Name: adaptable angled stereotactic approach for versatile neuroscience techniques
Uploaded: 2020-05-07T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Adaptable Angled Stereotactic Approach for Versatile Neuroscience Techniques at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK) concede F31-DK-113673 (C.L.F.), T32-GM-095421 (C.L.F.), DK-089056 (G.J.M.), un American Diabetes Association Innovative Basic Science Award (#1-19-IBS-192 a G.J.M.) e il Nutrition Obesity Research Center (DK-035816), Diabetes Research Center (DK-017047) e Diabetes, Obesity and Metabolism Training Grant T32 DK0007247 (T.H.M) presso l'Università di Washington.

Tutte le procedure sono state approvate in conformità con il National Institutes of Health, la Guida per la cura e l'uso degli animali e sono state approvate sia dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) che dalla Environmental Health and Safety dell'Università di Washington.
1. Calcolo delle coordinate angolate
<ol><li>Usando un atlante cerebrale coronale, segna un triangolo rettangolo in modo che l'ipoteno passi attraverso la regione target di interesse. Nell'esempio rappr...

<ol>
	<li>King, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rise,+fall,+and+resurrection+of+the+ventromedial+hypothalamus+in+the+regulation+of+feeding+behavior+and+body+weight.">The rise, fall, and resurrection of the ventromedial hypothalamus in the regulation of feeding behavior and body weight.</a> Physiology and Behavior. 87, 221-244 (2006).</li><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale,+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).</li><li>Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DREADDs+for+Neuroscientists.">DREADDs for Neuroscientists.</a> Neuron. 89, 683-694 (2016).</li><li>Richevaux, L., Schenberg, L., Beraneck, M., Fricker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Intracerebral+Stereotaxic+Injections+for+Optogenetic+Stimulation+of+Long-Range+Inputs+in+Mouse+Brain+Slices.">In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices.</a> Journal of Visualized Experiments. , e59534 (2019).</li><li>Fricano-Kugler, C. J., Williams, M. R., Luikart, B., Salinaro, J. R., Li, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing,+packaging,+and+delivery+of+high+titer+crispr+retro+and+lentiviruses+via+stereotaxic+injection.">Designing, packaging, and delivery of high titer crispr retro and lentiviruses via stereotaxic injection.</a> Journal of Visualized Experiments. , e53783 (2016).</li><li>McSweeney, C., Mao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applying+Stereotactic+Injection+Technique+to+Study+Genetic+Effects+on+Animal+Behaviors.">Applying Stereotactic Injection Technique to Study Genetic Effects on Animal Behaviors.</a> Journal of Visualized Experiments. (99), e52653 (2015).</li><li>Lowell, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Neuroscience+of+Homeostasis+and+Drives+for+Food,+Water,+and+Salt.">New Neuroscience of Homeostasis and Drives for Food, Water, and Salt.</a> New England Journal of Medicine. 380, 459-471 (2019).</li><li>Sidor, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+optogenetic+stimulation+of+the+rodent+central+nervous+system.">In vivo optogenetic stimulation of the rodent central nervous system.</a> Journal of Visualized Experiments. , e51483 (2015).</li><li>Faber, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Neuronal+Projections+from+the+Hypothalamic+Ventromedial+Nucleus+Mediate+Glycemic+and+Behavioral+Effects.">Distinct Neuronal Projections from the Hypothalamic Ventromedial Nucleus Mediate Glycemic and Behavioral Effects.</a> Diabetes. 67, 2518-2529 (2018).</li><li>Berndt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+foundations+of+optogenetics:+Determinants+of+channelrhodopsin+ion+selectivity.">Structural foundations of optogenetics: Determinants of channelrhodopsin ion selectivity.</a> Proceedings of the National Academy of Scences. 113, 822-829 (2016).</li><li>Faber, C. L., Matsen, M. E., Meek, T. H., Krull, J. E., Morton, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+customizable+procedure+for+angled+stereotaxic+implantation+and+microinjection+in+the+rodent+brain.">A customizable procedure for angled stereotaxic implantation and microinjection in the rodent brain.</a> Kopf Carrier. 96, (2019).</li><li>Correia, P., Matias, S., Mainen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereotaxic+Adeno-associated+Virus+Injection+and+Cannula+Implantation+in+the+Dorsal+Raphe+Nucleus+of+Mice.">Stereotaxic Adeno-associated Virus Injection and Cannula Implantation in the Dorsal Raphe Nucleus of Mice.</a> Bio-Protocol. 7, 2549 (2017).</li><li>Cardozo Pinto, D. F., Lammel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hot+topic+in+optogenetics:+new+implications+of+in+vivo+tissue+heating.">Hot topic in optogenetics: new implications of in vivo tissue heating.</a> Nature Neuroscience. 22, 1039-1041 (2019).</li></ol>

I recenti progressi nelle neuroscienze hanno supportato l'intuizione avanzata e la comprensione dell'attività e della funzione dei neurocircuiti cerebrali. Ciò include l'applicazione di tecnologie optogenetiche e chemiogenetiche per attivare o silenziare popolazioni neuronali discrete e i loro siti di proiezione in vivo. Più recentemente, questo ha incluso lo sviluppo di indicatori di calcio geneticamente codificati (ad esempio, GCaMP, RCaMP) e altri biosensori fluorometrici (ad esempio, dopamina, noradrenalina) per l...

Il controllo neurale del comportamento, dell'alimentazione e del metabolismo comporta il coordinamento di neurocircuiti altamente complessi, integrativi e ridondanti. Un obiettivo trainante del campo delle neuroscienze è quello di sezionare la relazione tra struttura e funzione del circuito neuronale. Sebbene gli strumenti classici delle neuroscienze (ad esempio, lesioni, iniezioni farmacologiche locali e stimolazione elettrica) abbiano scoperto conoscenze vitali riguardanti il ruolo di specifiche regioni del cervello che controllano il comportamento e il metabolismo, questi strumenti sono limitati dalla loro mancanza di specificità e reversibilità1.
I recenti progressi nel campo delle neuroscienze hanno notevolmente migliorato la capacità di interrogare e manipolare la funzione del circuito in un modo specifico di tipo cellulare con un'alta risoluzione spaziotemporale. Gli approcci optogenetici2 e chemiogenetici3, ad esempio, consentono la manipolazione rapida e reversibile dell'attività in tipi di cellule geneticamente definiti di animali che si muovono liberamente. L'optogenetica prevede l'uso di canali ionici sensibili alla luce, chiamati channelrhodopsins, per controllare l'attività neuronale. La chiave di questa tecnica è la consegna genica di channelrhodopsin e una fonte di luce per attivare l'opsina. Una strategia comune per la consegna dei geni è attraverso una combinazione di 1) topi geneticamente modificati che esprimono Cre-ricombiinasi in neuroni discreti e 2) vettori virali cre-dipendenti che codificano per la channelrhodopsin.
Mentre l'optogenetica fornisce un mezzo elegante e altamente preciso per controllare l'attività neuronale, il metodo è subordinato al successo della microiniezione stereotassica del vettore virale e del posizionamento delle fibre ottiche in una regione cerebrale definita. Sebbene le procedure stereotassica siano comuni all'interno del moderno laboratorio di neuroscienze (e ci sono diversi protocolli eccellenti che descrivono questa procedura)4,5,6, essere in grado di indirizzare in modo coerente e riproducibile regioni cerebrali discrete lungo la linea mediana (cioè l'ipotalamo mediobasale, un'area cerebrale critica per la regolazione delle funzioni omeostatiche7) presenta ulteriori sfide. Queste sfide includono l'evitare il seno sagittale superiore, il terzo ventricolo e i nuclei ipotalamici adiacenti. Inoltre, ci sono significative limitazioni spaziali all'impianto bilaterale di hardware che è necessario per gli studi di inibizione. Con queste sfide in mente, questo protocollo qui presenta una procedura modificabile per il targeting di regioni cerebrali discrete attraverso un approccio stereotassico angolato.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fiberoptic Cannulae</td>
			<td>Doric Lenses</td>
			<td>MFC_200/230-0.57_###_MF1.25_FLT</td>
			<td>Customizable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kopf Model 1900 Stereotaxic Alignment System</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>Model 1900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kopf Model 1900-51 Center Height Gauge</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>Model 1900-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kopf Model 1905 Alignment Indicator</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>Model 1905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kopf Model 1911 Stereotaxic Drill</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>Model 1911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kopf Model 1915 Centering Scope</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>Model 1915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kopf Model 1922 60-Degree Non-Rupture Ear Bars</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>Model 1922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kopf Model 1923-B Mouse Gas Anesthesia Head Holder</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>Model 1923-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kopf Model 1940 Micro Manipulator</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>Model 1940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro4 Microinjection System</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse bone screws</td>
			<td>Plastics One</td>
			<td>00-96 X 1/16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic Cannula Holder, 1.25mm ferrule</td>
			<td>Thor Labs</td>
			<td>XCL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Drill</td>
			<td>Cell Point Scientific</td>
			<td>Ideal Micro Drill</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

adaptable angled stereotactic approach for versatile neuroscience techniques

La chirurgia stereotassica è uno strumento essenziale nel moderno laboratorio di neuroscienze. Tuttavia, la capacità di indirizzare in modo preciso e preciso le regioni cerebrali difficili da raggiungere rappresenta ancora una sfida, in particolare quando si prendono di mira le strutture cerebrali lungo la linea mediana. Queste sfide includono l'evitamento del seno sagittale superiore e del terzo ventricolo e la capacità di colpire costantemente nuclei cerebrali selettivi e discreti. Inoltre, le tecniche di neuroscienza più avanzate (ad esempio, optogenetica, fotometria delle fibre e imaging a due fotoni) si basano sull'impianto mirato di hardware significativo al cervello e le limitazioni spaziali sono un ostacolo comune. Qui viene presentato un protocollo modificabile per il targeting stereotassico delle strutture cerebrali dei roditori utilizzando un approccio coronale angolato. Può essere adattato a 1) modelli di topi o ratti, 2) varie tecniche di neuroscienza e 3) più regioni del cervello. Come esempio rappresentativo, include il calcolo delle coordinate stereotassica per il targeting del nucleo ventromediale ipotalamico di topo (VMN) per un esperimento di inibizione optogenetica. Questa procedura inizia con la microiniezione bilaterale di un virus adeno-associato (AAV) che codifica un canale del cloruro sensibile alla luce (SwiChR ++) in un modello murino Cre-dipendente, seguito dall'impianto bilaterale angolato di cannule in fibra ottica. Utilizzando questo approccio, i risultati mostrano che l'attivazione di un sottoinsieme di neuroni VMN è necessaria per le risposte controregolatorie del glucosio intatte all'ipoglicemia indotta dall'insulina.

Questo protocollo descrive una procedura chirurgica per l'esecuzione di studi optogenetici per interrogare il ruolo dei neuroni VMN ipotalamici nel controllo glicemico9. Il primo utilizzo è stato un approccio stereotassico standard (non angolato) per la microiniezione bilaterale di un virus inibitorio channelrhodopsin al VMN. Mentre un approccio angolato sarebbe anche adatto, l'approccio standard (non angolato) è stato scelto perché è sufficiente per indirizzare la regione del cervello di inte...

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Adaptable Angled Stereotactic Approach for Versatile Neuroscience Techniques

Qui è descritta una procedura stereotassica che può colpire regioni cerebrali impegnative e difficili da raggiungere (a causa di limitazioni spaziali) utilizzando un approccio coronale angolato. Questo protocollo è adattabile sia a modelli murini che di ratto e può essere applicato a diverse applicazioni neuroscientifiche, tra cui l'impianto di cannule e microiniezioni di costrutti virali.

Approccio stereotassico angolato adattabile per tecniche di neuroscienze versatili

Stereotactic surgery is an essential tool in the modern neuroscience lab. However, the ability to precisely and accurately target difficult-to-reach brain ...

This protocol is significant as it is an adaptable, stereotactic procedure that can be utilized in both mice and rats, and can be applied to many new neuroscientific techniques. The main advantage of this adaptable stereotactic procedure is it's ability to be used to target challenging and difficult-to-reach regions of the brain. Demonstrating the procedure will be Chelsea Faber, a young, talented post-doctoral research fellow in the laboratory.After confirming that the frame and micromanipulator have been calibrated, place the center height gauge into the socket of the head holder baseplate. Secure the centering scope in the tool holder and sight down the scope. Adjust the position of the micromanipulator until the crosshairs are aligned and focused on the gauge crosshairs, and place the ear bars into the holders such that the indicator lines on both sides are at zero.Use the medial-lateral and anterior-posterior knobs on the head holder to centerline the ear bars in the X and Y planes above the crosshair of the center height gauge. To align the ear bar position in the Z-axis, remove the ear bars from the holder and remove the center height gauge. Then, replace the ear bars and re-center the bars at zero.Then, sight down the scope again, and use the vertical shift and coronal tilt knobs respectively to lower and rotate the ear bars until the scope crosshairs remain centered between the ear bars throughout coronal rotation. To align the central axis of rotation for angled coordinates, secure the centering scope in the tool holder and position the micromanipulator to the calculated coordinate. Note that the right/left coordinate for the angled implantation corresponds to the length of side A.Sighting down the scope, mark this coordinate to represent the point at which the cannula will enter the brain, once the head is rotated.Reposition the micromanipulator over the midline, and use the coronal tilt knob to rotate the head to the calculated angle. If the scope crosshairs do not line up with the reference mark, use the vertical shift knob to adjust the head position in the Z-axis until the crosshairs line up as close as possible to the mark. At this point, the arbitrary point of rotation should be aligned with the center of rotation of the stereotax.Rotate the head back to the zero degree coronal position before proceeding to subsequent drilling and microinjection steps. After performing the microinjection, return the head to the zero degree level position, and use a hand drill to place two holes, anteriorly, and two holes, posteriorly, far enough from the angled coordinate burr holes to accommodate the ferrule portion of the fiberoptic that sits above the skull. When all of the holes have been drilled, use a small flathead screwdriver to insert the bone screws as gently as possible, such that they sit firmly in the skull without penetrating the brain.Clamp a fiberoptic cannula into the cannula holder, and place the cannula holder in the tool holder. Rotate the head to the calculated angle, noting that the coordinates of the micromanipulator do not apply to the new tool. Use the center of the angled burr holes as the implantation target.Lower the fiber optic until it just touches the dura within the center of the burr hole, and zero the micromanipulator in the Z-axis. Slowly lower the fiberoptic to the dorsal ventral angled coordinate, then use cyanoacrylate gel to connect the fiber optic ferrule to the ipsilateral anchor screws. Use a micropipette tip to apply an accelerant.Once the gel has completely hardened, gently loosen and raise the cannula holder until it is clear of the ferrule. Implant the second fiberoptic to the contralateral angled coordinate, then level the head. For extra security, use the cyanoacrylate gel and accelerant to make an additional connection between the two angled fiberoptic cannulas, and apply a small, relatively thin amount of dental cement to the surface of the skull, taking care to thoroughly cover the anchor screws and the base of the fiberoptic cannulas.To interrogate the role of hypothalamus ventromedial nucleus neurons in glycemic control, in this representative analysis, a standard, non-angled, stereotactic approach was utilized for the bilateral microinjection of an inhibitory channel rhodopsin virus to the ventromedial nucleus. Given the proximity of the ventromedial nucleus to the midline, space constraints did not permit a non-angled implantation of bilateral fiberoptics, necessitating the development of a surgical strategy for precisely implanting fiberoptics at an angle. The most important things to remember are to simply be patient and to take your time, as being consistent and accurate with your coordinate assignments is critical to success.This procedure can be adapted and applied to any neuroscientific method requiring microinjection or implantation into the rodent brain, including chemogenetics, optogenetics, and fiber photometry approaches.

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