5.6K Views
•
11:17 min
•
May 20th, 2020
DOI :
May 20th, 2020
•0:04
Introduction
0:42
Larva Mounting
2:16
Prospective Target Location
4:02
Pre-Ablation Imaging
5:49
Laser Ablation
7:03
Post-Ablation Imaging and Regeneration Time-Lapse Microscopy
8:25
Results: Representative Interneuromast Cell (INMC) Ablation Imaging and Gap Measurement
10:23
Conclusion
Transcript
Med hjälp av detta protokoll, alla labb som har en standard confocal mikroskop utrustad med en 405 nanometer laser kan utföra hårcellsförfalsen laser ablationer och övervaka deras regenerering. Till skillnad från elektro-ablation, denna teknik begränsar skador omgivande celler och är mer tillgänglig än en kraftfull pulsad UV-laser setup. Konfokal avbildning kan också utföras omedelbart före och efter ablation.
Denna teknik gör det möjligt för oss att bättre förstå regenerativ beteende sensoriska stamceller, som kan bidra till utvecklingen av terapier för mänsklig hörselnedsättning. För montering, första pipetten tre till fyra bedöva larver i en liten droppe E3 trikainlösning i mitten av 35 millimeter skålen, med en 14 millimeter nummer 1,5 täckslitten botten. Ta bort överskottslösningen så att larverna förblir i en liten droppe precis tillräckligt stor för att innehålla dem.
Och placera skålen på scenen i en kikare stereomikroskop. Manipulera zoomen och fokus så att alla larver är i synfältet och använda en överföringspipett för att lägga till ett tunt lager av agro-lösning på omslagssligen. Ta bort överskottet agros tills vätskan bara fyller brunnen längst ner på skålen, var noga med att inte aspirera några larver.
Och använd en hårkniv för att snabbt orientera larverna i agro-lösningen med den rostrala sidan vänd åt vänster. Tryck försiktigt larverna ner mot glaset, så att larverna ligger i profil med höger sida nedåt. Efter ca 60 sekunder kommer agros börjar stelna och larverna kommer inte att kunna omorientas.
Efter fem minuter, använd en överföring pipett för att fylla skålen halvvägs med E3 kompletteras med 1X trikain. För att lokalisera blivande mål, slå på strömmen till laserscanning confocal mikroskopisystem och initiera lasern genom den integrerade bildhanteringsprogram. Välj 63X Plan-Apochromat olje nedsänkning mål och tillämpa nedsänkning olja till linsen.
Säkra skålen i ett cirkulärt stegskär med den rostrala aspekten av larverna som är vända mot vänster. Med hjälp av ljust fält eller differentialinterdiktionskontrastbelysning väljer du en av de monterade larverna för avbildning och använd fokusratten för att få huden på sidan av fisken närmast locket glida i fokus. Byt till epifluorescerande belysning i GFP-kanalen och lokalisera den bakre laterala linjen genom GFP-uttryck längs den horisontella myoseptum.
Ringar av fluorescerande celler är vägledande för neuromast mantelceller och avlånga strängar av celler är de interneuromast celler. Börjar med den första migrerande primordium neuromast, använd scenen kontroll joystick för att visuellt skanna caudally längs den horisontella myoseptum. Efter strängen av interneuromast celler tills regionen mellan tredje och fjärde migrerande primordium neuromasts nås.
Om flera larver ska avbildas väljer du position för att ställa in den första etappens position. Efter att cellkroppar i L3 har L4-regionen identifierats, växla till anskaffningsläget och använd en lämplig laser för att aktivera GFP-bildspåret. Om du vill lägga till en överförd ljuskanal i det aktiverade laserspåret klickar du på rutan T-PMT i rullinställningens dropdown-meny.
För att avbilda ET20-larver väljer du 488 nanometerlaser, ställer in lasereffekten på 6%pinholestorleken på en områdesenhetsekvivalent och den digitala förstärkningen till 750. Justera vinsterna så att cellkropparna är mättade för att fånga annars dunkla projektioner och filopodia. Och ställ in ramstorleken till 1, 024 med 1, 024 pixlar, medelvärdet till två och den digitala zoomen till 0,7.
Markera rutan Z stack för att få upp Z-position dropdown-menyn. Medan snabb skanning, fokusera ut tills interneuromast cellerna är bara ur fokus och ställa in den första skiva. Fokusera igenom provet tills interneuromastcellerna återigen är ur fokus och ställ in det sista segmentet.
Klicka sedan på stopp och klicka på startexperiment för att fånga en pre-ablation Z-stack. Om scenens positioner har lagts till inaktiverar du alternativet för positioner så att endast den aktuella positionen avbildas och sparar filen när den har fångats. För laserablation av de riktade cellkropparna klickar du på Visa alla verktyg i anskaffningsgränssnittet och i bildhanteringsinställningsmenyn väljer du Lägg till ett nytt spår.
Klicka på Färgämne och välj DAPI. Under kanaler väljer du 405 för laserinställningen och ökar lasereffekten till 75%Unclick dapi-kanalen för att stänga av lasern medan du skannar för kandidatcellkroppar för ablation. Klicka på Live och med kroppen av en interneuromast cell centrerad i synfältet, zooma in i skanningsramen till 20 till 22X.
Stoppa live-skanningen så fort cellkroppen fyller synfältet. Kontrollera 405 nanometer laser slutare rutan för att aktivera spåret och ställa in en timer för 45 sekunder. Därefter aktiverar du kontinuerlig skanning och startar timern.
Omedelbart stoppa scanningen på 45 sekunder. För bildframställning av cellkropparna efter ablation, under kanalerna menyn, unclick DAPI spåret att inaktivera ablation laser och öppna förvärv läge menyn. Klicka på zooma och minska zoomen till 0,7.
För att bedöma hur framgångsrik cellablationen är, skannar du snabbt igenom synfältet. Använda samma inställningar som de för pre-ablation bildframställning, fånga och spara en post-ablation bild. Inspektera den överförda ljusfotomultiplierrörskanalbilden för att ytterligare bekräfta cellskadorna.
Skadade celler kommer att visa en granulat utseende och kärnorna kommer ofta svälla eller visas oregelbunden i form. För att bedöma efterablationscellkroppens återhämtning aktiverar du både scenpositionen och tidsalternativen för bildupptagning av tidsförlopp och ställer in tidsparametrarna på lämplig experimentell tidspunkt och 15 minuters intervall. Sedan startar du experimentet för att skaffa bilder och spara den resulterande filen när den är klar.
I detta representativa experiment, regionen i laterala linjen ligger mellan tredje och fjärde migrera primordium neuromasts identifierades och pre-ablation bilder fångades. Post-ablation scanning bekräftade att inga cell organ kvar i den ablated regionen. Lämnar en lucka mellan de avlånga prognoserna för de intilliggande interneuromastcellerna.
Analys av den överförda ljusfotomultiplierröret kanal efter ablation, avslöjar skadade och döende celler. Präglat av svullna och oregelbundet formade kärnor och ett granulärt utseende. Rekryteringen av stora amöboida celler som är troliga makrofager kan också observeras.
I detta experiment skapade ablationen av flera celler i de dubbla transgena larverna betydande luckor i interneuromast-cellernas sträng, men hade liten eller ingen effekt på den laterala linjen nerv. Efter laserablation kan mellanrumsstorlekar mätas. Allt från bara några mikrometer upp till 100 mikrometer, beroende på bredden att de enskilda neuromastceller och hur många celler som väljs ut för ablation.
Efter ablation, vissa interneuromast celler återhämta sig inom de första flera timmar av bildbehandling. Med sannolikheten för gap stängning negativt korrelerar med gapstorlek. Även i interneuromast celler som inte kan återhämta sig dock, bildandet av långa prognoser från angränsande interneuromast celler, som kan likna utvidga neuronala tillväxt kottar kan observeras.
Det är viktigt att noggrant inspektera T-PMT-kanalen för skadade celler som uppvisar oregelbundet formade kärnor och granularitet, och för att ge tillräckligt med tid för dessa indikatorer på celldöd att bli synliga. Ytterligare analys av den resulterande time-lapse mikroskopi data, kan potentiellt avslöja nya cellulära beteenden induceras av laser ablation och kan styra utvecklingen av experiment för att identifiera regulatorer av regenerering. Denna teknik har gjort det möjligt för oss att studera de molekylära regulatorer av interneuromast cell regenerering genom att tillhandahålla en snabb och kostnadseffektiv metod för att selektivt skada dessa celler.
Laserablation är en brett tillämplig teknik för att studera regenerering i biologiska system. Det presenterade protokollet beskriver användning av en standard laser-scanning confocal mikroskop för laser ablation och efterföljande time-lapse imaging av regenererande interneuromast celler i zebrafish laterala linjen.
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved