Name: adaptable angled stereotactic approach for versatile neuroscience techniques
Uploaded: 2020-05-07T13:30:00
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この研究は、国立糖尿病・消化器・腎臓病研究所(NIDDK)がF31-DK-113673(C.L.F.)、T32-GM-095421(C.L.F.)、DK-089056(C.L.F.)を助成金で支えました(.M 米国糖尿病学会革新的基礎科学賞(#1-19-IBS-192からG.J.M)、NIDDK出資の栄養肥満研究センター(DK-035816)、糖尿病研究センター(DK-017047)、糖尿病、 肥満と代謝トレーニンググラントT32 DK0007247(T.H.M)ワシントン大学で。

すべての手順は、国立衛生研究所、動物のケアと使用のためのガイドに従って承認され、ワシントン大学の制度的動物ケアと使用委員会(IACUC)と環境安全衛生の両方によって承認されました。
1. 角度付き座標の計算
<ol><li>コロナ脳アトラスを使用して、斜辺が対象のターゲット領域を通過するように直角三角形をマークします。代表例(図1)では、?...

<ol>
	<li>King, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rise,+fall,+and+resurrection+of+the+ventromedial+hypothalamus+in+the+regulation+of+feeding+behavior+and+body+weight.">The rise, fall, and resurrection of the ventromedial hypothalamus in the regulation of feeding behavior and body weight.</a> Physiology and Behavior. 87, 221-244 (2006).</li><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale,+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).</li><li>Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DREADDs+for+Neuroscientists.">DREADDs for Neuroscientists.</a> Neuron. 89, 683-694 (2016).</li><li>Richevaux, L., Schenberg, L., Beraneck, M., Fricker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Intracerebral+Stereotaxic+Injections+for+Optogenetic+Stimulation+of+Long-Range+Inputs+in+Mouse+Brain+Slices.">In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices.</a> Journal of Visualized Experiments. , e59534 (2019).</li><li>Fricano-Kugler, C. J., Williams, M. R., Luikart, B., Salinaro, J. R., Li, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing,+packaging,+and+delivery+of+high+titer+crispr+retro+and+lentiviruses+via+stereotaxic+injection.">Designing, packaging, and delivery of high titer crispr retro and lentiviruses via stereotaxic injection.</a> Journal of Visualized Experiments. , e53783 (2016).</li><li>McSweeney, C., Mao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applying+Stereotactic+Injection+Technique+to+Study+Genetic+Effects+on+Animal+Behaviors.">Applying Stereotactic Injection Technique to Study Genetic Effects on Animal Behaviors.</a> Journal of Visualized Experiments. (99), e52653 (2015).</li><li>Lowell, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Neuroscience+of+Homeostasis+and+Drives+for+Food,+Water,+and+Salt.">New Neuroscience of Homeostasis and Drives for Food, Water, and Salt.</a> New England Journal of Medicine. 380, 459-471 (2019).</li><li>Sidor, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+optogenetic+stimulation+of+the+rodent+central+nervous+system.">In vivo optogenetic stimulation of the rodent central nervous system.</a> Journal of Visualized Experiments. , e51483 (2015).</li><li>Faber, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Neuronal+Projections+from+the+Hypothalamic+Ventromedial+Nucleus+Mediate+Glycemic+and+Behavioral+Effects.">Distinct Neuronal Projections from the Hypothalamic Ventromedial Nucleus Mediate Glycemic and Behavioral Effects.</a> Diabetes. 67, 2518-2529 (2018).</li><li>Berndt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+foundations+of+optogenetics:+Determinants+of+channelrhodopsin+ion+selectivity.">Structural foundations of optogenetics: Determinants of channelrhodopsin ion selectivity.</a> Proceedings of the National Academy of Scences. 113, 822-829 (2016).</li><li>Faber, C. L., Matsen, M. E., Meek, T. H., Krull, J. E., Morton, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+customizable+procedure+for+angled+stereotaxic+implantation+and+microinjection+in+the+rodent+brain.">A customizable procedure for angled stereotaxic implantation and microinjection in the rodent brain.</a> Kopf Carrier. 96, (2019).</li><li>Correia, P., Matias, S., Mainen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereotaxic+Adeno-associated+Virus+Injection+and+Cannula+Implantation+in+the+Dorsal+Raphe+Nucleus+of+Mice.">Stereotaxic Adeno-associated Virus Injection and Cannula Implantation in the Dorsal Raphe Nucleus of Mice.</a> Bio-Protocol. 7, 2549 (2017).</li><li>Cardozo Pinto, D. F., Lammel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hot+topic+in+optogenetics:+new+implications+of+in+vivo+tissue+heating.">Hot topic in optogenetics: new implications of in vivo tissue heating.</a> Nature Neuroscience. 22, 1039-1041 (2019).</li></ol>

最近の神経科学の進歩は、脳神経回路の活動と機能に関する高度な洞察と理解を支えています。これには、生体内の離散ニューロン集団とその投影部位を活性化または沈黙させる光遺伝学的および化学遺伝学的技術の適用が含まれる。最近では、遺伝子組み換えカルシウム指標(GCaMP、RCaMPなど)および他の蛍光バイオセンサー(ドーパミン、ノルエピネフリンなど)の開発が含まれており、自由?...

行動、摂食、代謝の神経制御は、高度に複雑で統合的で冗長な神経回路の調整を伴う。神経科学分野の駆動目標は、神経回路構造と機能の関係を解剖することです。古典的な神経科学ツール(すなわち、病変、局所薬理注射、および電気刺激)は、行動および代謝を制御する特定の脳領域の役割に関する重要な知識を発見しているが、これらのツールは特異性および可逆性の欠如によって制限される。
近年の神経科学分野の進歩により、高い時空間分解能を持つ細胞型特異的な方法で回路機能を問い合わせて操作する能力が大幅に向上しています。例えば、光遺伝学2 および化学遺伝学的3 アプローチは、自由に動く動物の遺伝的に定義された細胞タイプにおける活動の迅速かつ可逆的な操作を可能にする。光遺伝学は、神経活動を制御するために、光感受性イオンチャネル、いわゆるチャネルロドプシンの使用を含む。この技術の鍵は、オプシンを活性化するチャネルロドプシンおよび光源の遺伝子送達である。遺伝子導入の一般的な戦略は、1)離散ニューロンでCre-recombinaseを発現する遺伝子操作マウスと、2)チャネルロドプシンをコードするCre依存性ウイルスベクターの組み合わせによるものである。
光遺伝学は、神経活動を制御するためのエレガントで非常に正確な手段を提供するが、この方法は、定義された脳領域へのウイルスベクターおよび光ファイバー配置の正常な立体的マイクロインジェクションに依存する。立体的な手順は現代の神経科学研究室では一般的であるが(そして、この手順を記述するいくつかの優れたプロトコルがある)4、5、6、中線に沿って一貫して再現的に離散的な脳領域を標的にすることができる(すなわち、心座視下部、恒常性機能の調節に不可欠な脳領域7)は、追加の課題を提示する。これらの課題には、優れた矢状の座頭座、第3心室、および隣接する視床下部核の回避が含まれる。さらに、阻害研究に必要なハードウェアの二国間注入には有意な空間的制限がある。これらの課題を念頭に置いて、本明細書では、このプロトコルは、角度付きの定位的アプローチを介して離散的な脳領域を標的にするための変更可能な手順を提示する。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fiberoptic Cannulae</td>
			<td>Doric Lenses</td>
			<td>MFC_200/230-0.57_###_MF1.25_FLT</td>
			<td>Customizable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kopf Model 1900 Stereotaxic Alignment System</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>Model 1900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kopf Model 1900-51 Center Height Gauge</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>Model 1900-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kopf Model 1905 Alignment Indicator</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>Model 1905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kopf Model 1911 Stereotaxic Drill</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>Model 1911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kopf Model 1915 Centering Scope</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>Model 1915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kopf Model 1922 60-Degree Non-Rupture Ear Bars</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>Model 1922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kopf Model 1923-B Mouse Gas Anesthesia Head Holder</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>Model 1923-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kopf Model 1940 Micro Manipulator</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>Model 1940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro4 Microinjection System</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse bone screws</td>
			<td>Plastics One</td>
			<td>00-96 X 1/16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic Cannula Holder, 1.25mm ferrule</td>
			<td>Thor Labs</td>
			<td>XCL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Drill</td>
			<td>Cell Point Scientific</td>
			<td>Ideal Micro Drill</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

adaptable angled stereotactic approach for versatile neuroscience techniques

定位外科は現代の神経科学研究室で不可欠なツールです。しかし、到達困難な脳領域を正確かつ正確に標的にする能力は、特に正中線に沿って脳構造を標的とする場合には依然として課題を提示する。これらの課題には、優れた矢状脳および第3心室の回避と、選択的および離散的な脳核を一貫して標的とする能力が含まれる。さらに、より高度な神経科学技術(例えば、光遺伝学、光測定、2光子イメージング)は、脳への重要なハードウェアの標的移植に依存しており、空間的な制限は一般的な障害である。ここで提示される、角度付きコロナアプローチを用いたげっ歯類の脳構造の定位的な標的化のための変更可能なプロトコルである。1)マウスまたはラットモデル、2)様々な神経科学技術、および3)複数の脳領域に適応することができる。代表的な例として、光遺伝学的阻害実験に対するマウス視床下部心室核(VMN)の標的化に関する定位座標の計算が含まれる。この手順は、光感受性クロリドチャネル(SwiChR++)をクレ依存的なマウスモデルにコードするアデノ関連ウイルス(AAV)の二国間マイクロインジェクションから始まり、続いて光ファイバーカニューレの斜めの両側移植が行われます。このアプローチを用いて、インシュリン誘発低血糖に対するグルコース対調節応答に対するVMNニューロンのサブセットの活性化が必要であることを示す。

このプロトコルは、血糖制御における視床下部VMNニューロンの役割を問い合う光遺伝学的研究を行うための外科的処置を説明する9。最初に利用されたのは、抑制性チャネルロドプシンウイルスのVMNへの二国間マイクロインジェクションに対する標準的な(非角度)定位的アプローチであった。角度付きアプローチも適していますが、対象となる脳領域をターゲットにするのに?...

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Adaptable Angled Stereotactic Approach for Versatile Neuroscience Techniques

ここでは、角度付きコロナアプローチを使用して(空間的な制限のために)困難で到達しにくい脳領域を標的にすることができる定位的手順を説明します。このプロトコルは、マウスおよびラットモデルの両方に適応可能であり、カニューレ移植およびウイルス構築物のマイクロインジェクションを含む多様な神経科学的用途に適用することができる。

多目的神経科学技術のための適応可能な角度付き定位アプローチ

Stereotactic surgery is an essential tool in the modern neuroscience lab. However, the ability to precisely and accurately target difficult-to-reach brain ...

This protocol is significant as it is an adaptable, stereotactic procedure that can be utilized in both mice and rats, and can be applied to many new neuroscientific techniques. The main advantage of this adaptable stereotactic procedure is it's ability to be used to target challenging and difficult-to-reach regions of the brain. Demonstrating the procedure will be Chelsea Faber, a young, talented post-doctoral research fellow in the laboratory.After confirming that the frame and micromanipulator have been calibrated, place the center height gauge into the socket of the head holder baseplate. Secure the centering scope in the tool holder and sight down the scope. Adjust the position of the micromanipulator until the crosshairs are aligned and focused on the gauge crosshairs, and place the ear bars into the holders such that the indicator lines on both sides are at zero.Use the medial-lateral and anterior-posterior knobs on the head holder to centerline the ear bars in the X and Y planes above the crosshair of the center height gauge. To align the ear bar position in the Z-axis, remove the ear bars from the holder and remove the center height gauge. Then, replace the ear bars and re-center the bars at zero.Then, sight down the scope again, and use the vertical shift and coronal tilt knobs respectively to lower and rotate the ear bars until the scope crosshairs remain centered between the ear bars throughout coronal rotation. To align the central axis of rotation for angled coordinates, secure the centering scope in the tool holder and position the micromanipulator to the calculated coordinate. Note that the right/left coordinate for the angled implantation corresponds to the length of side A.Sighting down the scope, mark this coordinate to represent the point at which the cannula will enter the brain, once the head is rotated.Reposition the micromanipulator over the midline, and use the coronal tilt knob to rotate the head to the calculated angle. If the scope crosshairs do not line up with the reference mark, use the vertical shift knob to adjust the head position in the Z-axis until the crosshairs line up as close as possible to the mark. At this point, the arbitrary point of rotation should be aligned with the center of rotation of the stereotax.Rotate the head back to the zero degree coronal position before proceeding to subsequent drilling and microinjection steps. After performing the microinjection, return the head to the zero degree level position, and use a hand drill to place two holes, anteriorly, and two holes, posteriorly, far enough from the angled coordinate burr holes to accommodate the ferrule portion of the fiberoptic that sits above the skull. When all of the holes have been drilled, use a small flathead screwdriver to insert the bone screws as gently as possible, such that they sit firmly in the skull without penetrating the brain.Clamp a fiberoptic cannula into the cannula holder, and place the cannula holder in the tool holder. Rotate the head to the calculated angle, noting that the coordinates of the micromanipulator do not apply to the new tool. Use the center of the angled burr holes as the implantation target.Lower the fiber optic until it just touches the dura within the center of the burr hole, and zero the micromanipulator in the Z-axis. Slowly lower the fiberoptic to the dorsal ventral angled coordinate, then use cyanoacrylate gel to connect the fiber optic ferrule to the ipsilateral anchor screws. Use a micropipette tip to apply an accelerant.Once the gel has completely hardened, gently loosen and raise the cannula holder until it is clear of the ferrule. Implant the second fiberoptic to the contralateral angled coordinate, then level the head. For extra security, use the cyanoacrylate gel and accelerant to make an additional connection between the two angled fiberoptic cannulas, and apply a small, relatively thin amount of dental cement to the surface of the skull, taking care to thoroughly cover the anchor screws and the base of the fiberoptic cannulas.To interrogate the role of hypothalamus ventromedial nucleus neurons in glycemic control, in this representative analysis, a standard, non-angled, stereotactic approach was utilized for the bilateral microinjection of an inhibitory channel rhodopsin virus to the ventromedial nucleus. Given the proximity of the ventromedial nucleus to the midline, space constraints did not permit a non-angled implantation of bilateral fiberoptics, necessitating the development of a surgical strategy for precisely implanting fiberoptics at an angle. The most important things to remember are to simply be patient and to take your time, as being consistent and accurate with your coordinate assignments is critical to success.This procedure can be adapted and applied to any neuroscientific method requiring microinjection or implantation into the rodent brain, including chemogenetics, optogenetics, and fiber photometry approaches.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Novel Approach for Documenting Phosphenes Induced by Transcranial Magnetic Stimulation

経頭蓋磁気刺激による閃光を文書化するための斬新なアプローチ

Stimulation of the human visual cortex produces a transient perception of light, known as a phosphene. Phosphenes are induced by invasive electrical ...

神経科学

High Density Event-related Potential  Data Acquisition in Cognitive Neuroscience

高密度のイベントに関連する認知神経科学における潜在的なデータ収集

Functional magnetic resonance imaging (fMRI) is currently the standard method of evaluating brain function in the field of Cognitive Neuroscience, in part ...

Rodent Stereotaxic Surgery and Animal Welfare Outcome Improvements for Behavioral Neuroscience

行動神経科学のための齧歯類定位手術と動物福祉のアウトカムの改善

Stereotaxic surgery for the implantation of cannulae into specific brain regions has for many decades been a very successful experimental technique to ...

VisioTracker, an Innovative Automated Approach to Oculomotor Analysis

VisioTracker、眼球運動解析への革新的な自動化されたアプローチ

Investigations into the visual system development and function necessitate quantifiable behavioral models of visual performance that are easy to elicit, ...

A Fully Automated and Highly Versatile System for Testing Multi-cognitive Functions and Recording Neuronal Activities in Rodents

マルチ認知機能のテストとげっ歯類の神経活動を記録するための完全に自動化された汎用性の高いシステム

We have developed a fully automated system for operant behavior testing and neuronal activity recording by which multiple cognitive brain functions can be ...

Investigating the Function of Deep Cortical and Subcortical Structures Using Stereotactic Electroencephalography: Lessons from the Anterior Cingulate Cortex

定位脳波を使用して、ディープ皮質の機能と下構造の調査：前帯状皮質からの教訓は、

Stereotactic Electroencephalography (SEEG) is a technique used to localize seizure foci in patients with medically intractable epilepsy. This procedure ...

A Simple Alternative to Stereotactic Injection for Brain Specific Knockdown of miRNA

miRNAの脳特異的ノックダウンのための定位注射への単純な代替

MicroRNAs (miRNAs) are key regulators of gene expression.  In the brain, vital processes like neurodevelopment and neuronal functions depend on the ...

Endoscopic Endonasal Trans-sphenoidal Approach: Minimally Invasive Surgery for Pituitary Adenomas

内視鏡内視鏡下鼻内のトランス蝶アプローチ: 下垂体腺腫に対する低侵襲手術

Endoscopic endonasal trans-sphenoidal surgery has become the gold standard for the surgical treatment of pituitary adenomas and many other pituitary ...

Stereotactic Atlas-Guided Laser Capture Microdissection of Brain Regions Affected by Traumatic Injury

外傷によって影響を受ける脳のレーザーキャプチャーマイクロダイ セクション定位アトラス誘導レーザー

The ability to isolate specific brain regions of interest can be impeded in tissue disassociation techniques that do not preserve their spatial ...

A Simple Approach to Induce Experimental Autoimmune Neuritis in C57BL/6 Mice for Functional and Neuropathological Assessments

機能と神経病理学的評価の c57bl/6 マウスの実験的自己免疫性視神経炎を誘導するための単純なアプローチ

Experimental autoimmune neuritis (EAN) is a well-appreciated experimental model of autoimmune peripheral demyelinating diseases. EAN disease is induced by ...