5.6K Views
•
11:17 min
•
May 20th, 2020
DOI :
May 20th, 2020
•0:04
Introduction
0:42
Larva Mounting
2:16
Prospective Target Location
4:02
Pre-Ablation Imaging
5:49
Laser Ablation
7:03
Post-Ablation Imaging and Regeneration Time-Lapse Microscopy
8:25
Results: Representative Interneuromast Cell (INMC) Ablation Imaging and Gap Measurement
10:23
Conclusion
Transcript
Ved hjelp av denne protokollen, noen lab som har en standard confocal mikroskop utstyrt med en 405 nanometer laser kan utføre hårcelle stamcelle stamcelle laserablasjoner og overvåke deres regenerering. I motsetning til elektro-ablasjon begrenser denne teknikken skader omkringliggende celler og er mer tilgjengelig enn et kraftig pulserende UV-laseroppsett. Konfokal bildebehandling kan også utføres umiddelbart før og etter ablasjon.
Denne teknikken gjør oss i stand til å bedre forstå den regenerative oppførselen til sensoriske forfedre, noe som kan bidra til utviklingen av terapier for menneskelig hørselstap. For montering, første pipette tre til fire bedøve larver i en liten dråpe E3 trikain løsning inn i midten av 35 millimeter parabolen, med en 14 millimeter nummer 1,5 deksel slip bunnen. Fjern overflødig løsning slik at larvene forblir i en liten dråpe akkurat stor nok til å inneholde dem.
Og legg parabolen på scenen av et kikkert stereomikroskop. Manipuler zoomen og fokuser slik at alle larver er i synsfeltet og bruker en overføringpipette for å legge til et tynt lag med agro-løsning på dekselslipp. Fjern overflødig agros til væsken bare fyller brønnen på bunnen av parabolen, og ikke bry deg om å aspirere noen larver.
Og bruk en hårkniv til raskt å orientere larver i agro-løsningen med rostralsiden vendt mot venstre. Trykk forsiktig larvene ned mot glasset, slik at larvene ligger i profil med sine høyre sider vendt ned. Etter ca 60 sekunder vil agros begynne å stivne og larvene vil ikke kunne reorientert.
Etter fem minutter, bruk en overføring pipette for å fylle parabolen halvveis med E3 supplert med 1X trikain. For å finne potensielle mål, slå på strømmen til laserskanning konfokal mikroskopi system og initialisere laseren gjennom den integrerte bildebehandling programvare. Velg 63X Plan-Apochromat olje nedsenking mål og bruke nedsenking olje på linsen.
Fest parabolen i et sirkulært trinninnlegg med rostralaspektet av larver vendt mot venstre. Bruk lyst felt eller differensial interferenskontrastbelysning, velg en av de monterte larver for avbildning og bruk fokusknappen for å bringe huden på siden av fisken nærmest dekselet i fokus. Bytt til epifluorescerende belysning i GFP-kanalen og finn den bakre laterale linjen ved GFP-uttrykk langs det horisontale myoseptumet.
Ringer av fluorescerende celler er et tegn på de nevromast mantelceller og langstrakte tråder av celler er de interneuromastcellene. Fra og med den første migrerende primordiumnevvmast, bruk scenekontrolljoysticken til å visuelt skanne caudally langs det horisontale myoseptumet. Etter strengen av interneuromast celler til regionen mellom tredje og fjerde migrerende primordium neuromasts er nådd.
Hvis flere larver skal avbildes, velger du posisjon for å angi første trinns posisjon. Når cellelegemer i L3, L4-regionen er identifisert, bytter du til oppkjøpsmodus og bruker en passende laser til å aktivere GFP-bildesporingssporet. Hvis du vil legge til en overført lyskanal i det aktiverte lasersporet, klikker du på T-PMT-boksen i rullegardinmenyen for bildeoppsett.
For å bilde ET20 larver, velg 488 nanometer laser, sett laserkraften til 6% pinholestørrelsen til ett områdeenhet tilsvarende og den digitale gevinsten til 750. Juster gevinsten slik at cellelegemene er mettet for å fange ellers dim projeksjoner og filopodia. Og sett bildestørrelsen til 1, 024 med 1, 024 piksler, snittet til to og den digitale zoomen til 0,7.
Merk av i Z-stakkboksen for å få opp rullegardinmenyen Z-posisjon. Mens rask skanning, fokuser ut til de interneuromastcellene er bare ute av fokus og sett den første skiven. Fokuser gjennom prøven til de interneuromastcellene igjen er ute av fokus og sett den siste skiven.
Klikk deretter stopp og klikk start eksperiment for å fange en pre-ablation Z-stabel. Hvis trinnposisjonene er lagt til, deaktiverer du posisjoner-alternativet slik at bare gjeldende posisjon er avbildet og lagrer filen når den er tatt. For laserablasjon av de målrettede cellelegemene klikker du vis alle verktøyene i oppkjøpsgrensesnittet, og i bildeoppsettmenyen velger du legg til et nytt spor.
Klikk fargestoff, og velg DAPI. Under kanaler velger du 405 for laserinnstillingen og øker lasereffekten til 75%Unclick DAPI-kanalen for å slå av laseren mens du skanner etter kandidatcellelegemer for ablasjon. Klikk live og med kroppen av en internuromast celle sentrert i synsfeltet, zoom inn i skannerammen til 20 til 22X.
Stopp den direktesendte skanningen så snart cellekroppen fyller visningsfeltet. Kontroller 405 nanometer laserlukkerboksen for å aktivere sporet og stille inn en timer i 45 sekunder. Deretter aktiverer du kontinuerlig skanning og starter tidtakeren.
Umiddelbart stoppe skanningen på 45 sekunder. For avbildning av cellelegemene etter ablasjon, under kanalmenyen, kan du koble fra DAPI-sporet for å deaktivere ablasjonslaseren og åpne menyen for anskaffelsesmodus. Klikk zoom og reduser zoomen til 0,7.
Hvis du vil vurdere suksessen til celleablasjonen, skanner du raskt synsfeltet. Bruk de samme innstillingene som for forhåndsavbildningsbilde, ta opp og lagre et post-ablasjonsbilde. Inspiser det overførte lysfotomultiplierrørkanalbildet for å bekrefte mobilskaden ytterligere.
Skadede celler vil demonstrere et detaljert utseende og kjernene vil ofte hovne opp eller virke uregelmessige i form. For å vurdere etter-ablasjon celle kroppsgjenoppretting, aktivere både scenen posisjon og tidsalternativer for time-lapse bildeopptak og sette tidsparametere til riktig eksperimentelle tidspunkt og 15 minutters intervaller. Deretter starter du eksperimentet for å hente bilder og lagre den resulterende filen når den er fullført.
I dette representative eksperimentet ble regionen av sidelinjen plassert mellom tredje og fjerde migrerende primordium neuromasts identifisert og pre-ablasjonsbilder ble tatt. Etter ablasjonsskanning bekreftet at ingen cellelegemer forble i det ablerte området. Etterlater et gap mellom de langstrakte projeksjonene av de tilstøtende interneuromastcellene.
Analyse av den overførte lys photomultiplier tube kanal etter ablasjon, avslører skadede og døende celler. Preget av hovne og uregelmessig formede kjerner og et granulært utseende. Rekruttering av store amoeboidceller som sannsynligvis makrofager kan også observeres.
I dette eksperimentet skapte ablasjonen av flere celler i de doble transgene larver betydelige hullene i den interneuromastcellerstrengen, men hadde liten eller ingen effekt på sidelinjenerven. Etter laserablasjon kan gapstørrelser måles. Alt fra bare noen få mikrometer opptil 100 mikron, avhengig av bredden som de enkelte nevromastcellene og hvor mange celler som er valgt for ablasjon.
Etter ablasjon gjenoppretter noen interneuromastceller innen de første timene etter avbildning. Med sannsynligheten for gaplukking negativt korrelert med gapstørrelse. Selv i interneuromastceller som ikke er i stand til å gjenopprette, kan dannelsen av lange projeksjoner fra nærliggende interneuromastceller, som kan ligne å utvide nevronale vekstkjegler observeres.
Det er viktig å grundig inspisere T-PMT-kanalen for skadede celler som viser uregelmessig formede kjerner og detaljnivå, og for å gi tilstrekkelig tid til at disse indikatorene for celledød blir synlige. Videre analyse av de resulterende time-lapse mikroskopidata, kan potensielt avsløre nye cellulære atferd indusert av laserablasjon og kan veilede utviklingen av eksperimenter for å identifisere regulatorer av regenerering. Denne teknikken har gjort oss i stand til å studere molekylære regulatorer av interneuromast celleregenerering ved å gi en rask og kostnadseffektiv metode for selektivt å skade disse cellene.
Laserablasjon er en allment anvendelig teknologi for å studere regenerering i biologiske systemer. Den presenterte protokollen beskriver bruk av et standard laserskanning konfokal mikroskop for laserablasjon og påfølgende tidsforløp av avbildning av regenererende interneuromastceller i sebrafisk lateral linje.
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved