate the role of hypothalamus ventromedial nucleus neurons in glycemic control, in this representative analysis, a standard, non-angled, stereotactic approach was utilized for the bilateral microinjection of an inhibitory channel rhodopsin virus to the ventromedial nucleus. Given the proximity of the ventromedial nucleus to the midline, space constraints did not permit a non-angled implantation of bilateral fiberoptics, necessitating the development of a surgical strategy for precisely implanting fiberoptics at an angle. The most important things to remember are to simply be patient and to take your time, as being consistent and accurate with your coordinate assignments is critical to success.This procedure can be adapted and applied to any neuroscientific method requiring microinjection or implantation into the rodent brain, including chemogenetics, optogenetics, and fiber photometry approaches.

Research

JoVE Journal

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Stéréotaxique Atlas guidée Laser Microdissection de saisie des régions cérébrales touchées par lésion traumatique

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