5.6K Views
•
11:17 min
•
May 20th, 2020
DOI :
May 20th, 2020
•0:04
Introduction
0:42
Larva Mounting
2:16
Prospective Target Location
4:02
Pre-Ablation Imaging
5:49
Laser Ablation
7:03
Post-Ablation Imaging and Regeneration Time-Lapse Microscopy
8:25
Results: Representative Interneuromast Cell (INMC) Ablation Imaging and Gap Measurement
10:23
Conclusion
Transcript
Ved hjælp af denne protokol, enhver lab, der har en standard konfokal mikroskop udstyret med en 405 nanometer laser kan udføre hårcelle stamfader laser ablations og overvåge deres regenerering. I modsætning til elektro-ablation, begrænser denne teknik omkringliggende celler og er mere tilgængelig end en kraftfuld pulserende UV laser setup. Konfokal billeddannelse kan også udføres umiddelbart før og efter ablation.
Denne teknik gør det muligt for os bedre at forstå sensoriske forfædres regenerative adfærd, hvilket kan hjælpe med at udvikle behandlinger for høretab hos mennesker. Til montering, første pipette tre til fire bedøve larver i en lille dråbe E3 tricain opløsning i midten af 35 millimeter parabol, med en 14 millimeter nummer 1,5 dække slip bund. Fjern den overskydende opløsning, så larverne forbliver i en lille dråbe lige stor nok til at indeholde dem.
Og læg skålen på scenen af et kikkertstermikroskop. Manipuler zoom og fokus, så alle larver er i synsfeltet og bruge en overførsel pipette til at tilføje et tyndt lag agro-løsning på dækslet slip. Fjern den overskydende agros indtil væsken bare fylder godt i bunden af skålen, passe på ikke at aspirere nogen larver.
Og brug en hårkniv til hurtigt at orientere larverne i agroopløsningen med rostralsiden vendt mod venstre. Tryk forsigtigt larverne ned mod glasset, så larverne ligger i profil med højre side nedad. Efter ca. 60 sekunder begynder agroserne at størkne, og larverne vil ikke kunne omlægges.
Efter fem minutter, bruge en overførsel pipette til at fylde skålen halvvejs med E3 suppleret med 1X tricain. For at finde potentielle mål, tænde for strømmen til laserscanning konfokale mikroskopi system og initialisere laseren gennem den integrerede billedbehandling software. Vælg målet for 63X Plan-Apochromat olienedsænkning, og anvend nedsænkningsolie på linsen.
Fastgør skålen i et cirkulært trinindsats med rostralaspektet af larverne vendt mod venstre. Ved hjælp af lys felt eller differens kontrast belysning, skal du vælge en af de monterede larver til billeddannelse og bruge fokus knappen til at bringe huden på siden af fisken tættest på dækslet slip i fokus. Skift til epifluorescerende belysning i GFP-kanalen, og find den bageste laterale linje ved GFP-udtryk langs det vandrette myoseptum.
Ringe af fluorescerende celler er tegn på neuromast kappe celler og aflange dele af celler er interneuromast celler. Begyndende med den første migrerende primordium neuromast, skal du bruge scenen kontrol joystick til visuelt at scanne caudally langs vandret myoseptum. Efter strengen af interneuromast celler, indtil regionen mellem den tredje og fjerde migrerende primordium neuromasts er nået.
Hvis flere larver skal afbildes, skal du vælge position for at indstille den første fase position. Efter celle organer i L3, L4 regionen er blevet identificeret, skifte til erhvervelse mode og bruge en passende laser til at aktivere GFP billedbehandling spor. Hvis du vil føje en transmitteret lyskanal til det aktiverede laserspor, skal du klikke på feltet T-PMT i rullemenuen i billedbehandlingsopsætning.
Hvis du vil afbilde ET20-larver, skal du vælge 488 nanometerlaseren, indstille lasereffekten til 6 % af pinhole-størrelsen til en områdeenhed, der svarer til og den digitale forstærkning til 750. Juster gevinsterne, således at celleorganerne er mættede for at fange ellers dæmpede projektioner og filopodia. Og indstil rammestørrelsen til 1, 024 med 1, 024 pixel, gennemsnit til to og den digitale zoom til 0,7.
Markér feltet Z-stak for at få kortmenuen Z-placering frem. Mens hurtig scanning, fokusere ud, indtil interneuromast celler er lige ude af fokus og indstille den første skive. Fokus gennem prøven, indtil interneuromast cellerne igen er ude af fokus og sæt den sidste skive.
Klik derefter på Stop og klik på start eksperiment for at fange en pre-ablation Z stak. Hvis scenepositionerne er blevet tilføjet, skal du deaktivere indstillingen positioner, så kun den aktuelle position afbildes, og filen gemmes, når den er blevet hentet. Hvis du vil have laserablation af de målrettede celleorganer, skal du klikke på Vis alle værktøjer i anskaffelsesgrænsefladen, og i menuen billedbehandling skal du vælge Tilføj et nyt spor.
Klik på farvestof, og vælg DAPI. Under kanaler skal du vælge 405 for laserindstillingen og øge lasereffekten til 75%Unclick til DAPI-kanalen for at slukke for laseren, mens du scanner for kandidatcellekroppe til ablation. Klik live og med kroppen af en interneuromast celle centreret i synsfeltet, zoome ind på scanningsrammen til 20 til 22X.
Stop livescanningen, så snart cellekroppen udfylder synsfeltet. Kontroller 405 nanometer laser lukker boksen for at aktivere sporet og indstille en timer i 45 sekunder. Derefter aktivere kontinuerlig scanning og starte timeren.
Straks at stoppe scanningen på 45 sekunder. Til billeddannelse af celleorganerne efter ablation skal du fjerne klik på DAPI-sporet under kanalmenuen for at deaktivere ablationslaseren og åbne menuen i anskaffelsestilstand. Klik på zoom, og form zoom til 0,7.
Hvis du vil vurdere celleablationens succes, skal du hurtigt scanne synsfeltet. Brug af de samme indstillinger som dem til forablation billeddannelse, fange og gemme en post-ablation billede. Undersøg det transmitterede lysfotomultiplier rørkanalbillede for yderligere at bekræfte den cellulære skade.
Beskadigede celler vil demonstrere et granuleret udseende, og kernerne vil ofte svulme op eller fremstå uregelmæssig i form. For at vurdere post-ablation celle krop opsving, aktivere både fase position og tid muligheder for time-lapse billedoptagelse og indstille tidsparametre til det relevante eksperimentelle tidspunkt og 15 minutter intervaller. Start derefter eksperimentet for at hente billeder og gemme den resulterende fil, når den er færdig.
I dette repræsentative eksperiment blev området mellem den laterale linje, der ligger mellem den tredje og fjerde migrerende primordium neuromasts identificeret og præ-ablation billeder blev fanget. Scanning efter ablation bekræftede, at der ikke var nogen cellekroppe tilbage i det ablerede område. Efterlader et mellemrum mellem de aflange fremskrivninger af de tilstødende interneuromast celler.
Analyse af den overførte lys fotomultiplier rør kanal efter ablation, afslører beskadigede og døende celler. Præget af hævede og uregelmæssigt formede kerner og et granuleret udseende. Rekruttering af store amøbe celler, der er sandsynlige makrofager kan også observeres.
I dette eksperiment skabte ablationen af flere celler i den dobbelte transgene larver betydelige huller i interneuromast cellestrengen, men havde ringe eller ingen effekt på den laterale linjenerven. Efter laser ablation, kan gap størrelser måles. Lige fra blot et par mikron op til 100 mikron, afhængigt af bredden, at de enkelte neuromast celler og hvor mange celler er udvalgt til ablation.
Efter ablation, nogle interneuromast celler inddrive inden for de første mange timer af billeddannelse. Med sandsynligheden for hul lukning negativt korrelerer med gap størrelse. Selv i interneuromast celler, der ikke er i stand til at inddrive dog dannelsen af lange fremskrivninger fra tilstødende interneuromast celler, som kan ligne udvide neuronal vækst kegler kan observeres.
Det er vigtigt at grundigt inspicere T-PMT kanal for beskadigede celler udviser uregelmæssigt formede kerner og granularitet, og at give tilstrækkelig tid til disse indikatorer for celledød at blive synlige. Yderligere analyse af de deraf følgende time-lapse mikroskopi data, kan potentielt afsløre nye cellulære adfærd induceret af laser ablation og kan guide udviklingen af eksperimenter for at identificere regulatorer af regenerering. Denne teknik har gjort det muligt for os at studere de molekylære regulatorer af interneuromast celle regenerering ved at give en hurtig og omkostningseffektiv metode til selektivt at beskadige disse celler.
Laser ablation er en bredt anvendelig teknologi til at studere regenerering i biologiske systemer. Den præsenterede protokol beskriver brugen af et standard laserscanningskonfokalt mikroskop til laserablation og efterfølgende time-lapse-billeddannelse af regenererende interneuromastceller i zebrafisk laterallinjen.
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved