Name: determination of chemical inhibitor efficiency against intracellular toxoplasma gondii growth using a luciferase-based growth assay
Uploaded: 2020-04-29T13:30:00
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作者要感谢Sibley博士和卡拉瑟斯分享pSAG1-Cas9-sgRNA-TgUPRT质粒和抗TgCPL和TgActin抗体。这项工作得到了克莱姆森启动基金（至Z.D.）、骑士圣殿眼基金会儿科眼科职业启动研究补助金（至Z.D.）、NIH COBRE赠款P20GM109094（至Z.D.）和NIH R01AI143707（至Z.D.）的试点赠款的支持。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有作用。

弓形虫贡迪被分类在风险组 2 中，必须在生物安全级别 2 （BSL-2） 处理。该议定书已得到克莱姆森大学机构生物安全委员会的审查和批准。
1. 基于路西法删除的弓形虫生长测定
<ol><li>在寄生虫接种前1周种子人类前皮成纤维细胞（HFFs），以确保宿主细胞完全融合。在透明板中进行模拟测定，以确保寄生虫在整个评估过程中保持细胞内。 注：在这里，测定是在...

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	<li>Blader, I. J., Coleman, B. I., Chen, C. T., Gubbels, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lytic+Cycle+of+Toxoplasma+gondii:+15+Years+Later.">Lytic Cycle of Toxoplasma gondii: 15 Years Later.</a> Annual Review of Microbiology. 69 (1), 1-23 (2014).</li><li>Jones, J. L., Kruszon-Moran, D., Rivera, H., Price, C., Wilkins, P. 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*本协议描述了一种基于荧光酶的协议，用于评估细胞内弓形虫的生长，并评估化合物对寄生虫生长的抑制作用。与现有的测量细胞内弓形虫生长的策略相比，该方法具有高灵敏度和特异性。在监测寄生虫生长时，建议在96孔微孔的模拟检测中确认测试菌株在评估期结束前不会过早压出宿主细胞。否则，发光读数将不能准确反映寄生虫的生长，因为弓形体只在宿主细胞内复制。<...

弓形虫是一种非常成功的细胞内寄生虫，它感染了大约三分之一的人类。其高传播率主要得益于其不同的传播途径，包括食用未煮熟的肉类、接触哺乳动物的水库以及分娩期间的先天性传播。T. Gondii主要导致机会性感染，可导致免疫功能,低下的个人1，2，3，4，5，62,3的严重发病率和死亡率。4,5,61目前用于治疗急性弓形虫病的抗生素在治疗先天性和潜伏性感染方面效率特别低，在3、7、87,8引起严重反应。3因此，迫切需要确定新的治疗方法。了解弓形虫及其宿主中亚细胞过程的差异将有助于确定潜在的药物靶点。因此，需要高效和方便的基因组操作技术来研究弓形体中单个基因的作用。此外，弓形虫属于植物性阿皮金，其中包括其他几种重要的人类病原体，如疟原虫和隐孢子虫。因此，弓形虫可以作为模型有机体，以帮助研究其他阿皮质寄生虫的基本生物学。
为了识别针对微生物病原体的新型抗生素，最初对化合物库进行了高通量筛选，以确定其在抑制微生物生长方面的有效性。到目前为止，已经开发出几种基于微孔板的生长测定法，用于测量T的细胞内生长。 贡迪（即放射性3H-uracil基于合并的定量9，定量ELISA为基础的寄生虫检测使用T.贡迪特异性抗体10，11，记者蛋白质为基础的测量10,11使用β-加拉西西酶或YFP表达弓形虫菌株12，13，,13和最近开发的高含量成像检测14）。
这些个别策略都有独特的优势;但是，某些限制也限制了其应用。例如，由于弓形体只能在核动物细胞内复制，因此自荧光和非特异性结合抗T.贡迪抗体对宿主细胞的宿主细胞会导致荧光测量的干扰。此外，使用放射性同位素需要特殊的安全合规性和潜在的安全问题。其中一些测定更适合在单个时间点评估增长，而不是持续监测增长。
此处介绍的是一种基于荧光酶的协议，用于定量细胞内弓形虫生长。在以前的研究中，NanoLuc Luciferase基因在弓形体图布林促进剂下被克隆，这种透明酶表达结构被转染成野生型（RH_ku80+hxg菌株）寄生虫，以产生RH_ku80=hxg：：hxgNLuc菌株（ku80称为RH_ku80：：后NLuc） 15。ku80在这项研究中，这种菌株作为父母在细胞内生长测定和基因缺失的菌株。使用RH_ku80：：NLuc菌株，在感染后96小时期间监测人类前皮纤维细胞（HFFs）中的寄生虫生长，以计算寄生虫加倍的时间。
此外，通过绘制弓形虫酸的增长率以确定IC50值，可以确定LHVS对寄生虫生长的抑制作用。此前有文献记载，TgCPL是寄生虫中LHVS的主要目标，使用LHVS治疗可减少急性和慢性,17,18,19弓形虫感染的发展。此外，RH_ku80：：NLuc用作用于基因组修饰的父母菌株，以产生TgCPL缺陷菌株（RH+ku80=cpl：：NLuc），并针对此突变体测量 LHVS 的抑制。通过观察TgCPL缺乏寄生虫中LHVS的IC50值与WT菌株相比的向上变化，经验证TgCPL是LHVS体内的目标。
在此协议中，RH_ku80：：NLuc用作父母应变，缺乏有效的非同源端联通路（NHEJ），从而促进双交叉同源性重组（HDR）20，21。20,21此外，50 bp 同源区域在 PCR 的耐药盒的两端侧翼。PCR 产品用作修复模板，使用基于 CRISPR-Cas9 的基因组编辑工具通过 HDR 去除整个基因位点。这种短的同源区域可以很容易地集成到底漆中，为维修模板的生产提供了方便的策略。可以修改该协议，执行通用基因删除和内源基因标记。
例如，在我们最近的出版物中，三个蛋白酶基因，TgCPL，TgCPB（弓形体乙型蛋白酶）和TgSUB1（弓形体亚骨素样蛋白酶1），在TgCRT（弓形素氯奎酮抗药性运输器）中基因消解，缺乏寄生虫使用这种方法15。 TgCPB此外，TgAMN（一种假定的氨肽酶N[TgAMN，TGGT1_221310]）被内质标记15。Lourido实验室还报告说，使用40-43bp范围内的短同源区域，使用类似的方法22在弓形体基因组中引入位点基因突变和内源基因标记。这些成功的基因组修改表明，40-50bp同源区域足以在TgKU80缺陷菌株中进行有效的DNA重组，这大大简化了弓形虫腺的基因组操作。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose gel extraction kit</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>T1020L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0316S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotek Synergy H1 Hybrid Multi-Mode Microplate Reader</td>
			<td>BioTek Instuments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BTX Gemini Twin Waveform Electroporation System</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemically competent E. coli cells</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>C29871</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CloneAmp HiFi PCR premix</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>639298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coelenterazine h</td>
			<td>Prolume</td>
			<td>301-10 hCTZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRV</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3195S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phire Tissue Direct PCR Master Mix</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>F170L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid miniprep kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 Site-Directed Mutagenesis kit</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E0554S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geneious software for sgRNA design (version: R11)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism software (8th version)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SnapGene for molecular cloning (version: 4.2.11)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of chemical inhibitor efficiency against intracellular toxoplasma gondii growth using a luciferase-based growth assay

弓形虫是一种原生动物病原体，广泛影响人类。目前用于治疗临床弓形虫病的抗生素是有限的。此外，它们在某些人群中表现出不良的副作用。因此，发现临床弓形虫病的新药势在必行。新型抗生素开发的第一步是使用高通量筛选策略识别在抑制寄生虫生长方面表现出高疗效的化合物。作为一种义务细胞内病原体，弓形虫只能在宿主细胞内复制，这禁止使用光学吸收度测量作为生长的快速指标。此处介绍的是基于荧光酶的生长测定的详细协议。例如，该方法用于计算野生型弓形虫寄生虫的倍增时间，并测量莫诺林-利基-同苯-乙烯磺胺苯基（LHVS，一种半胱氨酸蛋白酶靶向化合物）对抑制寄生虫细胞内生长的疗效。还描述了一个基于CRISPR-Cas9的基因删除协议在弓形体使用50bp同源区域进行同源相关重组（HDR）。通过量化LHVS在野生型和TgCPL（弓形体cathein L样蛋白酶）缺乏寄生虫的抑制作用，表明LHVS抑制野生型寄生虫生长比μcpl生长更有效，这表明TgCPL是LHVS结合到弓形虫的目标。这种基于荧光酶的生长测定具有高灵敏度和易于操作，因此适用于监测弓形虫的增殖和以高通量方式评估药物疗效。

图 1表示 RH_ku80：：NLuc应变的生长曲线示例及其加倍时间的派生计算。通常，对三种生物复制进行三种技术复制，以解释荧光酶活性读数的变化。为了计算寄生虫生长的正化褶皱变化，每次在感染后24-96小时读数除以感染后4小时的初始读数，这反映了测定中活寄生虫的起始量（图1A，B）。在确定寄生虫...

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Determination of Chemical Inhibitor Efficiency against Intracellular Toxoplasma Gondii Growth Using a Luciferase-Based Growth Assay

本文介绍的是一种协议，用于使用基于荧光酶的生长测定来评估化合物对弓形体淋酸体内生长的抑制作用。该技术用于通过基因删除相应的靶基因来确认抑制特异性。以LHVS对TgCPL蛋白酶的抑制为例。

使用基于路西法抹去的生长测定，确定化学抑制剂对细胞内弓形体贡迪生长的抑制效率

Toxoplasma gondii is a protozoan pathogen that widely affects the human population. The current antibiotics used for treating clinical toxoplasmosis are ...

这些敏感策略可用于评估化学抑制剂的抑制作用，并结合CRISPR-Cas9基因缺失来研究药物靶点。寄生虫生长可以随着时间的推移进行监测，而不是使用端点分析来监测，以便使用敏感的报告蛋白计算寄生虫加倍的时间。这种测定有可能在384或1，536孔微孔板中进行扩展，用于测试多种化合物或以高通量方式筛选库。这一策略可以修改，以量化其他细胞内微生物病原体的生长及其对感兴趣的药物的反应。要进行基于荧光酶的弓形虫生长测定，首先从人类食金成纤维细胞的预种96孔微孔培养物中小心地吸出介质，然后以三列五行的形式将150微升寄生虫B悬浮液接种到井中。在细胞培养箱中孵育了四个小时后，小心地从每口井中吸出培养基，去除非侵入的寄生虫，并在每一排的孔中填充室温酚红色自由介质。然后将 PBS 中 12.5 微摩尔荧光素酶基质溶液的 100 微升加入到顶排的每个孔中，并在室温下孵育微孔板 10 分钟，以进行全细胞解解。在孵育结束时，测量微孔板读卡器上的荧光素酶活性。每个读数表示感染后四小时入侵寄生虫的初始数量。接下来的四天每 24 小时重复一次分析，而不更改介质。为了计算寄生虫生长的正常化折叠变化，每个读数可以除以感染后四小时的初始读数。然后，可以针对每个时间点绘制寄生虫生长的规范化折叠变化的对数 2，并受线性回归函数的影响，以获得表示加倍时间的斜率。为了评估对弓形虫生长的一种感兴趣的化合物的抑制效果，在96孔微孔板中培养人类母体纤维细胞至少7天，然后接种每孔细胞，在37摄氏度和5%的二氧化碳下用150微升寄生虫接种4小时。在孵化过程中，通过连续稀释，在12井储液罐中以8种不同浓度准备兴趣化合物。通过用一毫升移液器上下移液数次，以一到三个稀释液稀释12井储液罐中的化合物。感染后四小时，将每井中的介质从二柱到九柱中更换为150微升的介质，并辅以每次稀释的化合物，使第一柱充满常规介质，作为非处理控制。然后将细胞培养物返回到细胞培养箱96小时，并测量每一井的荧光酶活性，以确定每个化合物浓度的培养物中生长抑制的百分比。要将规范化的荧光素酶活性计算为百分比，请将每种化合物浓度的平均荧光素酶活性除以来自未处理寄生虫的平均荧光素酶活性。然后使用适当的图形软件程序绘制针对单个化合物的规范化荧光素酶活性，并计算每种化合物的半最大值抑制浓度。要生成表示单导RNA和Cas9的质粒结构，用于删除感兴趣的基因，请导航到弓形虫基因组资源页面，并检索整个基因编码序列，包括内子和外子以及1.5千基5和三个主要未翻译区域。将检索到的 TgCPL 序列复制到序列分析软件中，并标记五个和三个未翻译的主要区域。在弓形虫基因组资源页面上，单击"下载"、数据文件和Current_Release。在 T.gondii GT1 文件夹中，选择 FASTA。从数据文件夹中下载弓形虫贡迪GT1菌株基因组序列文件。然后在DNA序列分析软件中创建名为"弓形虫基因组"的本地文件夹，并导入该文件夹中的弓形虫基因组序列文件。选择"工具"、克隆和查找 CRISPR 站点，为 PAM 站点位置设置三个主要 Cas9 黄金。选择显示高特异性分数的单导RNA，通常大于98%，并且NGG之后缺少G。选定的单导RNA通常位于靠近感兴趣的基因的开始和停止的点。然后使用PCR预混料与表中所示的设置执行PCR反应，以修改预先存在的质粒表达针对TgUPRT基因的单导RNA。对于弓形虫转染，将两微克修复的模板DNA与20微克的单导RNA Cas9表达质粒混合，并在1.5毫升离心管中混合400微升寄生虫再吸附、脱氧核糖核酸和5微升200毫摩尔ATP 500毫摩尔减少谷胱甘肽。添加细胞混合缓冲液，使总体积达到500微升根据需要，并转移寄生虫DNA混合物到四毫米的差距与电穿孔。然后以两千伏和50欧姆的电阻电分寄生虫。要克隆淘汰寄生虫，首先对寄生虫进行两步稀释，以达到每毫升D10介质10个寄生虫，并辅以适当的抗生素浓度。接下来，将150微升的重新释放的纯化寄生虫转移到用爱皮成纤维细胞预种的96孔微孔板的每个孔井中，并在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育微孔板7天。在孵化结束时，识别含有单个斑块的井，从96孔微孔培养物的每个孔中将75个受重发的弓形虫感染的人类母金成纤维细胞的微升转移到单独的1.5毫升管中。通过离心收集细胞，并在含有脱氧核糖核酸释放添加剂中稀释缓冲液的10.25微升解液中重新填充细胞。然后在室温下孵育样品4分钟，在98摄氏度下孵育2分钟，然后执行PCR测试耐药盒的整合和感兴趣的基因损失。LHVS和野生型在三角洲CPL菌株中的抑制功效可以通过绘制其针对不同抑制剂浓度的荧光素酶活性来确定。在PCR之后，电变质粒被线性化并加载到1%的加糖凝胶中，以验证成功的扩增。在凝胶提取和大肠杆菌转化后，含有预期质粒的克隆可以通过DNA测序中的限制内核糖酶消化进行筛选。修复模板放大后，可以使用气糖凝胶电泳来验证PCR产品的正确尺寸。一般来说，在初始筛选中选择7至8个克隆，以检查有关基因编码序列的缺失，然后检测5个和3个主要臂，以帮助将要筛选的克隆总数降至最低。如果有任何识别靶蛋白的抗体可用，可以通过免疫印迹完成进一步的验证。在获得荧光素酶活性测量之前，应在显微镜下检查具有模拟感染的透明微孔板，以确保寄生虫不会完全对宿主细胞进行欺骗。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Determination of Chemical Inhibitor Efficiency against Intracellular Toxoplasma Gondii Growth Using a Luciferase-Based Growth Assay

Obtaining Highly Purified Toxoplasma gondii Oocysts by a Discontinuous Cesium Chloride Gradient

Obtaining Highly Purified Toxoplasma gondii Oocysts by a Discontinuous Cesium Chloride Gradient

取得高纯度弓形虫</em一个不连续的氯化铯梯度>卵囊

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular protozoan pathogen that commonly infects humans. It is a well characterized apicomplexan associated with ...

科研

免疫与感染

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

弓形虫囊肿壁形成激活骨髓衍生的巨噬细胞和Bradyzoite条件

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii ...

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

与预先定义的T细胞受体特异性Transnuclear小鼠对弓形虫获得通过体细胞核移植

Lymphocytes, such as T cells, undergo genetic V(D)J recombination, to generate a receptor with a certain specificity1. Mice transgenic for a rearranged ...

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

遗传筛选隔离弓形虫宿主细胞的出口突变

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth ...

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

增长结核分枝杆菌生物膜

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

Antileishmanial筛选对细胞内的寄生虫救援和转化实验<em&gt;杜氏利什曼原虫</em无鞭毛体在THP1人急性单核细胞白血病细胞株

Leishmaniasis is  one of the world's most neglected diseases, largely affecting the  poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million ...

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

金黄色葡萄球菌生长使用人血红蛋白作为铁源

S. aureus is a pathogenic bacterium that requires iron to  carry out vital metabolic functions and cause disease. The most abundant  reservoir of iron ...

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

遗传操纵<em&gt;Δku80</em&gt;株功能基因组分析<em&gt;弓形虫</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

利用荧光蛋白可视化和定量<em&gt;衣原体</em&gt;液泡生长动态的活细胞

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

正向遗传学屏风使用巨噬细胞识别<em&gt;弓形虫</em&gt;基因的重要的抗IFN-γ依赖性细胞免疫自主

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within ...