使用该协议，任何实验室，有一个标准的共和显微镜配备了405纳米激光可以执行头发细胞祖细胞激光消融和监控其再生。与电消融不同，此技术可限制周围细胞的损伤，并且比强大的脉冲紫外激光装置更容易接近。在消融之前和之后，也可以立即进行共声成像。
这项技术使我们能够更好地了解感官祖先的再生行为，这可能有助于开发人类听力损失的疗法。对于安装，首先移液器三到四个麻醉器将幼虫麻醉成一小滴 E3 三分液，放入 35 毫米盘的中心，14 毫米数 1.5 盖滑底。去除多余的溶液，使幼虫保持在一个小液滴中，只要足够大，足以容纳它们。
将盘子放在双目立体显微镜的舞台上。操纵变焦和焦点，使所有幼虫都在视野中，并使用转移移液器在盖滑上添加一层薄薄的农用溶液。去除多余的农产品，直到液体填满盘子底部的井，注意不要吸气任何幼虫。
并使用发刀快速定向幼虫在农业溶液与左角侧。轻轻地将幼虫压在玻璃上，使幼虫在轮廓中，右侧朝下。大约60秒后，农业将开始凝固，幼虫将无法重新定向。
五分钟后，使用转移移液器将菜填到一半，并辅以 1X 三环。要定位潜在目标，请打开激光扫描共声显微镜系统的电源，并通过集成成像软件初始化激光。选择 63X 计划-阿波奇罗马特油浸入目标，并在镜头上涂抹浸入油。
将盘子固定在圆形阶段插入中，幼虫的左面的栖息面。使用亮场或差分干扰对比度照明，选择其中一个安装的幼虫进行成像，并使用对焦旋钮将最接近盖的鱼侧的皮肤滑入对焦。切换到 GFP 通道中的荧光照明，然后通过 GFP 表达式沿水平月体定位后侧线。
荧光细胞环表示神经瘤地衣细胞，拉长的细胞链是内神经瘤细胞。从第一个迁移的原神经瘤开始，使用舞台控制操纵杆沿水平月体目目扫描。跟随一串内膜细胞，直到到达第三和第四迁移原神经瘤之间的区域。
如果要对多个幼虫进行成像，请选择位置以设置第一阶段位置。在识别 L3 中的细胞体后，L4 区域切换到采集模式并使用适当的激光激活 GFP 成像轨迹。要将传输的光通道添加到激活的激光轨道，请单击成像设置下拉菜单中的 T-PMT 框。
要对 ET20 幼虫进行成像，请选择 488 纳米激光器，将激光功率设置为 6%，针孔大小为 1 个面积单位等效，数字增益设置为 750。调整增益，使细胞体饱和，以捕获原本昏暗的投影和纤维。将帧大小设置为 1，024 x 1，024 像素，平均设置为 2，将数字变焦设置为 0.7。
选中 Z 堆栈框以显示 Z 位置下拉菜单。在快速扫描时，聚焦，直到内胚细胞刚刚对焦，并设置第一片。聚焦通过样品，直到内胚细胞再次出焦点，并设置最后一片。
然后单击"停止"并单击"开始实验"以捕获预消融 Z 堆栈。如果已添加阶段位置，则停用位置选项，以便仅对当前位置进行图像化，并在捕获文件后保存该文件。要对目标细胞体进行激光消融，请单击"在采集界面"和"成像设置"菜单中显示所有工具，选择添加新轨道。
单击染料并选择 DAPI。在通道下，选择 405 进行激光设置，将激光功率提高至 75% 取消点击 DAPI 通道以关闭激光，同时扫描候选细胞体进行消融。单击"实时"，将位于视场中的内膜细胞体放大到 20 到 22 倍。
一旦单元格正文填满视场，请立即停止实时扫描。检查 405 纳米激光快门盒以激活轨道并设置计时器 45 秒。然后，激活连续扫描并启动计时器。
在 45 秒内立即停止扫描。对于消融后细胞体成像，在通道菜单下，松开 DAPI 轨道以灭活消融激光并打开采集模式菜单。单击缩放，将缩放减小至 0.7。
要评估细胞消融的成功，请快速扫描视场。使用与消融前成像相同的设置，捕获并保存消融后图像。检查透光光倍增管通道图像，以进一步确认细胞损坏。
受损的细胞将表现出颗粒状的外观，核将经常膨胀或出现不规则的形状。要评估消融后细胞体恢复，请激活延时图像捕获的阶段位置和时间选项，并设置时间参数到适当的实验时间点和 15 分钟间隔。然后，开始实验以获取图像并在完成后保存生成的文件。
在这个代表性实验中，确定了位于第三和第四迁移的原神经瘤之间的横向线区域，并捕获了消融前图像。消融后扫描证实，在消融区域没有细胞体。在相邻的内胚细胞的拉长投影之间留下间隙。
对消融后透光光倍管通道的分析，揭示了受损和垂死的细胞。以肿胀和不规则形状的核和颗粒外观为标志。也可以观察到可能为巨噬细胞的大型类腺细胞的招募。
在这个实验中，双转基因幼虫中几个细胞的消融在内皮瘤细胞串中产生了相当大的间隙，但对横向线神经的影响很小或没有。激光消融后，可以测量间隙大小。范围从几微米到100微米不等，取决于单个神经瘤细胞的宽度和选择多少细胞进行消融。
消融后，一些内胚细胞在成像后最初几个小时内恢复。与间隙闭合的概率与间隙大小负相关。即使在无法恢复的内神经瘤细胞中，也可以观察到从邻近的内神经瘤细胞形成长投影，这种投影可以类似于延伸的神经元生长锥体。
必须彻底检查T-PMT通道中受损的细胞是否呈现不规则形状的核和粒度，并允许有足够的时间使这些细胞死亡指标可见。进一步分析由此产生的延时显微镜数据，有可能揭示激光消融引起的新的细胞行为，并指导开发用于识别再生调节器的实验。这项技术使我们能够通过提供一种快速且具有成本效益的方法选择性地破坏这些细胞，从而研究内膜细胞再生的分子调节器。
