Name: determination of chemical inhibitor efficiency against intracellular toxoplasma gondii growth using a luciferase-based growth assay
Uploaded: 2020-04-29T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of Chemical Inhibitor Efficiency against Intracellular Toxoplasma Gondii Growth Using a Luciferase-Based Growth Assay at JoVE.com

Forfatterne vil gerne takke Drs. Sibley og Carruthers for deling pSAG1-Cas9-sgRNA-TgUPRT plasmid og anti-TgCPL og TgActin antistoffer. Dette arbejde blev støttet af Clemson Startup fund (til Z.D.), Knights Templar Eye Foundation Pediatric Oftalmology Career-Starter Research Grant (til Z.D.), et pilottilskud til en NIH COBRE-bevilling P20GM109094 (til Z.D.) og NIH R01AI143707 (til Z.D.). Finansieringsgiverne havde ingen rolle i studiedesign, dataindsamling og analyse, beslutning om at offentliggøre eller udarbejde manuskriptet.

Toxoplasma gondii er kategoriseret i risikogruppe 2 og skal håndteres på biosikkerhedsniveau 2 (BSL-2). Protokollen er blevet gennemgået og godkendt af Udvalget for Institutionel Biosikkerhed ved Clemson University.
1. Luciferase-baserede Toxoplasma vækst assay
<ol><li>Frø human forhuden fibroblaster (HFFs) 1 uge før parasitten inokulering for at sikre, at værtsceller er fuldt sammenflydende. Udfør en mock assay i en gennemsigtig plade for at sikre, at parasitter fo...

<ol>
	<li>Blader, I. J., Coleman, B. I., Chen, C. T., Gubbels, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lytic+Cycle+of+Toxoplasma+gondii:+15+Years+Later.">Lytic Cycle of Toxoplasma gondii: 15 Years Later.</a> Annual Review of Microbiology. 69 (1), 1-23 (2014).</li><li>Jones, J. L., Kruszon-Moran, D., Rivera, H., Price, C., Wilkins, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii+Seroprevalence+in+the+United+States+2009-2010+and+Comparison+with+the+Past+Two+Decades.">Toxoplasma gondii Seroprevalence in the United States 2009-2010 and Comparison with the Past Two Decades.</a> The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 90 (6), (2014).</li><li>Kieffer, F., Wallon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenital+toxoplasmosis.">Congenital toxoplasmosis.</a> Handbook of Clinical Neurology. 112, 1099-1101 (2013).</li><li>Hoffmann, S., Batz, M. B., Morris, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Annual+cost+of+illness+and+quality-adjusted+life+year+losses+in+the+United+States+due+to+14+foodborne+pathogens.">Annual cost of illness and quality-adjusted life year losses in the United States due to 14 foodborne pathogens.</a> Journal of Food Protection. 75 (7), 1292-1302 (2012).</li><li>Dubey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasmosis.">Toxoplasmosis.</a> Journal of the American Veterinary Medical Association. 205 (11), 1593-1598 (1994).</li><li>Lindsay, D., Dubey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii:+the+changing+paradigm+of+congenital+toxoplasmosis.">Toxoplasma gondii: the changing paradigm of congenital toxoplasmosis.</a> Parasitology. 138 (14), 1-3 (2011).</li><li>Deng, Y., Wu, T., Zhai, S., Li, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+on+anti-Toxoplasma+drugs+discovery:+Design,+synthesis+and+screening.">Recent progress on anti-Toxoplasma drugs discovery: Design, synthesis and screening.</a> European Journal of Medicinal Chemistry. 183, 111711 (2019).</li><li>Butler, N. J., Furtado, J. M., Winthrop, K. L., Smith, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+toxoplasmosis+II:+clinical+features,+pathology+and+management.">Ocular toxoplasmosis II: clinical features, pathology and management.</a> Clinical &amp; Experimental Ophthalmology. 41 (1), 95-108 (2013).</li><li>Pfefferko, E., Pfefferko, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+Labeling+of+Intracellular+Toxoplasma+gondii+with+Uracil.">Specific Labeling of Intracellular Toxoplasma gondii with Uracil.</a> Journal of Eukaryotic Microbiology. 24 (3), 449-453 (1977).</li><li>Merli, A., Canessa, A., Melioli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme+immunoassay+for+evaluation+of+Toxoplasma+gondii+growth+in+tissue+culture.">Enzyme immunoassay for evaluation of Toxoplasma gondii growth in tissue culture.</a> Journal of Clinical Microbiology. 21 (1), 88-91 (1985).</li><li>Derouin, F., Chastang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme+immunoassay+to+assess+effect+of+antimicrobial+agents+on+Toxoplasma+gondii+in+tissue+culture.">Enzyme immunoassay to assess effect of antimicrobial agents on Toxoplasma gondii in tissue culture.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 32 (3), 303-307 (1988).</li><li>McFadden, D., Seeber, F., Boothroyd, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Toxoplasma+gondii+expressing+beta-galactosidase+for+colorimetric+assessment+of+drug+activity+in+vitro.">Use of Toxoplasma gondii expressing beta-galactosidase for colorimetric assessment of drug activity in vitro.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 41 (9), 1849-1853 (1997).</li><li>Gubbels, M. J., Li, C., Striepen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Growth+Assay+for+Toxoplasma+gondii+Using+Yellow+Fluorescent+Protein.">High-Throughput Growth Assay for Toxoplasma gondii Using Yellow Fluorescent Protein.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (1), 309-316 (2003).</li><li>Touquet, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+imaging+assay+to+evaluate+Toxoplasma+gondii+infection+and+proliferation:+A+multiparametric+assay+to+screen+new+compounds.">High-content imaging assay to evaluate Toxoplasma gondii infection and proliferation: A multiparametric assay to screen new compounds.</a> PLoS ONE. 13 (8), e0201678 (2018).</li><li>Thornton, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ortholog+of+Plasmodium+falciparum+chloroquine+resistance+transporter+(PfCRT)+plays+a+key+role+in+maintaining+the+integrity+of+the+endolysosomal+system+in+Toxoplasma+gondii+to+facilitate+host+invasion.">An ortholog of Plasmodium falciparum chloroquine resistance transporter (PfCRT) plays a key role in maintaining the integrity of the endolysosomal system in Toxoplasma gondii to facilitate host invasion.</a> PLOS Pathogens. 15 (6), e1007775 (2019).</li><li>Larson, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii+cathepsin+L+is+the+primary+target+of+the+invasion-inhibitory+compound+morpholinurea-leucyl-homophenyl-vinyl+sulfone+phenyl.">Toxoplasma gondii cathepsin L is the primary target of the invasion-inhibitory compound morpholinurea-leucyl-homophenyl-vinyl sulfone phenyl.</a> The Journal of Biological Chemistry. 284 (39), 26839-26850 (2009).</li><li>Dou, Z., McGovern, O. L., Cristina, M., Carruthers, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii+Ingests+and+Digests+Host+Cytosolic+Proteins.">Toxoplasma gondii Ingests and Digests Host Cytosolic Proteins.</a> mBio. 5 (4), e01188-14 (2014).</li><li>Cristina, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+depends+on+lysosomal+consumption+of+autophagosomes+for+persistent+infection.">Toxoplasma depends on lysosomal consumption of autophagosomes for persistent infection.</a> Nature Microbiology. 2, 17096 (2017).</li><li>Parussini, F., Coppens, I., Shah, P. P., Diamond, S. L., Carruthers, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cathepsin+L+occupies+a+vacuolar+compartment+and+is+a+protein+maturase+within+the+endo/exocytic+system+of+Toxoplasma+gondii.">Cathepsin L occupies a vacuolar compartment and is a protein maturase within the endo/exocytic system of Toxoplasma gondii.</a> Molecular Microbiology. 76 (6), 1340-1357 (2010).</li><li>Huynh, M. H., Carruthers, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tagging+of+endogenous+genes+in+a+Toxoplasma+gondii+strain+lacking+Ku80.">Tagging of endogenous genes in a Toxoplasma gondii strain lacking Ku80.</a> Eukaryotic cell. 8 (4), 530-539 (2009).</li><li>Fox, B. A., Ristuccia, J. G., Gigley, J. P., Bzik, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+replacements+in+Toxoplasma+gondii+strains+deficient+for+nonhomologous+end+joining.">Efficient gene replacements in Toxoplasma gondii strains deficient for nonhomologous end joining.</a> Eukaryotic Cell. 8 (4), 520-529 (2009).</li><li>Sidik, S. M., Hackett, C. G., Tran, F., Westwood, N. J., Lourido, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Genome+Engineering+of+Toxoplasma+gondii+Using+CRISPR/Cas9.">Efficient Genome Engineering of Toxoplasma gondii Using CRISPR/Cas9.</a> PLoS ONE. 9 (6), e100450 (2014).</li><li>Shen, B., Brown, K. M., Lee, T. D., Sibley, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Gene+Disruption+in+Diverse+Strains+of+Toxoplasma+gondii+Using+CRISPR/CAS9.">Efficient Gene Disruption in Diverse Strains of Toxoplasma gondii Using CRISPR/CAS9.</a> mBio. 5 (3), e01114-14 (2014).</li><li>Radke, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+cell+cycle+for+the+tachyzoite+stage+of+Toxoplasma+gondii.">Defining the cell cycle for the tachyzoite stage of Toxoplasma gondii.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 115 (2), 165-175 (2001).</li><li>Ran, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li><li>Labun, K., Montague, T. G., Gagnon, J. A., Thyme, S. B., Valen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CHOPCHOP+v2:+a+web+tool+for+the+next+generation+of+CRISPR+genome+engineering.">CHOPCHOP v2: a web tool for the next generation of CRISPR genome engineering.</a> Nucleic Acids Research. 44 (W1), W272-W276 (2016).</li><li>Heigwer, F., Kerr, G., Boutros, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-CRISP:+fast+CRISPR+target+site+identification.">E-CRISP: fast CRISPR target site identification.</a> Nature Methods. 11 (2), 2812 (2014).</li><li>Peng, D., Tarleton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EuPaGDT:+a+web+tool+tailored+to+design+CRISPR+guide+RNAs+for+eukaryotic+pathogens.">EuPaGDT: a web tool tailored to design CRISPR guide RNAs for eukaryotic pathogens.</a> Microbial Genomics. 1 (4), e000033 (2015).</li><li>Doench, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+highly+active+sgRNAs+for+CRISPR-Cas9-mediated+gene+inactivation.">Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation.</a> Nature Biotechnology. 32 (12), 1262-1267 (2014).</li><li>Sidik, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Genome-wide+CRISPR+Screen+in+Toxoplasma+Identifies+Essential+Apicomplexan+Genes.">A Genome-wide CRISPR Screen in Toxoplasma Identifies Essential Apicomplexan Genes.</a> Cell. 166 (6), 1423-1435 (2016).</li></ol>

++Denne protokol beskriver en luciferase-baseret protokol til vurdering af intracellulær Toxoplasma vækst og evaluere hæmning effekten af kemiske forbindelser mod parasitvækst. Sammenlignet med de eksisterende strategier til måling af intracellulær Toxoplasma vækst, denne metode udviser høj følsomhed og specificitet. Mens overvågning parasit vækst, en mock assay i en klar 96 godt mikroplade anbefales at bekræfte, at den testede stamme ikke for tidligt lyse værtsceller inden udgangen af eval...

Toxoplasma gondii er en meget vellykket forpligte intracellulære parasit, der inficerer cirka en tredjedel af den menneskelige befolkning. Denhøje transmissionshastighed skyldes hovedsagelig dens forskellige transmissionsveje, herunder forbrug af utilstrækkeligt kød, eksponering for pattedyrsreservoirer og medfødt transmission under fødslen. T. gondii forårsager hovedsagelig opportunistiske infektioner , der kan føre til alvorlig sygelighed og dødelighed hos immunkompromitterede personer1,2,3,4,5,6. De antibiotika , der i øjeblikket anvendes til behandling af akut toxoplasmose, er særligt ineffektive til behandling af medfødte og latente infektioner og forårsager alvorlige reaktioner hos nogle personer3,7,8. Således er der et presserende behov for at identificere nye terapeutiske eksisterer. Forståelse af forskellene i subcellulære processer i Toxoplasma og dets vært vil bidrage til at identificere potentielle narkotika mål. Derfor er der behov for effektive og bekvemme genommanipulationsteknikker for at undersøge rollerne af de enkelte gener i Toxoplasma. Derudover, Toxoplasma tilhører phylum Apicomplexa, som omfatter flere andre væsentlige menneskelige patogener, såsom Plasmodium spp. og Cryptosporidium spp. Derfor kan Toxoplasma bruges som en model organisme til at hjælpe med at studere grundlæggende biologi i andre apicomplexan parasitter.
For at identificere nye antibiotika mod mikrobielle patogener udføres der i første omgang screening af et bibliotek med kemiske forbindelser med høj gennemløb for at bestemme deres effektivitet i undertrykkelsen af mikrobiel vækst. Indtil videre er der udviklet flere mikropladebaserede vækstanalyser til måling af intracellulær vækst af T. gondii (dvs. radioaktiv3H-uracil inkorporering-baseret kvantificering9, kvantitativ ELISA-baseret parasitpåvisning ved hjælp af T. gondii-specifikke antistoffer10,,11, reporter proteinbaseret måling ved hjælp af β-galactosidase eller YFP-ekspres Toxoplasma stammer12,,13, og en nyligt udviklet højt indhold billeddannelse assay14).
Disse individuelle strategier har alle unikke fordele; visse begrænsninger begrænser dog også deres anvendelse. For eksempel, da Toxoplasma kun kan replikere inden for nucleated dyreceller, autofluorescens og ikke-specifik binding af anti-T. gondii antistoffer til værtsceller forårsage interferens i fluorescens-baserede målinger. Desuden kræver brugen af radioaktive isotoper særlig sikkerhedsoverensstemmelse og potentielle sikkerhedsproblemer. Nogle af disse analyser er mere velegnede til at vurdere væksten på et enkelt tidspunkt i stedet for løbende overvågning af væksten.
Præsenteret her er en luciferase-baseret protokol for kvantificering af intracellulære Toxoplasma vækst. I en tidligere undersøgelse blev Nanoluc luciferase-genet klonet under Toxoplasma tubulinpromotor, og denne luciferase ekspressionskonstruktion blev transfected til vilde (RHΔku80Δhxg stamme) parasitter for at skabe en RHΔku80Δhxg::NLuc stamme (benævnt RHΔku80::NLuc herefter)15. Denne stamme tjente som forældrenes stamme for intracellulær vækst bestemmelse og gensletning i denne undersøgelse. Ved hjælp af RHΔku80::NLuc stamme, parasit vækst i human forhuden fibroblaster (HFFs) blev overvåget over en 96 h periode efter infektion til at beregne parasit fordobling tid.
Desuden kan lhvs hæmningseffekt mod parasitvækst bestemmes ved at plotte Toxoplasma-vækstrater i forhold til serielle LHVS-koncentrationer for at identificere IC50-værdien. Tidligere litteratur har rapporteret, at TgCPL er et vigtigt mål for LHVS hos parasitter , og at behandling med LHVS nedsætter udviklingen af akutte og kroniske Toxoplasma-infektioner 16,17,18,19. Derudover blev RHΔku80::NLuc brugt som forældrestamme for genommodifikation for at generere en TgCPL-mangelfuldstamme (RHΔku80Δcpl::NLuc), og hæmningen af LHVS blev målt i forhold til denne mutant. Ved at observere en upshift af IC50 værdier for LHVS i TgCPL-mangelfuldparasitter i forhold til WT stamme, blev det valideret, at TgCPL er målrettet af LHVS in vivo.
I denne protokol, RHΔku80::NLuc bruges som forældrenes stamme, som mangler en effektiv ikke-homolog end-sammenføjning vej (NHEJ), hvilket letter dobbelt crossover homologi-afhængige rekombination (HDR)20,21. Derudover er 50 bp homologe regioner flankeret i begge ender af en lægemiddelresistenskassette af PCR. PCR-produktet fungerer som en reparationsskabelon til at fjerne hele genlocus via HDR ved hjælp af CRISPR-Cas9-baserede genomredigeringsværktøjer. Sådanne korte homologe regioner kan nemt indarbejdes i primere, hvilket giver en bekvem strategi for produktion af reparationsskabelonen. Denne protokol kan ændres til at udføre universel gensletning og endogen genmærkning.
For eksempel, i vores seneste publikation, tre protease gener, TgCPL, TgCPB (Toxoplasma cathepsin B-lignende protease), og TgSUB1 (Toxoplasma subtilisin-lignende protease 1), blev genetisk ablated i TgCRT (Toxochloroquine-resistens transportør)-mangelfuld parasitter ved hjælp af denne metode15. Derudover blev TgAMN (et formodet aminopeptidmiddel N [TgAMN, TGGT1_221310]) endogent mærket15. Lourido-laboratoriet rapporterede også ved hjælp af korte homologe regioner i intervallet 40-43 bp til indførelse af stedstyret genmutation og endogen genmærkning i Toxoplasma-genomet ved hjælp af en lignende metode22. Disse vellykkede genom modifikationer tyder på, at en 40-50 bp homolog region er tilstrækkelig til effektiv DNA rekombination i TgKU80-mangelfuldstamme, som i høj grad forenkler genom manipulation i Toxoplasma gondii.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose gel extraction kit</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>T1020L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0316S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotek Synergy H1 Hybrid Multi-Mode Microplate Reader</td>
			<td>BioTek Instuments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BTX Gemini Twin Waveform Electroporation System</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemically competent E. coli cells</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>C29871</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CloneAmp HiFi PCR premix</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>639298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coelenterazine h</td>
			<td>Prolume</td>
			<td>301-10 hCTZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRV</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3195S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phire Tissue Direct PCR Master Mix</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>F170L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid miniprep kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 Site-Directed Mutagenesis kit</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E0554S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geneious software for sgRNA design (version: R11)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism software (8th version)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SnapGene for molecular cloning (version: 4.2.11)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of chemical inhibitor efficiency against intracellular toxoplasma gondii growth using a luciferase-based growth assay

Toxoplasma gondii er en protozoer patogen, der i vid udstrækning påvirker den menneskelige befolkning. De nuværende antibiotika, der anvendes til behandling af klinisk toxoplasmose er begrænsede. Desuden, de udviser bivirkninger i visse grupper af mennesker. Derfor opdagelse af nye terapeutiske for klinisk toxoplasmose er bydende nødvendigt. Det første skridt i nye antibiotika udvikling er at identificere kemiske forbindelser, der viser høj effekt i hæmning af parasitvækst ved hjælp af en høj gennemløb screening strategi. Som et obligat intracellulært patogen kan Toxoplasma kun replikere i værtsceller, hvilket forbyder brugen af optiske absorbansmålinger som en hurtig indikator for vækst. Præsenteret her er en detaljeret protokol for en luciferase-baseret vækst analyse. Som et eksempel, denne metode bruges til at beregne fordobling tid af vilde-type Toxoplasma parasitter og måle effekten af morflære-leucyl-homophenyl-vinyl sulfon phenyl (LHVS, en cystein protease-målretning sammensatte) med hensyn til hæmning af parasitten intracellulær vækst. Også beskrevet, er en CRISPR-Cas9-baseret gen sletning protokol i Toxoplasma ved hjælp af 50 bp homologe regioner for homologi-afhængige rekombination (HDR). Ved at kvantificere hæmningseffekten af LHVS i vildtype og TgCPL (Toxoplasma cathepsin L-lignende protease)-mangelfuld parasitter, er det påvist, at LHVS hæmmer vildtype parasit vækst mere effektivt end Δcpl vækst, hvilket tyder på, at TgCPL er et mål, lHVS binder sig til i Toxoplasma. Den høje følsomhed og nem betjening af denne luciferase-baserede vækstanalyse gør den velegnet til overvågning af Toxoplasma-spredning og evaluering af lægemidlets effektivitet på en høj gennemløbsmåde.

Figur 1 er et eksempel på en vækstkurve for RHΔku80::NLuc-stammen og den afledte beregning for fordoblingstiden. Generelt, analysen udføres i tre tekniske replikater for hver af de tre biologiske replikater at tage højde for variationer af luciferase aktivitet aflæsninger. For at beregne den normaliserede fold ændring af parasitvækst, hver læsning på 24-96 h post-infektion blev divideret med den indledende læsning på 4 h post-inf...

Watch this Scientific Journal Video about Determination of Chemical Inhibitor Efficiency against Intracellular Toxoplasma Gondii Growth Using a Luciferase-Based Growth Assay at JoVE.com

Determination of Chemical Inhibitor Efficiency against Intracellular Toxoplasma Gondii Growth Using a Luciferase-Based Growth Assay

Præsenteret her er en protokol til at evaluere hæmning effekten af kemiske forbindelser mod in vitro intracellulære vækst af Toxoplasma gondii ved hjælp af en luciferase-baseret vækst assay. Teknikken anvendes til at bekræfte hæmningspecificitet ved genetisk sletning af det tilsvarende målgen. Hæmning en LHVS mod TgCPL protease evalueres som et eksempel.

Bestemmelse af kemisk inhibitor effektivitet mod intracellulære Toxoplasma Gondii vækst ved hjælp af en Luciferase-baseret vækst assay

Toxoplasma gondii is a protozoan pathogen that widely affects the human population. The current antibiotics used for treating clinical toxoplasmosis are ...

Disse følsomme strategier kan bruges til at evaluere hæmningseffekten af kemiske inhibitorer og i kombination med CRISPR-Cas9 gensletning for at undersøge lægemiddelmålene. I stedet for at bruge en endpoint analyse, parasit vækst kan overvåges over tid at tillade beregning af parasit fordobling tid ved hjælp af en følsom reporter protein. Denne analyse kan potentielt skaleres op i 384 eller 1, 536 godt mikroplader til test af flere forbindelser eller til screening af biblioteker i en høj gennemløb måde.Denne strategi kan ændres for at kvantificere væksten af andre intracellulære mikrobielle patogener og deres reaktioner på det stof af interesse. For at udføre en luciferase-baserede Toxoplasma vækst analyse, begynde med omhyggeligt at aspirere mediet fra præ-seedede 96-godt mikroplade kulturer af menneskelige forhud fibroblaster og inokulere 150 mikroliter af parasit B suspension i brøndene i en tre kolonne-fem række format. Efter en fire-timers inkubation i cellen kultur inkubator, omhyggeligt aspirere mediet fra hver brønd til at fjerne de ikke-invaderede parasitter og fylde brønde i hver, men den første række med stuetemperatur phenol rød fri medium.Derefter tilsættes 100 mikroliter af en 12,5 mikromolar luciferase substratopløsning i PBS i hver brønd af den øverste række og inkubere mikropladerne i 10 minutter ved stuetemperatur for at tillade fuld cellelysis. Ved slutningen af inkubationen måles luciferaseaktiviteten på en mikropladelæser. Hver læsning repræsenterer det oprindelige antal invaderede parasitter på fire timer efter infektion.Gentag analysen hver 24. For at beregne den normaliserede fold-ændring af parasit vækst, hver læsning kan divideres med den indledende læsning på fire timer efter infektion. Log 2 af den normaliserede fold-ændring af parasit vækst kan derefter afbildes mod hvert tidspunkt punkt og udsættes for en lineær regression funktion for at opnå hældningen, som repræsenterer fordobling tid.For at vurdere effekten af hæmning af en sammensat af interesse på Toxoplasma vækst, kultur menneskelige forhud fibroblaster i 96-brønd mikroplader i mindst syv dage før podning hver brønd af celler med 150 mikroliters af parasitter som påvist i fire timer ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid. Under inkubationen forberedes rentestoffet i otte forskellige koncentrationer i et 12-brønds reservoir ved serielle fortyndinger. Fortynd forbindelserne i en 12-brønd reservoir på en en-til-tre fortynding ved pipettering hver blanding op og ned flere gange med en en milliliter pipette.Ved fire timer efter infektion, erstatte mediet i hver brønd fra kolonne to til ni med 150 mikroliter af medium suppleret med hver fortynding af forbindelsen, forlader den første kolonne fyldt med regelmæssig medium til at tjene som den ikke-behandlede kontrol. Derefter returneres cellekulturerne til cellekulturskuvøsen i 96 timer, og luciferaseaktiviteten måles for hver brønd for at bestemme procentdelen af væksthæmning i kulturerne ved hver koncentration af forbindelse. For at beregne den normaliserede luciferase aktivitet som en procentdel, dividere den gennemsnitlige luciferase aktivitet for hver sammensat koncentration med den gennemsnitlige luciferase aktivitet afledt af de ikke-behandlede parasitter.Brug derefter et passende grafprogram til at plotte de normaliserede luciferase-aktiviteter mod den enkelte forbindelse og til at beregne den halvmaksimale hæmmende koncentration for hvert stof. At generere en plasmid konstruktion udtrykke single-guide RNA og Cas9 for at slette et gen af interesse, navigere til Toxoplasma Genomics Resource side og hente hele genet kodning sekvens herunder introner og forenæser sammen med 1,5 kilobase fem og tre prime uoversatte regioner. Kopier den hentede TgCPL sekvens i sekvensanalysesoftwaren, og mærk de fem og tre primære uoversatte områder.Klik på Hent, Datafiler og klik på Hent på siden Toxoplasma Genomics Resource, og Current_Release. Vælg FASTA i mappen T.gondii GT1. Fra datamappen skal du downloade filen Toxoplasma gondii GT1 stammegenomsekvens.Opret derefter en lokal mappe med navnet Toxoplasma Genome i DNA-sekvensanalysesoftwaren, og importer Toxoplasma-genomsekvensfilen til mappen. Vælg Værktøjer, Kloning og Find CRISPR-websteder, og angiv tre førsteklasses Cas9-prim på pam-webstedets placering. Vælg et enkelt-guide RNA, der viser en høj specificitet score, generelt større end 98% og mangler et G efter NGG.Den valgte single-guide RNA er normalt placeret på steder tæt på starten og stoppe codons af genet af interesse. Brug derefter en PCR-forblanding med indstillingerne som angivet i tabellen til at udføre en PCR-reaktion for at ændre den allerede eksisterende plasmid, der udtrykker enkelt-guide RNA, der er målrettet TgUPRT-genet. Til Toxoplasma transfektion blandes to mikrogram repareret skabelon-DNA med 20 mikrogram af enkeltstyrede RNA Cas9-udtryksplasmider og blandes 400 mikroliter parasitreuspension, DNA og fem mikroliter på 200 millimolar ATP 500 millimolar reduceret glutathion i et 1,5 milliliter centrifugerør.Tilsæt cytomix buffer for at bringe det samlede volumen op til 500 mikroliter efter behov og overføre parasit-DNA-blandingen til en fire millimeter hul med elektroporation cuvette. Derefter elektroporate parasitter på to kilovolts og 50 ohm af modstand. At klone knockout parasitter, først udføre en to-trins fortynding af parasitter for at opnå en 10 parasitter pr milliliter D10 medium suppleret med den relevante antibiotika koncentration.Dernæst overføre 150 mikroliter af de resuspenderede rensede parasitter til hver brønd af en 96-brønd mikroplade pre-seedet med forhud fibroblaster og inkubere mikropladen ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid i syv dage. Ved inkubationens afslutning identificeres brøndene med en enkelt plak, og der overføres 75 mikroliter af de resuspenderede Toxoplasma-inficerede forhudfibroblaster fra hver brønd af den 96-brønd mikropladekultur til individuelle 1,5 milliliterrør. Cellerne opsamls ved centrifugering og resuspendrer pellets i 10,25 mikroliter lysisbuffer, der indeholder fortyndingsbuffer i DNA-frigivelsestilsætningsstoffet.Derefter inkubere prøverne i fire minutter ved stuetemperatur og to minutter ved 98 grader Celsius, før du udfører PCR at teste for integrationen af resistens kassette og tab af genet af interesse. Hæmningseffekten af LHVS og vildtype i delta CPL-stammer kan bestemmes ved at plotte deres luciferaseaktiviteter mod forskellige inhibitorkoncentrationer. Efter PCR, er den muterede plasmid lineariseret og indlæst i en 1%agarose gel til verifikation af en vellykket forstærkning.Efter gelekstraktion og E.coli-transformation kan kloner, der indeholder de forventede plasmider, screenes ved begrænsning af endonucleasefordring i DNA-sekvensering. Efter forstærkning af reparationsskabelonen kan agarosegelelektroforese bruges til at kontrollere PCR-produktets korrekte størrelse. Generelt er syv til otte kloner udvalgt til den indledende screening for at kontrollere for sletning af kodning sekvens af genet af interesse, efterfulgt af påvisning af de fem og tre primære arme til at hjælpe minimalisere det samlede antal kloner, der skal screenes.Yderligere verifikation kan afsluttes ved immunblotting, hvis nogen antistof anerkende målet protein er tilgængelig. Før der opnås luciferase aktivitetsmålinger, skal en klar mikroplade med en mock-infektion kontrolleres under et mikroskop for at sikre, at parasitterne ikke fuldt ud lyse værtscellerne.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Determination of Chemical Inhibitor Efficiency against Intracellular Toxoplasma Gondii Growth Using a Luciferase-Based Growth Assay

Obtaining Highly Purified Toxoplasma gondii Oocysts by a Discontinuous Cesium Chloride Gradient

Obtaining Highly Purified Toxoplasma gondii Oocysts by a Discontinuous Cesium Chloride Gradient

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular protozoan pathogen that commonly infects humans. It is a well characterized apicomplexan associated with ...

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii ...

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Lymphocytes, such as T cells, undergo genetic V(D)J recombination, to generate a receptor with a certain specificity1. Mice transgenic for a rearranged ...

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

En genetisk skærm for at isolere Toxoplasma gondii Host-celle afstigningstrin Mutants

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth ...

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Vækst af Mycobacterium tuberculosis Biofilm

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

En Parasite Rescue og transformationsassay for Antileishmanial Screening mod intracellulære<em&gt; Leishmania donovani</em&gt; Amastigoter i THP1 human akut monocytisk leukæmi cellelinje

Leishmaniasis is  one of the world's most neglected diseases, largely affecting the  poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million ...

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

Staphylococcus aureus Vækst med humant hæmoglobin som en jernkilde

S. aureus is a pathogenic bacterium that requires iron to  carry out vital metabolic functions and cause disease. The most abundant  reservoir of iron ...

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Genetisk Manipulation i<em&gt; Δku80</em&gt; Stammer til Functional Genomisk Analyse af<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Brug fluorescerende proteiner til at visualisere og kvantificere<em&gt; Chlamydia</em&gt; Vakuole Vækst Dynamics i levende celler

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Forward Genetik skærme med makrofager til at identificere<em&gt; Toxoplasma gondii</em&gt; Gener Vigtigt for Modstand mod IFN-γ-Dependent Cell Autonome Immunitet

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within ...