ज़ेब्राफ़िश इंटरन्यूरोमास्ट कोशिकाओं में कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप-आधारित लेजर एब्लेशन और पुनर्जनन परख

इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, किसी भी प्रयोगशाला है कि एक मानक कंफोकल माइक्रोस्कोप एक 405 नैनोमीटर लेजर से लैस है बाल सेल जनक लेजर ablations प्रदर्शन और उनके उत्थान की निगरानी कर सकते हैं। इलेक्ट्रो-एब्लेशन के विपरीत, यह तकनीक आसपास की कोशिकाओं को नुकसान पहुंचाती है और एक शक्तिशाली स्पंदित यूवी लेजर सेटअप की तुलना में अधिक सुलभ है। कन्फोकल इमेजिंग से तुरंत पहले और बाद में भी किया जा सकता है।

यह तकनीक हमें संवेदी जनकों के पुनर्योजी व्यवहार को बेहतर ढंग से समझने में सक्षम बनाती है, जो मानव सुनवाई हानि के लिए उपचारों के विकास में मदद कर सकती है। बढ़ते के लिए, पहले पिपेट तीन से चार एनेस्थेटाइज लार्वा को 35 मिलीमीटर डिश के केंद्र में E3 ट्राइकेन समाधान की एक छोटी बूंद में, 14 मिलीमीटर संख्या 1.5 कवर स्लिप बॉटम के साथ। अतिरिक्त समाधान निकालें ताकि लार्वा उन्हें रोकने के लिए एक छोटी बूंद में बने रहें।

और पकवान को दूरबीन स्टीरियो माइक्रोस्कोप के मंच पर रखें। ज़ूम में हेरफेर करें और ध्यान केंद्रित करें ताकि सभी लार्वा देखने के क्षेत्र में हों और कवर स्लिप पर कृषि-समाधान की एक पतली परत जोड़ने के लिए स्थानांतरण पिपेट का उपयोग करें। अतिरिक्त एग्रोज को तब तक हटा दें जब तक कि तरल डिश के तल पर अच्छी तरह से भर न जाए, किसी भी लार्वा को एस्पिरेट न करने का ध्यान रखें।

और एक बाल चाकू का उपयोग करने के लिए जल्दी से कृषि समाधान में लार्वा उन्मुख के साथ rostral पक्ष का सामना करना पड़ छोड़ दिया है । धीरे-धीरे लार्वा को ग्लास के खिलाफ दबाएं, जैसे कि लार्वा उनके दाहिने पक्षों के साथ प्रोफ़ाइल में झूठ बोलता है। लगभग 60 सेकंड के बाद, एग्रोज जमना शुरू हो जाएगा और लार्वा को फिर से उन्मुख नहीं किया जा सकेगा।

पांच मिनट के बाद, 1X ट्राइकेन के साथ पूरक E3 के साथ आधे रास्ते पकवान को भरने के लिए एक हस्तांतरण पिपेट का उपयोग करें। संभावित लक्ष्यों का पता लगाने के लिए, लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी सिस्टम के लिए शक्ति चालू करें और एकीकृत इमेजिंग सॉफ्टवेयर के माध्यम से लेजर को शुरू करें। 63X प्लान-एपोक्रोमोट ऑयल विसर्जन ऑब्जेक्टिव ऑब्जेक्टिव का चयन करें और लेंस पर विसर्जन ऑयल लगाएं।

बाईं ओर लार्वा के रोस्ट्रल पहलू के साथ एक गोलाकार चरण डालने में पकवान को सुरक्षित करें। उज्ज्वल क्षेत्र या अंतर हस्तक्षेप विपरीत रोशनी का उपयोग करना, इमेजिंग के लिए घुड़सवार लार्वा में से एक का चयन करें और ध्यान में कवर पर्ची के निकटतम मछली के पक्ष में त्वचा लाने के लिए फोकस घुंडी का उपयोग करें। जीएफपी चैनल में एपिफ्लोरोसेंट रोशनी पर स्विच करें और क्षैतिज मायोसेप्टम के साथ जीएफपी अभिव्यक्ति द्वारा पीछे की पार्श्व रेखा का पता लगाएं।

फ्लोरोसेंट कोशिकाओं के छल्ले न्यूरोमास्ट मेंटल कोशिकाओं के संकेत हैं और कोशिकाओं की लम्बी किस्में इंटरन्यूरोमास्ट कोशिकाएं हैं। पहले माइग्रेटिंग प्राइमोडियम न्यूरोमेस्ट से शुरुआत करते हुए, क्षैतिज मायोसेप्टम के साथ नेत्रहीन स्कैन कॉडलाई स्कैन करने के लिए स्टेज कंट्रोल जॉयस्टिक का उपयोग करें। तीसरे और चौथे माइग्रेटिंग प्राइमोडियम न्यूरोमास्ट के बीच के क्षेत्र तक पहुंचने तक इंटरन्यूरोमास्ट कोशिकाओं की स्ट्रिंग के बाद।

यदि कई लार्वा को चित्रित किया जाना है, तो पहले चरण की स्थिति निर्धारित करने के लिए स्थिति का चयन करें। L3 में सेल निकायों के बाद, L4 क्षेत्र की पहचान की गई है, अधिग्रहण मोड पर स्विच करें और जीएफपी इमेजिंग ट्रैक को सक्रिय करने के लिए एक उपयुक्त लेजर का उपयोग करें। सक्रिय लेजर ट्रैक में एक प्रेषित प्रकाश चैनल जोड़ने के लिए, इमेजिंग सेटअप ड्रॉपडाउन मेनू में टी-पीएमटी बॉक्स पर क्लिक करें।

ET20 लार्वा की छवि के लिए, 488 नैनोमीटर लेजर का चयन करें, लेजर पावर को एक क्षेत्र इकाई समकक्ष और डिजिटल लाभ 750 तक पिनहोल आकार को 6% सेट करें। लाभ को इस तरह समायोजित करें कि सेल निकाय अन्यथा मंद अनुमानों और फिलोडोडिया को पकड़ने के लिए संतृप्त होते हैं। और फ्रेम आकार को 1, 024 पिक्सल तक सेट करें, औसत दो और डिजिटल ज़ूम को 0.7 करें।

जेड स्थिति ड्रॉपडाउन मेनू को लाने के लिए जेड स्टैक बॉक्स की जांच करें। तेजी से स्कैनिंग करते समय, तब तक ध्यान केंद्रित करें जब तक कि इंटरन्यूरोमास्ट कोशिकाएं ध्यान से बाहर न हों और पहला टुकड़ा सेट न करें। नमूने के माध्यम से ध्यान केंद्रित करें जब तक कि इंटरन्यूरोमास्ट कोशिकाएं एक बार फिर ध्यान से बाहर न हों और अंतिम टुकड़ा सेट न करें।

फिर स्टॉप पर क्लिक करें और प्री-एब्लेशन जेड स्टैक कैप्चर करने के लिए स्टार्ट एक्सपेरिमेंट पर क्लिक करें। यदि चरण की स्थिति जोड़ दी गई है, तो पदों के विकल्प को निष्क्रिय करें ताकि केवल वर्तमान स्थिति को चित्रित किया जा सके और एक बार कैप्चर किए जाने के बाद फ़ाइल को सहेजें। लक्षित सेल निकायों के लेजर एब्लेशन के लिए, अधिग्रहण इंटरफ़ेस में और इमेजिंग सेटअप मेनू में सभी उपकरणों को दिखाने पर क्लिक करें, एक नया ट्रैक जोड़ें।

डाई पर क्लिक करें और DAPI का चयन करें। चैनलों के तहत, लेजर सेटिंग के लिए 405 का चयन करें और लेजर पावर को 75% तक बढ़ाएं डीएपीआई चैनल को बंद करने के लिए लेजर को बंद करें, जबकि एब्लेशन के लिए उम्मीदवार सेल निकायों के लिए स्कैनिंग करें। लाइव पर क्लिक करें और देखने के क्षेत्र में केंद्रित एक इंटरन्यूरोमास्ट सेल के शरीर के साथ, स्कैनिंग फ्रेम में 20 से 22X तक ज़ूम करें।

जैसे ही सेल बॉडी को देखने का मैदान भरता है लाइव स्कैनिंग बंद कर दें। ट्रैक को सक्रिय करने के लिए 405 नैनोमीटर लेजर शटर बॉक्स की जांच करें और 45 सेकंड के लिए एक टाइमर सेट करें। इसके बाद लगातार स्कैनिंग एक्टिवेट करें और टाइमर शुरू करें।

तुरंत 45 सेकंड पर स्कैनिंग रोक। चैनलों के मेनू के तहत सेल निकायों के बाद, इमेजिंग के लिए, एब्लेशन लेजर को निष्क्रिय करने और अधिग्रहण मोड मेनू खोलने के लिए DAPI ट्रैक को खोलना। ज़ूम पर क्लिक करें और ज़ूम को 0.7 तक कम करें।

सेल एब्लेशन की सफलता का आकलन करने के लिए, तेजी से देखने के क्षेत्र को स्कैन करें। प्री-एब्लेशन इमेजिंग के लिए समान सेटिंग्स का उपयोग करना, पोस्ट-एब्लेशन इमेजिंग को कैप्चर और सेव करना। सेलुलर क्षति की पुष्टि करने के लिए प्रेषित प्रकाश फोटोमल्टीप्लायर ट्यूब चैनल छवि का निरीक्षण करें।

क्षतिग्रस्त कोशिकाएं एक दानेदार उपस्थिति प्रदर्शित करेंगी और नाभिक अक्सर प्रफुल्लित हो जाएगा या आकार में अनियमित दिखाई देगा। पोस्ट-एब्लेशन सेल बॉडी रिकवरी का आकलन करने के लिए, समय-चूक छवि कैप्चर के लिए चरण की स्थिति और समय विकल्प दोनों को सक्रिय करें और उचित प्रयोगात्मक समय बिंदु और 15 मिनट के अंतराल पर समय मापदंड निर्धारित करें। फिर, छवियों को प्राप्त करने और पूरा होने पर परिणामी फ़ाइल को सहेजने के लिए प्रयोग शुरू करें।

इस प्रतिनिधि प्रयोग में, तीसरे और चौथे प्रवासी प्राइमोडियम न्यूरोमास्त के बीच स्थित पार्श्व रेखा के क्षेत्र की पहचान की गई और पूर्व-एब्लेशन छवियों को कैप्चर किया गया। पोस्ट-एब्लेशन स्कैनिंग ने इस बात की पुष्टि की कि कोई सेल निकाय एब्लेटेड क्षेत्र में नहीं रहे । आसन्न इंटरन्यूरोमास्ट कोशिकाओं के लम्बी अनुमानों के बीच एक अंतर छोड़ना।

एब्लेशन के बाद प्रेषित प्रकाश फोटोमल्टीप्लायर ट्यूब चैनल का विश्लेषण, क्षतिग्रस्त और मरने वाली कोशिकाओं का पता चलता है। सूजन और अनियमित आकार के नाभिक और एक दानेदार उपस्थिति से चिह्नित। बड़े अमीबाइड कोशिकाओं की भर्ती जो संभावित मैक्रोफेज हैं, भी देखी जा सकती हैं।

इस प्रयोग में, डबल ट्रांसजेनिक लार्वा में कई कोशिकाओं के एब्लेशन ने इंटरन्यूरोमास्ट कोशिकाओं के तार में बड़े पैमाने पर अंतराल पैदा किए, लेकिन पार्श्व रेखा तंत्रिका पर बहुत कम या कोई प्रभाव नहीं पड़ा। लेजर एब्लेशन के बाद, गैप आकार को मापा जा सकता है। 100 माइक्रोन तक बस कुछ माइक्रोन से लेकर, चौड़ाई के आधार पर कि व्यक्तिगत न्यूरोमास्ट कोशिकाओं और कितने कोशिकाओं को एब्लेशन के लिए चुना जाता है।

एब्लेशन के बाद, कुछ इंटरन्यूरोमास्ट कोशिकाएं इमेजिंग के पहले कई घंटों के भीतर ठीक हो जाते हैं। गैप क्लोजर की संभावना के साथ नकारात्मक रूप से गैप आकार के साथ सहसंबंधित है। यहां तक कि इंटरन्यूरोमास्ट कोशिकाओं में जो ठीक नहीं हो पाते हैं, पड़ोसी इंटरन्यूरोमास्ट कोशिकाओं से लंबे अनुमानों का गठन, जो न्यूरोनल विकास शंकु का विस्तार करने जैसा हो सकता है, देखा जा सकता है।

अनियमित आकार के नाभिक और दानेदारता का प्रदर्शन करने वाली क्षतिग्रस्त कोशिकाओं के लिए टी-पीएमटी चैनल का अच्छी तरह से निरीक्षण करना महत्वपूर्ण है, और सेल मृत्यु के इन संकेतकों को दिखाई देने के लिए पर्याप्त समय की अनुमति देना महत्वपूर्ण है। परिणामस्वरूप समय चूक माइक्रोस्कोपी डेटा के आगे विश्लेषण, संभवतः लेजर ablation द्वारा प्रेरित उपन्यास सेलुलर व्यवहार प्रकट कर सकते है और उत्थान के नियामकों की पहचान करने के लिए प्रयोगों के विकास का मार्गदर्शन कर सकते हैं । इस तकनीक ने हमें इन कोशिकाओं को चुनिंदा रूप से नुकसान पहुंचाने के लिए एक तेजी से और लागत प्रभावी विधि प्रदान करके इंटरन्यूरोमास्ट सेल पुनर्जनन के आणविक नियामकों का अध्ययन करने में सक्षम बनाया है।