Name: adaptable angled stereotactic approach for versatile neuroscience techniques
Uploaded: 2020-05-07T13:30:00
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Este trabajo fue apoyado por las subvenciones del Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas y Renales (NIDDK) F31-DK-113673 (C.L.F.), T32-GM-095421 (C.L.F.), DK-089056 (G.J.M.), un Premio de Ciencia Básica Innovadora de la Asociación Americana de Diabetes (#1-19-IBS-192 a G.J.M.) y el Centro de Investigación de obesidad nutricional financiado por NIDDK (DK-035816), el Centro de Investigación de Diabetes (DK-017047) y Diabetes, Beca de entrenamiento en obesidad y metabolismo T32 DK0007247 (T.H.M) en la Universidad de Washington.

Todos los procedimientos fueron aprobados de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud, la Guía para el Cuidado y Uso de Animales y fueron aprobados tanto por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) como por Salud y Seguridad Ambiental de la Universidad de Washington.
1. Cálculo de coordenadas en ángulo
<ol><li>Usando un atlas cerebral coronal, marque un triángulo rectángulo para que la hipotenusa pase a través de la región objetivo de interés. En el ejempl...

<ol>
	<li>King, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rise,+fall,+and+resurrection+of+the+ventromedial+hypothalamus+in+the+regulation+of+feeding+behavior+and+body+weight.">The rise, fall, and resurrection of the ventromedial hypothalamus in the regulation of feeding behavior and body weight.</a> Physiology and Behavior. 87, 221-244 (2006).</li><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale,+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).</li><li>Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DREADDs+for+Neuroscientists.">DREADDs for Neuroscientists.</a> Neuron. 89, 683-694 (2016).</li><li>Richevaux, L., Schenberg, L., Beraneck, M., Fricker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Intracerebral+Stereotaxic+Injections+for+Optogenetic+Stimulation+of+Long-Range+Inputs+in+Mouse+Brain+Slices.">In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices.</a> Journal of Visualized Experiments. , e59534 (2019).</li><li>Fricano-Kugler, C. J., Williams, M. R., Luikart, B., Salinaro, J. R., Li, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing,+packaging,+and+delivery+of+high+titer+crispr+retro+and+lentiviruses+via+stereotaxic+injection.">Designing, packaging, and delivery of high titer crispr retro and lentiviruses via stereotaxic injection.</a> Journal of Visualized Experiments. , e53783 (2016).</li><li>McSweeney, C., Mao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applying+Stereotactic+Injection+Technique+to+Study+Genetic+Effects+on+Animal+Behaviors.">Applying Stereotactic Injection Technique to Study Genetic Effects on Animal Behaviors.</a> Journal of Visualized Experiments. (99), e52653 (2015).</li><li>Lowell, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Neuroscience+of+Homeostasis+and+Drives+for+Food,+Water,+and+Salt.">New Neuroscience of Homeostasis and Drives for Food, Water, and Salt.</a> New England Journal of Medicine. 380, 459-471 (2019).</li><li>Sidor, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+optogenetic+stimulation+of+the+rodent+central+nervous+system.">In vivo optogenetic stimulation of the rodent central nervous system.</a> Journal of Visualized Experiments. , e51483 (2015).</li><li>Faber, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Neuronal+Projections+from+the+Hypothalamic+Ventromedial+Nucleus+Mediate+Glycemic+and+Behavioral+Effects.">Distinct Neuronal Projections from the Hypothalamic Ventromedial Nucleus Mediate Glycemic and Behavioral Effects.</a> Diabetes. 67, 2518-2529 (2018).</li><li>Berndt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+foundations+of+optogenetics:+Determinants+of+channelrhodopsin+ion+selectivity.">Structural foundations of optogenetics: Determinants of channelrhodopsin ion selectivity.</a> Proceedings of the National Academy of Scences. 113, 822-829 (2016).</li><li>Faber, C. L., Matsen, M. E., Meek, T. H., Krull, J. E., Morton, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+customizable+procedure+for+angled+stereotaxic+implantation+and+microinjection+in+the+rodent+brain.">A customizable procedure for angled stereotaxic implantation and microinjection in the rodent brain.</a> Kopf Carrier. 96, (2019).</li><li>Correia, P., Matias, S., Mainen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereotaxic+Adeno-associated+Virus+Injection+and+Cannula+Implantation+in+the+Dorsal+Raphe+Nucleus+of+Mice.">Stereotaxic Adeno-associated Virus Injection and Cannula Implantation in the Dorsal Raphe Nucleus of Mice.</a> Bio-Protocol. 7, 2549 (2017).</li><li>Cardozo Pinto, D. F., Lammel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hot+topic+in+optogenetics:+new+implications+of+in+vivo+tissue+heating.">Hot topic in optogenetics: new implications of in vivo tissue heating.</a> Nature Neuroscience. 22, 1039-1041 (2019).</li></ol>

Los avances recientes en neurociencia han apoyado la comprensión y la comprensión avanzadas de la actividad y la función de los neurocircuitos cerebrales. Esto incluye la aplicación de tecnologías optogenéticas y quimiogenéticas para activar o silenciar poblaciones neuronales discretas y sus sitios de proyección in vivo. Más recientemente, esto ha incluido el desarrollo de indicadores de calcio codificados genéticamente (por ejemplo, GCaMP, RCaMP) y otros biosensores fluorométricos (por ejemplo, dopamina, nore...

El control neuronal del comportamiento, la alimentación y el metabolismo implica la coordinación de neurocircuitos altamente complejos, integradores y redundantes. Un objetivo impulsor del campo de la neurociencia es diseccionar la relación entre la estructura y la función del circuito neuronal. Aunque las herramientas clásicas de neurociencia (es decir, lesiones, inyecciones farmacológicas locales y estimulación eléctrica) han descubierto un conocimiento vital sobre el papel de regiones cerebrales específicas que controlan el comportamiento y el metabolismo, estas herramientas están limitadas por su falta de especificidad y reversibilidad1.
Los avances recientes en el campo de la neurociencia han mejorado en gran medida la capacidad de interrogar y manipular la función del circuito de una manera específica de tipo celular con alta resolución espaciotemporal. Los enfoques optogenético2 y quimiogenético3, por ejemplo, permiten la manipulación rápida y reversible de la actividad en tipos de células genéticamente definidas de animales que se mueven libremente. La optogenética implica el uso de canales iónicos sensibles a la luz, denominados canalrhodopsinas, para controlar la actividad neuronal. La clave de esta técnica es la entrega génica de canalrhodopsina y una fuente de luz para activar la opsina. Una estrategia común para la entrega de genes es a través de una combinación de 1) ratones genéticamente modificados que expresan Cre-recombinasa en neuronas discretas, y 2) vectores virales dependientes de Cre que codifican canalrhodopsina.
Si bien la optogenética proporciona un medio elegante y altamente preciso para controlar la actividad neuronal, el método depende de la microinyección estereotáctica exitosa del vector viral y la colocación de fibra óptica en una región cerebral definida. Aunque los procedimientos estereotácticos son comunes dentro del laboratorio de neurociencia moderno (y hay varios protocolos excelentes que describen este procedimiento)4,5,6, ser capaz de dirigirse de manera consistente y reproducible a regiones cerebrales discretas a lo largo de la línea media (es decir, el hipotálamo mediobasal, un área del cerebro crítica para la regulación de las funciones homeostáticas7)presenta desafíos adicionales. Estos desafíos incluyen evitar el seno sagital superior, el tercer ventrículo y los núcleos hipotalámicos adyacentes. Además, existen limitaciones espaciales significativas para la implantación bilateral de hardware que se requiere para los estudios de inhibición. Con estos desafíos en mente, este protocolo presenta un procedimiento modificable para apuntar a regiones cerebrales discretas a través de un enfoque estereotáctico en ángulo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fiberoptic Cannulae</td>
			<td>Doric Lenses</td>
			<td>MFC_200/230-0.57_###_MF1.25_FLT</td>
			<td>Customizable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kopf Model 1900 Stereotaxic Alignment System</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>Model 1900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kopf Model 1900-51 Center Height Gauge</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>Model 1900-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kopf Model 1905 Alignment Indicator</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>Model 1905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kopf Model 1911 Stereotaxic Drill</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>Model 1911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kopf Model 1915 Centering Scope</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>Model 1915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kopf Model 1922 60-Degree Non-Rupture Ear Bars</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>Model 1922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kopf Model 1923-B Mouse Gas Anesthesia Head Holder</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>Model 1923-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kopf Model 1940 Micro Manipulator</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>Model 1940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro4 Microinjection System</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse bone screws</td>
			<td>Plastics One</td>
			<td>00-96 X 1/16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic Cannula Holder, 1.25mm ferrule</td>
			<td>Thor Labs</td>
			<td>XCL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Drill</td>
			<td>Cell Point Scientific</td>
			<td>Ideal Micro Drill</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

adaptable angled stereotactic approach for versatile neuroscience techniques

La cirugía estereotáctica es una herramienta esencial en el laboratorio de neurociencia moderno. Sin embargo, la capacidad de apuntar con precisión y precisión a regiones cerebrales difíciles de alcanzar todavía presenta un desafío, particularmente cuando se dirigen a estructuras cerebrales a lo largo de la línea media. Estos desafíos incluyen evitar el seno sagital superior y el tercer ventrículo y la capacidad de dirigirse consistentemente a núcleos cerebrales selectivos y discretos. Además, las técnicas de neurociencia más avanzadas (por ejemplo, optogenética, fotometría de fibra e imágenes de dos fotones) se basan en la implantación dirigida de hardware significativo para el cerebro, y las limitaciones espaciales son un obstáculo común. Aquí se presenta un protocolo modificable para la orientación estereotáctica de las estructuras cerebrales de roedores utilizando un enfoque coronal en ángulo. Se puede adaptar a 1) modelos de ratón o rata, 2) varias técnicas de neurociencia y 3) múltiples regiones cerebrales. Como ejemplo representativo, incluye el cálculo de coordenadas estereotácticas para la orientación del núcleo ventromedial hipotalámico de ratón (VMN) para un experimento de inhibición optogenética. Este procedimiento comienza con la microinyección bilateral de un virus adenoasociado (AAV) que codifica un canal de cloruro sensible a la luz (SwiChR ++) a un modelo de ratón dependiente de Cre, seguido de la implantación bilateral en ángulo de cánulas de fibra óptica. Usando este enfoque, los hallazgos muestran que la activación de un subconjunto de neuronas VMN es necesaria para las respuestas contrarreguladoras de glucosa intacta a la hipoglucemia inducida por insulina.

Este protocolo describe un procedimiento quirúrgico para la realización de estudios optogenéticos para interrogar el papel de las neuronas VMN hipotalámicas en el control glucémico9. El primero utilizado fue un enfoque estereotáctico estándar (no en ángulo) para la microinyección bilateral de un virus inhibidor de la canalropsina al VMN. Si bien un enfoque en ángulo también sería adecuado, se seleccionó el enfoque estándar (no en ángulo) porque es suficiente para apuntar a la regió...

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Adaptable Angled Stereotactic Approach for Versatile Neuroscience Techniques

Aquí se describe un procedimiento estereotáctico que puede apuntar a regiones cerebrales desafiantes y difíciles de alcanzar (debido a limitaciones espaciales) utilizando un enfoque coronal en ángulo. Este protocolo es adaptable tanto a modelos de ratón como de rata y se puede aplicar a diversas aplicaciones neurocientíficas, incluida la implantación de cánulas y microinyecciones de construcciones virales.

Enfoque estereotáctico en ángulo adaptable para técnicas versátiles de neurociencia

Stereotactic surgery is an essential tool in the modern neuroscience lab. However, the ability to precisely and accurately target difficult-to-reach brain ...

This protocol is significant as it is an adaptable, stereotactic procedure that can be utilized in both mice and rats, and can be applied to many new neuroscientific techniques. The main advantage of this adaptable stereotactic procedure is it's ability to be used to target challenging and difficult-to-reach regions of the brain. Demonstrating the procedure will be Chelsea Faber, a young, talented post-doctoral research fellow in the laboratory.After confirming that the frame and micromanipulator have been calibrated, place the center height gauge into the socket of the head holder baseplate. Secure the centering scope in the tool holder and sight down the scope. Adjust the position of the micromanipulator until the crosshairs are aligned and focused on the gauge crosshairs, and place the ear bars into the holders such that the indicator lines on both sides are at zero.Use the medial-lateral and anterior-posterior knobs on the head holder to centerline the ear bars in the X and Y planes above the crosshair of the center height gauge. To align the ear bar position in the Z-axis, remove the ear bars from the holder and remove the center height gauge. Then, replace the ear bars and re-center the bars at zero.Then, sight down the scope again, and use the vertical shift and coronal tilt knobs respectively to lower and rotate the ear bars until the scope crosshairs remain centered between the ear bars throughout coronal rotation. To align the central axis of rotation for angled coordinates, secure the centering scope in the tool holder and position the micromanipulator to the calculated coordinate. Note that the right/left coordinate for the angled implantation corresponds to the length of side A.Sighting down the scope, mark this coordinate to represent the point at which the cannula will enter the brain, once the head is rotated.Reposition the micromanipulator over the midline, and use the coronal tilt knob to rotate the head to the calculated angle. If the scope crosshairs do not line up with the reference mark, use the vertical shift knob to adjust the head position in the Z-axis until the crosshairs line up as close as possible to the mark. At this point, the arbitrary point of rotation should be aligned with the center of rotation of the stereotax.Rotate the head back to the zero degree coronal position before proceeding to subsequent drilling and microinjection steps. After performing the microinjection, return the head to the zero degree level position, and use a hand drill to place two holes, anteriorly, and two holes, posteriorly, far enough from the angled coordinate burr holes to accommodate the ferrule portion of the fiberoptic that sits above the skull. When all of the holes have been drilled, use a small flathead screwdriver to insert the bone screws as gently as possible, such that they sit firmly in the skull without penetrating the brain.Clamp a fiberoptic cannula into the cannula holder, and place the cannula holder in the tool holder. Rotate the head to the calculated angle, noting that the coordinates of the micromanipulator do not apply to the new tool. Use the center of the angled burr holes as the implantation target.Lower the fiber optic until it just touches the dura within the center of the burr hole, and zero the micromanipulator in the Z-axis. Slowly lower the fiberoptic to the dorsal ventral angled coordinate, then use cyanoacrylate gel to connect the fiber optic ferrule to the ipsilateral anchor screws. Use a micropipette tip to apply an accelerant.Once the gel has completely hardened, gently loosen and raise the cannula holder until it is clear of the ferrule. Implant the second fiberoptic to the contralateral angled coordinate, then level the head. For extra security, use the cyanoacrylate gel and accelerant to make an additional connection between the two angled fiberoptic cannulas, and apply a small, relatively thin amount of dental cement to the surface of the skull, taking care to thoroughly cover the anchor screws and the base of the fiberoptic cannulas.To interrogate the role of hypothalamus ventromedial nucleus neurons in glycemic control, in this representative analysis, a standard, non-angled, stereotactic approach was utilized for the bilateral microinjection of an inhibitory channel rhodopsin virus to the ventromedial nucleus. Given the proximity of the ventromedial nucleus to the midline, space constraints did not permit a non-angled implantation of bilateral fiberoptics, necessitating the development of a surgical strategy for precisely implanting fiberoptics at an angle. The most important things to remember are to simply be patient and to take your time, as being consistent and accurate with your coordinate assignments is critical to success.This procedure can be adapted and applied to any neuroscientific method requiring microinjection or implantation into the rodent brain, including chemogenetics, optogenetics, and fiber photometry approaches.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Novel Approach for Documenting Phosphenes Induced by Transcranial Magnetic Stimulation

Un nuevo enfoque para la documentación de fosfenos inducida por la estimulación magnética transcraneal

Stimulation of the human visual cortex produces a transient perception of light, known as a phosphene. Phosphenes are induced by invasive electrical ...

Investigación

Neurociencias

High Density Event-related Potential  Data Acquisition in Cognitive Neuroscience

Relacionados con eventos de alta densidad de adquisición de datos posibles en Neurociencia Cognitiva

Functional magnetic resonance imaging (fMRI) is currently the standard method of evaluating brain function in the field of Cognitive Neuroscience, in part ...

Rodent Stereotaxic Surgery and Animal Welfare Outcome Improvements for Behavioral Neuroscience

Cirugía estereotáctica de roedores y mejoras del bienestar de los animales de resultados para la revista Behavioral Neuroscience

Stereotaxic surgery for the implantation of cannulae into specific brain regions has for many decades been a very successful experimental technique to ...

VisioTracker, an Innovative Automated Approach to Oculomotor Analysis

VisioTracker, un enfoque innovador para el análisis automatizado oculomotor

Investigations into the visual system development and function necessitate quantifiable behavioral models of visual performance that are easy to elicit, ...

A Fully Automated and Highly Versatile System for Testing Multi-cognitive Functions and Recording Neuronal Activities in Rodents

Un sistema totalmente automatizado y altamente versátil para las pruebas múltiples funciones cognitivas y el registro de las actividades neuronales en los roedores

We have developed a fully automated system for operant behavior testing and neuronal activity recording by which multiple cognitive brain functions can be ...

Investigating the Function of Deep Cortical and Subcortical Structures Using Stereotactic Electroencephalography: Lessons from the Anterior Cingulate Cortex

La investigación de la función de profunda cortical y estructuras subcorticales Usando estereotáctica Electroencefalografía: Lecciones de la corteza cingulada anterior

Stereotactic Electroencephalography (SEEG) is a technique used to localize seizure foci in patients with medically intractable epilepsy. This procedure ...

A Simple Alternative to Stereotactic Injection for Brain Specific Knockdown of miRNA

Una alternativa sencilla para inyección estereotáctica para el Cerebro Derribo específico de miARN

MicroRNAs (miRNAs) are key regulators of gene expression.  In the brain, vital processes like neurodevelopment and neuronal functions depend on the ...

Endoscopic Endonasal Trans-sphenoidal Approach: Minimally Invasive Surgery for Pituitary Adenomas

Enfoque Endonasal endoscópica trans-esfenoidal: Cirugía mínimamente invasiva para los Adenomas pituitarios

Endoscopic endonasal trans-sphenoidal surgery has become the gold standard for the surgical treatment of pituitary adenomas and many other pituitary ...

Stereotactic Atlas-Guided Laser Capture Microdissection of Brain Regions Affected by Traumatic Injury

Microdisección de captura láser Atlas estereotáctico de regiones del cerebro afectadas por la lesión traumática

The ability to isolate specific brain regions of interest can be impeded in tissue disassociation techniques that do not preserve their spatial ...

A Simple Approach to Induce Experimental Autoimmune Neuritis in C57BL/6 Mice for Functional and Neuropathological Assessments

Un enfoque Simple para inducir Neuritis Autoinmune Experimental en ratones C57BL/6 para las evaluaciones funcionales y Neuropathological

Experimental autoimmune neuritis (EAN) is a well-appreciated experimental model of autoimmune peripheral demyelinating diseases. EAN disease is induced by ...