Name: determination of chemical inhibitor efficiency against intracellular toxoplasma gondii growth using a luciferase-based growth assay
Uploaded: 2020-04-29T13:30:00
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Gli autori desiderano ringraziare i dottori Sibley e Carruthers per aver condiviso pSAG1-Cas9-sgRNA-TgUPRT plasmid e anticorpi anti-TgCPL e TgActin. Questo lavoro è stato sostenuto dal fondo Clemson Startup (a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta e nell'analisi dei dati, nella decisione di pubblicazione o nella preparazione del manoscritto.

Toxoplasma gondii è classificato nel Gruppo di Rischio 2 e deve essere gestito a livello di biosicurezza 2 (BSL-2). Il protocollo è stato rivisto e approvato dal Comitato di Biosicurezza Istituzionale dell'Università di Clemson.
1. Saggio sulla crescita di Toxoplasma basato su Luciferate
<ol><li>Fibroblasti di prepuzio umano di semi (HFF) 1 settimana prima dell'inoculazione dei parassiti per garantire che le cellule ospiti siano completamente confluenti. Eseguire un sagg...

<ol>
	<li>Blader, I. J., Coleman, B. I., Chen, C. T., Gubbels, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lytic+Cycle+of+Toxoplasma+gondii:+15+Years+Later.">Lytic Cycle of Toxoplasma gondii: 15 Years Later.</a> Annual Review of Microbiology. 69 (1), 1-23 (2014).</li><li>Jones, J. L., Kruszon-Moran, D., Rivera, H., Price, C., Wilkins, P. 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J., Li, C., Striepen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Growth+Assay+for+Toxoplasma+gondii+Using+Yellow+Fluorescent+Protein.">High-Throughput Growth Assay for Toxoplasma gondii Using Yellow Fluorescent Protein.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (1), 309-316 (2003).</li><li>Touquet, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+imaging+assay+to+evaluate+Toxoplasma+gondii+infection+and+proliferation:+A+multiparametric+assay+to+screen+new+compounds.">High-content imaging assay to evaluate Toxoplasma gondii infection and proliferation: A multiparametric assay to screen new compounds.</a> PLoS ONE. 13 (8), e0201678 (2018).</li><li>Thornton, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ortholog+of+Plasmodium+falciparum+chloroquine+resistance+transporter+(PfCRT)+plays+a+key+role+in+maintaining+the+integrity+of+the+endolysosomal+system+in+Toxoplasma+gondii+to+facilitate+host+invasion.">An ortholog of Plasmodium falciparum chloroquine resistance transporter (PfCRT) plays a key role in maintaining the integrity of the endolysosomal system in Toxoplasma gondii to facilitate host invasion.</a> PLOS Pathogens. 15 (6), e1007775 (2019).</li><li>Larson, E. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Gene+Disruption+in+Diverse+Strains+of+Toxoplasma+gondii+Using+CRISPR/CAS9.">Efficient Gene Disruption in Diverse Strains of Toxoplasma gondii Using CRISPR/CAS9.</a> mBio. 5 (3), e01114-14 (2014).</li><li>Radke, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+cell+cycle+for+the+tachyzoite+stage+of+Toxoplasma+gondii.">Defining the cell cycle for the tachyzoite stage of Toxoplasma gondii.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 115 (2), 165-175 (2001).</li><li>Ran, A. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+highly+active+sgRNAs+for+CRISPR-Cas9-mediated+gene+inactivation.">Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation.</a> Nature Biotechnology. 32 (12), 1262-1267 (2014).</li><li>Sidik, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Genome-wide+CRISPR+Screen+in+Toxoplasma+Identifies+Essential+Apicomplexan+Genes.">A Genome-wide CRISPR Screen in Toxoplasma Identifies Essential Apicomplexan Genes.</a> Cell. 166 (6), 1423-1435 (2016).</li></ol>

Questo protocollo descrive un protocollo basato su luciferasi per valutare la crescita intracellulare del Toxoplasma e valutare l'efficacia dell'inibizione dei composti chimici contro la crescita dei parassiti. Rispetto alle strategie esistenti per misurare la crescita intracellulare del Toxoplasma, questo metodo presenta un'elevata sensibilità e specificità. Durante il monitoraggio della crescita del parassita, si raccomanda un saggio fittizio in una micropiastra chiara 96 bene per confermare che il ...

Toxoplasma gondii è un parassita intracellulare di grande successo che infetta circa un terzo della popolazione umana. Il suo alto tasso di trasmissione è principalmente dovuto alle sue diverse vie di trasmissione, tra cui il consumo di carne poco cotta, l'esposizione ai serbatoi di mammiferi e la trasmissione congenita durante la nascita. T. gondii provoca principalmente infezioni opportunistiche che possono portare a una grave morbilità e mortalità in individui immunocompromessi1,2,3,4,5,6. Gli antibiotici attualmente utilizzati per il trattamento della toxoplasmosi acuta sono particolarmente inefficienti nel trattamento delle infezioni congenite e latenti e causano gravi reazioni in alcuni individui3,7,8. Pertanto, esiste un'urgente necessità di identificare nuove terapie. Comprendere le differenze nei processi subcellulari all'interno di Toxoplasma e del suo ospite aiuterà a identificare potenziali bersagli farmacologici. Pertanto, sono necessarie tecniche di manipolazione del genoma efficienti e convenienti per studiare i ruoli dei singoli geni all'interno di Toxoplasma. Inoltre, Toxoplasma appartiene al phylum Apicomplexa, che include diversi altri patogeni umani significativi, come Plasmodium spp. e Cryptosporidium spp. Quindi, Toxoplasma può essere utilizzato come organismo modello per aiutare a studiare la biologia di base in altri parassiti apicomplessi.
Per identificare nuovi antibiotici contro gli agenti patogeni microbici, viene inizialmente eseguito lo screening ad alto throughput di una biblioteca di composti chimici per determinarne l'efficacia nella repressione della crescita microbica. Finora, sono stati sviluppati diversi saggi di crescita basati su microplaciper per misurare la crescita intracellulare di T. gondii (cioè, quantificazione radioattiva 3H-uracil basata sull'incorporazione9, rilevamento quantitativa dei parassiti a base di ELISA utilizzando anticorpi specifici T. gondii10,11, misurazione basata sulle proteine dei reporter utilizzando ceppi Toxoplasma che esprimono YFP12,13e un'imaging ad alto contenuto recentemente sviluppata comesay14).
Queste strategie individuali hanno tutti vantaggi unici; tuttavia, alcune limitazioni limitano anche le loro applicazioni. Ad esempio, poiché il toxoplasma può replicarsi solo all'interno di cellule animali nucleate, l'autofluorescenza e il legame non specifico di anticorpi anti-T.gondii per ospitare le cellule causano interferenze nelle misurazioni basate sulla fluorescenza. Inoltre, l'uso di isotopi radioattivi richiede una particolare conformità alla sicurezza e potenziali problemi di sicurezza. Alcuni di questi saggi sono più adatti per valutare la crescita in un unico momento piuttosto che un monitoraggio continuo della crescita.
Presentato qui è un protocollo basato su luciferasi per la quantificazione della crescita intracellulare del Toxoplasma. In uno studio precedente, il gene della luciferasi di NanoLuc è stato clonato sotto il promotore di tubulina Toxoplasma, e questo costrutto di espressione luciferasi è stato transincato in parassiti di tipo selvaggio (RHku80) per creare un RHku80zhxg::ceppo NLuc (chiamato RHku80::NLuc qui dopo)15. Questo ceppo è servito come ceppo parentale per la determinazione della crescita intracellulare e la delezione genica in questo studio. Utilizzando il ceppoRH-ku80::NLuc, la crescita dei parassiti nei fibroblasti prepuzio (HFF) è stata monitorata in un periodo di 96 ore dopo l'infezione per calcolare il tempo di raddoppio del parassita.
Inoltre, l'efficacia dell'inibizione di LHVS contro la crescita dei parassiti può essere determinata tracciando i tassi di crescita di Toxoplasma contro le concentrazioni seriali di LHVS per identificare il valore di IC50. Letteratura precedente ha riferito che TgCPL è un obiettivo principale di LHVS nei parassiti e che il trattamento con LHVS diminuisce lo sviluppo di infezioni toxoplasma acute e croniche16,17,18,19. Inoltre, ilku80ceppo parentale per la modifica del genoma èstato utilizzato come ceppo parentale per generare un ceppo TgCPL-deficiente (RHku80::NLuc), e l'inibizione di LHVS è stata misurata rispetto a questo mutante. Osservando un upshift di valori DiC50 per LHVS nei parassiti carenti di TgCPLrispetto al ceppo WT, è stato convalidato che TgCPL è preso di mira da LHVS in vivo.
In questo protocollo, RHku80::NLuc viene utilizzato come ceppo parentale, che manca di un efficiente percorso di giunzione finale non omologa (NHEJ), facilitando così la ricombinazione dipendente da omologia crossover (HDR)20,21. Inoltre, le regioni omologhe di 50 bp sono affiancate ad entrambe le estremità di una cassetta di resistenza ai farmaci da PCR. Il prodotto PCR funge da modello di riparazione per rimuovere l'intero locus genico tramite HDR utilizzando strumenti di editing del genoma basati su CRISPR-Cas9. Tali regioni omologhe brevi possono essere facilmente incorporate in primer, fornendo una comoda strategia per la produzione del modello di riparazione. Questo protocollo può essere modificato per eseguire la delezione genica universale e l'etichettatura genica endogena.
Ad esempio, nella nostra pubblicazione più recente, tre geni proteasi, TgCPL, TgCPB ( Proteasi a cathepsina B-comeToxoplasma) e TgSUB1 ( proteasi simile allatossoplasma 1), sono stati geneticamente ablati in TgCRT (Toxoplasma cloroleccanter-resistanceer) parassiti carenti utilizzando questo metodo15. Inoltre, TgAMN (aminopeptidase putativo N [TgAMN, TGGT1_221310]) è stato etichettato endogenamente15. Il laboratorio di Lourido ha anche riferito di aver usato brevi regioni omologhe nell'intervallo di 40-43 bp per l'introduzione della mutazione genica diretta dal sito e dell'etichettatura genica endogena nel genoma del Toxoplasma utilizzando un metodo simile22. Queste modifiche del genoma di successo suggeriscono che una regione omologa di 40-50 bp è sufficiente per una ricombinazione efficiente del DNA nel ceppo tgKU80-carente,che semplifica notevolmente la manipolazione del genoma in Toxoplasma gondii.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose gel extraction kit</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>T1020L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0316S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotek Synergy H1 Hybrid Multi-Mode Microplate Reader</td>
			<td>BioTek Instuments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BTX Gemini Twin Waveform Electroporation System</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemically competent E. coli cells</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>C29871</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CloneAmp HiFi PCR premix</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>639298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coelenterazine h</td>
			<td>Prolume</td>
			<td>301-10 hCTZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRV</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3195S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phire Tissue Direct PCR Master Mix</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>F170L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid miniprep kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 Site-Directed Mutagenesis kit</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E0554S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geneious software for sgRNA design (version: R11)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism software (8th version)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SnapGene for molecular cloning (version: 4.2.11)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of chemical inhibitor efficiency against intracellular toxoplasma gondii growth using a luciferase-based growth assay

Il toxoplasma gondii è un patogeno protozoo che colpisce ampiamente la popolazione umana. Gli attuali antibiotici utilizzati per il trattamento della toxoplasmosi clinica sono limitati. Inoltre, essi esibiscono effetti collaterali negativi in alcuni gruppi di persone. Pertanto, la scoperta di nuove terapie per la toxoplasmosi clinica è imperativa. Il primo passo dello sviluppo di nuovi antibiotici è quello di identificare composti chimici che mostrano un'elevata efficacia nell'inibizione della crescita dei parassiti utilizzando una strategia di screening ad alto throughput. Come agente patogeno intracellulare obbligato, Toxoplasma può replicarsi solo all'interno delle cellule ospiti, il che vieta l'uso di misurazioni ottiche di assorbimento come indicatore rapido della crescita. Presentato qui è un protocollo dettagliato per un saggio di crescita di luciferasi. Ad esempio, questo metodo viene utilizzato per calcolare il tempo di raddoppio dei parassiti Toxoplasma di tipo selvatico e misurare l'efficacia del morfnurea-leucyl-omofenicolo-vicinquel-vinile sulfone fenil (LHVS, un composto che mira la proteasi cisteina) per quanto riguarda l'inibizione della crescita intracellulare. È stato descritto anche un protocollo di eliminazione genica basato su CRISPR-Cas9 nel Toxoplasma che utilizza regioni omologhe da 50 bp per la ricombinazione dipendente dall'omologia (HDR). Quantificando i efficacidi di inibizione di LHVS in wild-type e TgCPL (Toxoplasma cathepsin L-like protease)-deficiente-deficiente parassiti, è dimostrato che LHVS inibisce la crescita del parassita di tipo selvatico più efficiente rispetto alla crescita zcpl, suggerendo che TgCPL è un obiettivo che LHVS si lega a Toxo. L'elevata sensibilità e il facile funzionamento di questo analisi della crescita di luciferasi lo rendono adatto per monitorare la proliferazione di Toxoplasma e valutare l'efficacia dei farmaci in modo ad alto consumo.

La figura 1 rappresenta un esempio di una curva di crescita per la deformazioneRH-ku80::NLuc e il calcolo derivato per il tempo di raddoppio. Generalmente, il saggio viene eseguito in tre repliche tecniche per ciascuna delle tre repliche biologiche per tenere conto delle variazioni delle letture di attività luciferasi. Al fine di calcolare il cambiamento di piega normalizzata della crescita del parassita, ogni lettura a 24-96 h post-infezio...

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Determination of Chemical Inhibitor Efficiency against Intracellular Toxoplasma Gondii Growth Using a Luciferase-Based Growth Assay

Presentato qui è un protocollo per valutare l'efficacia dell'inibizione dei composti chimici contro la crescita intracellulare in vitro di Toxoplasma gondii utilizzando un analisi della crescita basata sulla luciferasi. La tecnica viene utilizzata per confermare la specificità dell'inibizione mediante la delezione genetica del gene bersaglio corrispondente. L'inibizione di LHVS contro la proteasi TgCPL viene valutata come esempio.

Determinazione dell'efficienza dell'inibitore chimico contro la crescita intracellulare del Toxoplasma Gondii utilizzando un saggio di crescita basato su Luciferase

Toxoplasma gondii is a protozoan pathogen that widely affects the human population. The current antibiotics used for treating clinical toxoplasmosis are ...

Queste strategie sensibili possono essere utilizzate per valutare l'efficacia di inibizione degli inibitori chimici e in combinazione con la delezione genica CRISPR-Cas9 per indagare gli obiettivi del farmaco. Invece di usare un test endpoint, la crescita dei parassiti può essere monitorata nel tempo per consentire il calcolo del tempo di raddoppio dei parassiti utilizzando una proteina reporter sensibile. Questo saggio può potenzialmente essere scalato in micropiatte a 384 o 1.536 pozzi per il test di più composti o per lo screening delle librerie in modo ad alta produttività.Questa strategia può essere modificata per quantificare la crescita di altri agenti patogeni microbici intracellulari e le loro risposte al farmaco di interesse. Per eseguire un test di crescita del Toxoplasma a base di luciferasi, iniziare aspirando attentamente il mezzo da colture micropiatte pre-seminate a 96 pozzetti di fibroblasti di prepuzio umano e inoculare 150 microlitri di sospensione del parassita B nei pozzi in un formato a tre colonne cinque file. Dopo un'incubazione di quattro ore nell'incubatore di coltura cellulare, aspirare attentamente il mezzo da ogni pozzo per rimuovere i parassiti non invasi e riempire i pozzi in ciascuna ma la prima fila con mezzo privo di fenolo rosso a temperatura ambiente.Quindi aggiungere 100 microlitri di una soluzione di substrato di luciferasi micromolare 12,5 in PBS in ogni pozzo della fila superiore e incubare le micropiatte per 10 minuti a temperatura ambiente per consentire la lisi cellulare completa. Al termine dell'incubazione, misurare l'attività della luciferasi su un lettore di micropiatte. Ogni lettura rappresenta il numero iniziale di parassiti invasi a quattro ore dopo l'infezione.Ripetere l'analisi ogni 24 ore per i prossimi quattro giorni senza cambiare il mezzo. Per calcolare il cambio di piegatura normalizzato della crescita dei parassiti, ogni lettura può essere divisa per la lettura iniziale a quattro ore dopo l'infezione. Il log 2 del cambio di piegatura normalizzato della crescita dei parassiti può quindi essere tracciato contro ogni punto di tempo e sottoposto a una funzione di regressione lineare per ottenere la pendenza che rappresenta il tempo di raddoppio.Per valutare l'efficacia dell'inibizione di un composto di interesse sulla crescita del Toxoplasma, coltura di fibroblasti di prepuzio umano in micropiastrine da 96 pozzetti per almeno sette giorni prima di inoculare ogni pozzo di cellule con 150 microlitri di parassiti come dimostrato per quattro ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Durante l'incubazione, preparare il composto di interesse a otto diverse concentrazioni in un serbatoio di 12 pozzi per diluizione seriale. Diluire i composti in un serbatoio di 12 pozzetti in una diluizione uno-a-tre tubazione ogni miscela su e giù più volte con una pipetta da un millilitro.A quattro ore dall'infezione, sostituire il mezzo in ogni pozzo dalle colonne da due a nove con 150 microlitri di mezzo integrati con ogni diluizione del composto, lasciando la prima colonna riempita con mezzo regolare per fungere da controllo non trattato. Quindi riportare le colture cellulari nell'incubatore di coltura cellulare per 96 ore e misurare l'attività della luciferasi per ogni pozzo per determinare la percentuale di inibizione della crescita nelle colture ad ogni concentrazione di composto. Per calcolare l'attività della luciferasi normalizzata come percentuale, dividere l'attività media della luciferasi per ogni concentrazione composta per l'attività media della luciferasi derivata dai parassiti non trattati.Quindi utilizzare un programma software di grafo appropriato per tracciare le attività della luciferasi normalizzata rispetto al singolo composto e per calcolare la concentrazione inibitoria semi massima per ogni composto. Per generare un costrutto plasmide che esprime RNA a guida singola e Cas9 per eliminare un gene di interesse, passare alla pagina Toxoplasma Genomics Resource e recuperare l'intera sequenza di codifica genica inclusi gli introni e gli esoni insieme alle 1,5 kilobase cinque e tre regioni prime non tradotte. Copiare la sequenza TgCPL recuperata nel software di analisi delle sequenze ed etichettare le cinque e tre prime regioni non tradotte.Nella pagina Risorsa genomica Toxoplasma fare clic su Download, File di dati e Current_Release. Nella cartella T.gondii GT1 selezionare FASTA. Dalla cartella dati, scaricare il file di sequenza del genoma del ceppo Toxoplasma gondii GT1.Quindi creare una cartella locale chiamata Toxoplasma Genome nel software di analisi della sequenza del DNA e importare il file di sequenza del genoma del Toxoplasma nella cartella. Selezionate Strumenti (Tools), Clonazione (Cloning) e Trova siti CRISPR (Find CRISPR Sites) e impostate tre cas9 prime prime per la posizione del sito PAM. Selezionare un RNA a guida singola che dimostri un punteggio di specificità elevato, generalmente maggiore del 98% e privo di una G che segue l'NGG.L'RNA a guida singola selezionato si trova di solito in siti vicini all'inizio e ferma i codoni del gene di interesse. Quindi utilizzare una premiscela PCR con le impostazioni come indicato nella tabella per eseguire una reazione PCR per modificare il plasmide preesistente esprimendo RNA a guida singola che prende di mira il gene TgUPRT. Per la trasfezione di Toxoplasma, mescolare due microgrammi di DNA modello riparato con 20 microgrammi dei plasmidi di espressione RNA Cas9 a guida singola e mescolare 400 microlitri di resospensione parassita, DNA e cinque microlitri di 200 millimolare ATP 500 millimolare ridotto glutatione in un tubo di centrifuga da 1,5 millilitri.Aggiungere il buffer cytomix per portare il volume totale fino a 500 microlitri se necessario e trasferire la miscela di DNA del parassita in uno spazio di quattro millimetri con cuvetta di elettroporazione. Quindi elettroporare i parassiti a due kilovolt e 50 ohm di resistenza. Per clonare i parassiti knockout, eseguire prima una diluizione in due fasi dei parassiti per ottenere 10 parassiti per millilitro di mezzo D10 integrato con l'appropriata concentrazione antibiotica.Successivamente, trasferire 150 microlitri dei parassiti purificati rimescolati in ogni pozzo di una micropiastra a 96 pozzetti pre-seminata con fibroblasti di prepuzio e incubare la micropiastra a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per sette giorni. Al termine dell'incubazione, identificare i pozzi contenenti una singola placca e trasferire 75 microlitri dei fibroblasti del prepuzio umano resopensi infetti da Toxoplasma da ogni pozzo della coltura di micropiastrine a 96 pozzetti in singoli tubi da 1,5 millilitri. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione e rimescolare il pellet in 10,25 microlitri di tampone di lisi contenente tampone di diluizione nell'additivo per il rilascio del DNA.Quindi incubare i campioni per quattro minuti a temperatura ambiente e due minuti a 98 gradi Celsius prima di eseguire PCR per testare l'integrazione della cassetta di resistenza al farmaco e la perdita del gene di interesse. Gli efficaci di inibizione dell'LHVS e del tipo selvatico nei ceppi delta CPL possono essere determinati tracciando le loro attività di luciferasi contro diverse concentrazioni di inibitori. Dopo la PCR, il plasmide mutato viene linearizzato e caricato in un gel di agarosio dell'1% per la verifica di un'amplificazione riuscita.Dopo l'estrazione del gel e la trasformazione di E.coli, i cloni contenenti i plasmidi previsti possono essere schermati per restrizione della digestione dell'endonucleasi nel sequenziamento del DNA. Dopo l'amplificazione del modello di riparazione, l'elettroforesi del gel di agarosio può essere utilizzata per verificare le dimensioni corrette del prodotto PCR. Generalmente, da sette a otto cloni sono selezionati per lo screening iniziale per verificare la cancellazione della sequenza di codifica del gene di interesse, seguita dal rilevamento dei cinque e tre bracci primi per aiutare a minimizzare il numero totale di cloni da vagliare.Un'ulteriore verifica può essere completata mediante immunoblotting se è disponibile un anticorpo che riconosca la proteina bersaglio. Prima di ottenere misurazioni dell'attività della luciferasi, una micropiatta chiara con una finta infezione deve essere controllata al microscopio per garantire che i parassiti non liscivino completamente le cellule ospiti.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Determination of Chemical Inhibitor Efficiency against Intracellular Toxoplasma Gondii Growth Using a Luciferase-Based Growth Assay

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Ricerca

Immunologia e infezioni

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