Name: determination of chemical inhibitor efficiency against intracellular toxoplasma gondii growth using a luciferase-based growth assay
Uploaded: 2020-04-29T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of Chemical Inhibitor Efficiency against Intracellular Toxoplasma Gondii Growth Using a Luciferase-Based Growth Assay at JoVE.com

Författarna vill tacka Drs. Sibley och Carruthers för att dela pSAG1-Cas9-sgRNA-TgUPRT plasmid och anti-TgCPL och TgActin antikroppar. Detta arbete stöddes av Clemson Startup fond (till Z.D.), Knights Templar Eye Foundation Pediatric Oftalmologi Career-Starter Research Grant (till Z.D.), ett pilotbidrag av en NIH COBRE bidrag P20GM109094 (till Z.D.), och NIH R01AI143707 (till Z.D.). Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera eller förbereda manuskriptet.

Toxoplasma gondii kategoriseras i riskgrupp 2 och måste hanteras på biosäkerhetsnivå 2 (BSL-2). Protokollet har granskats och godkänts av den institutionella biosäkerhetskommittén vid Clemson University.
1. Luciferase-baserade Toxoplasma tillväxtanalys
<ol><li>Utsäde mänskliga framskinn fibroblaster (HFFs) 1 vecka före parasit inokulering för att säkerställa att värdceller är helt konfluenta. Utför en mock analys i en transparent platta för att säkerstäl...

<ol>
	<li>Blader, I. J., Coleman, B. I., Chen, C. T., Gubbels, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lytic+Cycle+of+Toxoplasma+gondii:+15+Years+Later.">Lytic Cycle of Toxoplasma gondii: 15 Years Later.</a> Annual Review of Microbiology. 69 (1), 1-23 (2014).</li><li>Jones, J. L., Kruszon-Moran, D., Rivera, H., Price, C., Wilkins, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii+Seroprevalence+in+the+United+States+2009-2010+and+Comparison+with+the+Past+Two+Decades.">Toxoplasma gondii Seroprevalence in the United States 2009-2010 and Comparison with the Past Two Decades.</a> The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 90 (6), (2014).</li><li>Kieffer, F., Wallon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenital+toxoplasmosis.">Congenital toxoplasmosis.</a> Handbook of Clinical Neurology. 112, 1099-1101 (2013).</li><li>Hoffmann, S., Batz, M. B., Morris, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Annual+cost+of+illness+and+quality-adjusted+life+year+losses+in+the+United+States+due+to+14+foodborne+pathogens.">Annual cost of illness and quality-adjusted life year losses in the United States due to 14 foodborne pathogens.</a> Journal of Food Protection. 75 (7), 1292-1302 (2012).</li><li>Dubey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasmosis.">Toxoplasmosis.</a> Journal of the American Veterinary Medical Association. 205 (11), 1593-1598 (1994).</li><li>Lindsay, D., Dubey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii:+the+changing+paradigm+of+congenital+toxoplasmosis.">Toxoplasma gondii: the changing paradigm of congenital toxoplasmosis.</a> Parasitology. 138 (14), 1-3 (2011).</li><li>Deng, Y., Wu, T., Zhai, S., Li, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+on+anti-Toxoplasma+drugs+discovery:+Design,+synthesis+and+screening.">Recent progress on anti-Toxoplasma drugs discovery: Design, synthesis and screening.</a> European Journal of Medicinal Chemistry. 183, 111711 (2019).</li><li>Butler, N. J., Furtado, J. M., Winthrop, K. L., Smith, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+toxoplasmosis+II:+clinical+features,+pathology+and+management.">Ocular toxoplasmosis II: clinical features, pathology and management.</a> Clinical &amp; Experimental Ophthalmology. 41 (1), 95-108 (2013).</li><li>Pfefferko, E., Pfefferko, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+Labeling+of+Intracellular+Toxoplasma+gondii+with+Uracil.">Specific Labeling of Intracellular Toxoplasma gondii with Uracil.</a> Journal of Eukaryotic Microbiology. 24 (3), 449-453 (1977).</li><li>Merli, A., Canessa, A., Melioli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme+immunoassay+for+evaluation+of+Toxoplasma+gondii+growth+in+tissue+culture.">Enzyme immunoassay for evaluation of Toxoplasma gondii growth in tissue culture.</a> Journal of Clinical Microbiology. 21 (1), 88-91 (1985).</li><li>Derouin, F., Chastang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme+immunoassay+to+assess+effect+of+antimicrobial+agents+on+Toxoplasma+gondii+in+tissue+culture.">Enzyme immunoassay to assess effect of antimicrobial agents on Toxoplasma gondii in tissue culture.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 32 (3), 303-307 (1988).</li><li>McFadden, D., Seeber, F., Boothroyd, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Toxoplasma+gondii+expressing+beta-galactosidase+for+colorimetric+assessment+of+drug+activity+in+vitro.">Use of Toxoplasma gondii expressing beta-galactosidase for colorimetric assessment of drug activity in vitro.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 41 (9), 1849-1853 (1997).</li><li>Gubbels, M. J., Li, C., Striepen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Growth+Assay+for+Toxoplasma+gondii+Using+Yellow+Fluorescent+Protein.">High-Throughput Growth Assay for Toxoplasma gondii Using Yellow Fluorescent Protein.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (1), 309-316 (2003).</li><li>Touquet, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+imaging+assay+to+evaluate+Toxoplasma+gondii+infection+and+proliferation:+A+multiparametric+assay+to+screen+new+compounds.">High-content imaging assay to evaluate Toxoplasma gondii infection and proliferation: A multiparametric assay to screen new compounds.</a> PLoS ONE. 13 (8), e0201678 (2018).</li><li>Thornton, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ortholog+of+Plasmodium+falciparum+chloroquine+resistance+transporter+(PfCRT)+plays+a+key+role+in+maintaining+the+integrity+of+the+endolysosomal+system+in+Toxoplasma+gondii+to+facilitate+host+invasion.">An ortholog of Plasmodium falciparum chloroquine resistance transporter (PfCRT) plays a key role in maintaining the integrity of the endolysosomal system in Toxoplasma gondii to facilitate host invasion.</a> PLOS Pathogens. 15 (6), e1007775 (2019).</li><li>Larson, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii+cathepsin+L+is+the+primary+target+of+the+invasion-inhibitory+compound+morpholinurea-leucyl-homophenyl-vinyl+sulfone+phenyl.">Toxoplasma gondii cathepsin L is the primary target of the invasion-inhibitory compound morpholinurea-leucyl-homophenyl-vinyl sulfone phenyl.</a> The Journal of Biological Chemistry. 284 (39), 26839-26850 (2009).</li><li>Dou, Z., McGovern, O. L., Cristina, M., Carruthers, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii+Ingests+and+Digests+Host+Cytosolic+Proteins.">Toxoplasma gondii Ingests and Digests Host Cytosolic Proteins.</a> mBio. 5 (4), e01188-14 (2014).</li><li>Cristina, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+depends+on+lysosomal+consumption+of+autophagosomes+for+persistent+infection.">Toxoplasma depends on lysosomal consumption of autophagosomes for persistent infection.</a> Nature Microbiology. 2, 17096 (2017).</li><li>Parussini, F., Coppens, I., Shah, P. P., Diamond, S. L., Carruthers, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cathepsin+L+occupies+a+vacuolar+compartment+and+is+a+protein+maturase+within+the+endo/exocytic+system+of+Toxoplasma+gondii.">Cathepsin L occupies a vacuolar compartment and is a protein maturase within the endo/exocytic system of Toxoplasma gondii.</a> Molecular Microbiology. 76 (6), 1340-1357 (2010).</li><li>Huynh, M. H., Carruthers, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tagging+of+endogenous+genes+in+a+Toxoplasma+gondii+strain+lacking+Ku80.">Tagging of endogenous genes in a Toxoplasma gondii strain lacking Ku80.</a> Eukaryotic cell. 8 (4), 530-539 (2009).</li><li>Fox, B. A., Ristuccia, J. G., Gigley, J. P., Bzik, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+replacements+in+Toxoplasma+gondii+strains+deficient+for+nonhomologous+end+joining.">Efficient gene replacements in Toxoplasma gondii strains deficient for nonhomologous end joining.</a> Eukaryotic Cell. 8 (4), 520-529 (2009).</li><li>Sidik, S. M., Hackett, C. G., Tran, F., Westwood, N. J., Lourido, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Genome+Engineering+of+Toxoplasma+gondii+Using+CRISPR/Cas9.">Efficient Genome Engineering of Toxoplasma gondii Using CRISPR/Cas9.</a> PLoS ONE. 9 (6), e100450 (2014).</li><li>Shen, B., Brown, K. M., Lee, T. D., Sibley, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Gene+Disruption+in+Diverse+Strains+of+Toxoplasma+gondii+Using+CRISPR/CAS9.">Efficient Gene Disruption in Diverse Strains of Toxoplasma gondii Using CRISPR/CAS9.</a> mBio. 5 (3), e01114-14 (2014).</li><li>Radke, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+cell+cycle+for+the+tachyzoite+stage+of+Toxoplasma+gondii.">Defining the cell cycle for the tachyzoite stage of Toxoplasma gondii.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 115 (2), 165-175 (2001).</li><li>Ran, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li><li>Labun, K., Montague, T. G., Gagnon, J. A., Thyme, S. B., Valen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CHOPCHOP+v2:+a+web+tool+for+the+next+generation+of+CRISPR+genome+engineering.">CHOPCHOP v2: a web tool for the next generation of CRISPR genome engineering.</a> Nucleic Acids Research. 44 (W1), W272-W276 (2016).</li><li>Heigwer, F., Kerr, G., Boutros, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-CRISP:+fast+CRISPR+target+site+identification.">E-CRISP: fast CRISPR target site identification.</a> Nature Methods. 11 (2), 2812 (2014).</li><li>Peng, D., Tarleton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EuPaGDT:+a+web+tool+tailored+to+design+CRISPR+guide+RNAs+for+eukaryotic+pathogens.">EuPaGDT: a web tool tailored to design CRISPR guide RNAs for eukaryotic pathogens.</a> Microbial Genomics. 1 (4), e000033 (2015).</li><li>Doench, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+highly+active+sgRNAs+for+CRISPR-Cas9-mediated+gene+inactivation.">Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation.</a> Nature Biotechnology. 32 (12), 1262-1267 (2014).</li><li>Sidik, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Genome-wide+CRISPR+Screen+in+Toxoplasma+Identifies+Essential+Apicomplexan+Genes.">A Genome-wide CRISPR Screen in Toxoplasma Identifies Essential Apicomplexan Genes.</a> Cell. 166 (6), 1423-1435 (2016).</li></ol>

++Detta protokoll beskriver ett luciferasbaserat protokoll för att bedöma intracellulär Toxoplasmatillväxt och utvärdera hämningseffekten av kemiska föreningar mot parasittillväxt. Jämfört med de befintliga strategier som finns tillgängliga för att mäta intracellulär Toxoplasma tillväxt, uppvisar denna metod hög känslighet och specificitet. Vid övervakning av parasitens tillväxt rekommenderas en mock-analys i en tydlig 96-brunnsmikroplate för att bekräfta att den testade stammen int...

Toxoplasma gondii är en mycket framgångsrik obligate intracellulär parasit som infekterar ungefär en tredjedel av den mänskliga befolkningen. Dess höga överföringshastighet beror främst på dess olika överföringsvägar, inklusive konsumtion av underkokt kött, exponering för däggdjursreservoarer och medfödd överföring under födseln. T. gondii orsakar främst opportunistiska infektioner som kan leda till allvarlig sjuklighet och dödlighet hos immunkomprometterade individer1,,2,,3,,4,,5,6. De antibiotika som för närvarande används för behandling av akut toxoplasmos är särskilt ineffektiva vid behandling av medfödda och latenta infektioner och orsaka allvarliga reaktioner hos vissa individer3,,7,8. Således finns ett akut behov av att identifiera nya terapier. Förstå skillnaderna i subcellulära processer inom Toxoplasma och dess värd kommer att bidra till att identifiera potentiella läkemedelsmål. Därför krävs effektiva och bekväma genommanipulationstekniker för att studera rollerna hos enskilda gener inom Toxoplasma. Dessutom tillhör Toxoplasma fylum Apicomplexa, som innehåller flera andra signifikanta mänskliga patogener, såsom Plasmodium spp. och Cryptosporidium spp. Därför kan Toxoplasma användas som en modell organism för att studera grundläggande biologi i andra apicomplexan parasiter.
För att identifiera nya antibiotika mot mikrobiella patogener utförs initialt screening av ett bibliotek av kemiska föreningar för att bestämma deras effekt vid förtrycket av mikrobiell tillväxt. Hittills har flera mikroplatbaserade tillväxtanalyser utvecklats för att mäta intracellulär tillväxt av T. gondii (dvs. radioaktiva 3H-uracil inkorporering-baserad kvantifiering9, kvantitativ ELISA-baserad parasit upptäckt med T. gondii-specifikaantikroppar10,11, reporter proteinbaserad mätning med β-galactosidase eller YFP-uttryck Toxoplasma stammar12,,13, och en nyligen utvecklad hög-content imaging analys analys14).
Dessa individuella strategier har alla unika fördelar; Vissa begränsningar begränsar dock också deras ansökningar. Till exempel, eftersom Toxoplasma endast kan replikera inom nukleerade djurceller, autofluorescens och icke-specifik bindning av anti-T. gondii antikroppar mot värdceller orsaka störningar i fluorescens-baserade mätningar. Dessutom kräver användning av radioaktiva isotoper särskild säkerhetsöverensstämmelse och potentiella säkerhetsfrågor. Några av dessa analyser är mer lämpade för att bedöma tillväxt vid en enda tidpunkt snarare än kontinuerlig övervakning av tillväxten.
Presenteras här är en luciferase-baserade protokoll för kvantifiering av intracellulära Toxoplasma tillväxt. I en tidigare studie klonades NanoLuc luciferase genen under Toxoplasma tubulin promotorn, och denna luciferas uttryck konstruktion transfekterades i vildtyp (RHΔku80Δhxg stam) parasiter för att skapa en RHΔku80Δhxg::NLuc stam (kallad RHΔku80::NLuc nedan)15. Denna stam fungerade som föräldrarnas stam för intracellulär tillväxt bestämning och gen borttagning i denna studie. Med hjälp av RHΔku80::NLuc stam, parasit tillväxt i mänskliga förhud fibroblaster (HFFs) övervakades under en 96 h period efter infektion för att beräkna parasit fördubbling tid.
Dessutom kan hämningseffekten av LHVS mot parasittillväxt bestämmas genom att rita Toxoplasma tillväxthastigheter mot seriella LHVS-koncentrationer för att identifiera IC50-värdet. Tidigare litteratur har rapporterat att TgCPL är ett viktigt mål för LHVS i parasiter och att behandling med LHVS minskar utvecklingen av akuta och kroniska Toxoplasma infektioner16,17,18,19. Dessutom, RHΔku80::NLuc användes som föräldrastam för genom modifiering för att generera en TgCPL-briststam (RHΔku80Δcpl::NLuc), och hämningen av LHVS mättes mot denna mutant. Genom att observera en uppväxling av IC50 värden för LHVS i TgCPL-bristfälligaparasiter jämfört med WT stam, validerades det att TgCPL är måltavla för LHVS in vivo.
I detta protokoll, RHΔku80::NLuc används som föräldrastam, som saknar en effektiv icke-homolog end-joining pathway (NHEJ), vilket underlättar dubbel crossover homologi-beroende rekombination (HDR)20,21. Dessutom, 50 bp homologa regioner flankeras i båda ändar av en läkemedelsresistens kassett av PCR. PCR-produkten fungerar som en reparationsmall för att ta bort hela genen locus via HDR med CRISPR-Cas9-baserade genomredigeringsverktyg. Sådana korta homologa regioner kan lätt införlivas i primers, vilket ger en bekväm strategi för produktion av reparationsmallen. Detta protokoll kan ändras för att utföra universell genborttagning och endogen gentaggning.
Till exempel, i vår senaste publikation, tre proteas gener, TgCPL, TgCPB (Toxoplasma cathepsin B-liknande proteas), och TgSUB1 (Toxoplasma subtilisin-liknande proteas 1), var genetiskt ablated i TgCRT (Toxoplasma kloroquine-resistens transportör)-bristfälliga parasiter med denna metod15. Dessutom, TgAMN (en förmodad aminopeptidase N [TgAMN, TGGT1_221310]) var endogent taggade15. Den Lourido lab rapporterade också med hjälp av korta homologa regioner i intervallet 40-43 bp för införandet av plats-riktad genmutation och endogena genmärkning i Toxoplasma genomet med en liknande metod22. Dessa framgångsrika genom ändringar tyder på att en 40-50 bp homolog region är tillräcklig för effektiv DNA-rekombination i TgKU80-briststam, vilket kraftigt förenklar genom manipulation i Toxoplasma gondii.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose gel extraction kit</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>T1020L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0316S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotek Synergy H1 Hybrid Multi-Mode Microplate Reader</td>
			<td>BioTek Instuments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BTX Gemini Twin Waveform Electroporation System</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemically competent E. coli cells</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>C29871</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CloneAmp HiFi PCR premix</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>639298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coelenterazine h</td>
			<td>Prolume</td>
			<td>301-10 hCTZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRV</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3195S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phire Tissue Direct PCR Master Mix</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>F170L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid miniprep kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 Site-Directed Mutagenesis kit</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E0554S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geneious software for sgRNA design (version: R11)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism software (8th version)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SnapGene for molecular cloning (version: 4.2.11)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of chemical inhibitor efficiency against intracellular toxoplasma gondii growth using a luciferase-based growth assay

Toxoplasma gondii är en protozoisk patogen som i stor utsträckning påverkar den mänskliga befolkningen. De nuvarande antibiotika som används för behandling av klinisk toxoplasmos är begränsade. Dessutom uppvisar de negativa biverkningar i vissa grupper av människor. Därför är upptäckten av nya therapeutics för kliniska toxoplasmos absolut nödvändigt. Det första steget i nya antibiotika utveckling är att identifiera kemiska föreningar som visar hög effekt i hämning av parasittillväxt med hjälp av en hög genomströmning screening strategi. Som en obligate intracellulär patogen, Toxoplasma kan endast replikera inom värdceller, vilket förbjuder användning av optisk absorbans mätningar som en snabb indikator på tillväxt. Presenteras här är ett detaljerat protokoll för en luciferas-baserad tillväxt analys. Som ett exempel används denna metod för att beräkna fördubblingstiden för toxoplasmaparasiter av vildtyp och mäta effekten av morpholinurea-leucyl-homofenyl-vinylsulfonfenyl (LHVS, en cysteinproteas-inriktningsförening) avseende hämning av parasitens intracellulära tillväxt. Beskrivs också, är en CRISPR-Cas9-baserade gen radering protokoll i Toxoplasma med 50 bp homologa regioner för homologi-beroende rekombination (HDR). Genom att kvantifiera hämningseffektiviteten hos LHVS i vilda och TgCPL (Toxoplasma cathepsin L-liknande proteas)-bristfälliga parasiter, visas det att LHVS hämmar parasittillväxt av vild typ mer effektivt än Δcpl-tillväxt, vilket tyder på att TgCPL är ett mål som LHVS binder till i Toxoplasma. Den höga känsligheten och den enkla driften av denna luciferasbaserade tillväxtanalys gör den lämplig för övervakning av Toxoplasma-spridning och utvärdering av läkemedelseffekt på ett högt genomflödessätt.

Figur 1 representerar ett exempel på en tillväxtkurva för RHΔku80::NLuc-stammen och den härledda beräkningen för dess fördubblingstid. I allmänhet utförs analysen i tre tekniska replikat för var och en av de tre biologiska replikaten för att ta hänsyn till variationer av luciferasaktivitetsavläsningar. För att beräkna den normaliserade vikförändringen av parasittillväxten dividerats varje läsning vid 24-96 h efter infekti...

Watch this Scientific Journal Video about Determination of Chemical Inhibitor Efficiency against Intracellular Toxoplasma Gondii Growth Using a Luciferase-Based Growth Assay at JoVE.com

Determination of Chemical Inhibitor Efficiency against Intracellular Toxoplasma Gondii Growth Using a Luciferase-Based Growth Assay

Presenteras här är ett protokoll för att utvärdera hämning effekten av kemiska föreningar mot in vitro intracellulära tillväxten av Toxoplasma gondii med hjälp av en luciferase-baserad tillväxt analys. Tekniken används för att bekräfta hämningss specificitet genom genetisk borttagning av motsvarande målgen. Hämningen av LHVS mot TgCPL proteas utvärderas som ett exempel.

Bestämning av kemisk hämmare effektivitet mot intracellulära Toxoplasma Gondii tillväxt med hjälp av en Luciferase-baserad tillväxt analys

Toxoplasma gondii is a protozoan pathogen that widely affects the human population. The current antibiotics used for treating clinical toxoplasmosis are ...

Dessa känsliga strategier kan användas för att utvärdera hämmande effekt av kemiska hämmare och i kombination med CRISPR-Cas9 genborttagning för att undersöka läkemedelsmålen. Istället för att använda en endpoint-analys kan parasittillväxt övervakas över tid för att möjliggöra beräkning av parasitdubblingstid med hjälp av ett känsligt reporterprotein. Denna analys kan potentiellt skalas upp i 384 eller 1, 536 väl mikroplattor för testning av flera föreningar eller för screening av bibliotek i en hög genomströmning sätt.Denna strategi kan ändras för att kvantifiera tillväxten av andra intracellulära mikrobiella patogener och deras svar på drogen av intresse. För att utföra en luciferas-baserade Toxoplasma tillväxt assay, börja med att noggrant aspirera mediet från pre-seedade 96-väl mikroplate kulturer av människors förhud fibroblaster och inokulera 150 mikroliter av parasit B suspension i brunnarna i en tre kolumn-fem rad format. Efter en fyra timmars inkubation i cellkulturinkubatorn aspirera noggrant mediet från varje brunn för att avlägsna de icke-invaderade parasiterna och fylla brunnarna i varje men den första raden med rumstemperatur fenolrött fritt medium.Tillsätt sedan 100 mikroliter av en 12,5 mikromolar luciferasubstratlösning i PBS i varje brunn av den översta raden och inkubera mikroplattorna i 10 minuter vid rumstemperatur för att möjliggöra full celllys. Vid slutet av inkubationen, mäta luciferasaktiviteten på en mikroplattläsare. Varje läsning representerar det ursprungliga antalet invaderade parasiter vid fyra timmar efter infektion.Upprepa analysen var 24:e timme under de kommande fyra dagarna utan att byta medium. För att beräkna den normaliserade vik-förändringen av parasittillväxt kan varje avläsning divideras med den första avläsningen vid fyra timmar efter infektion. Loggen 2 av den normaliserade vikning-förändring av parasittillväxt kan sedan ritas mot varje tidpunkt punkt och utsätts för en linjär regressionsfunktion för att erhålla lutningen som representerar fördubblingstiden.För att bedöma effekten av hämningen av en förening av intresse på Toxoplasma tillväxt, kultur mänskliga förhud fibroblaster i 96-brunns mikroplattor i minst sju dagar innan inokulerande varje brunn av celler med 150 mikroliter av parasiter som visats i fyra timmar vid 37 grader Celsius och 5%koldioxid. Under inkubationen, förbereda föreningen av intresse vid åtta olika koncentrationer i en 12-brunnsreservoar genom serieutspädning. Späd föreningarna i en 12-brunnsreservoar vid en en-till-tre utspädning genom pipettering varje blandning upp och ner flera gånger med en milliliter pipett.Vid fyra timmar efter infektion, ersätta mediet i varje brunn från kolumner två till nio med 150 mikroliter av medium kompletteras med varje utspädning av förening, lämnar den första kolumnen fylld med regelbundna medium för att fungera som den icke-behandlade kontroll. Sedan tillbaka cellkulturerna till cellodlingen inkubatorn i 96 timmar och mäta luciferasaktiviteten för varje brunn för att bestämma andelen tillväxthämning i kulturerna vid varje koncentration av förening. För att beräkna den normaliserade luciferasaktiviteten i procent, dividera den genomsnittliga luciferasaktiviteten för varje sammansatt koncentration med den genomsnittliga luciferasaktiviteten som härrör från de icke-behandlade parasiterna.Använd sedan en lämplig grafering programvara program för att rita de normaliserade luciferas verksamhet mot den enskilda föreningen och att beräkna den halva maximal hämmande koncentrationen för varje förening. För att generera en plasmid konstruktion uttrycker single-guide RNA och Cas9 för att ta bort en gen av intresse, navigera till Toxoplasma Genomics Resource sida och hämta hela genen kodning sekvens inklusive introner och exons tillsammans med 1,5 kilobase fem och tre främsta oöversatta regioner. Kopiera den hämtade TgCPL-sekvensen i sekvensanalysprogramvaran och märk de fem och tre prime oöversatta regionerna.Klicka på Hämta, Datafiler och Current_Release på sidan Toxoplassma Genomics-resurs. I mappen T.gondii GT1 väljer du FASTA. Från datamappen, ladda ner Toxoplasma gondii GT1 stam genomsekvens fil.Skapa sedan en lokal mapp som heter Toxoplasma Genome i DNA-sekvensanalysprogramvaran och importera Toxoplasma-genomsekvensfilen till mappen. Välj Verktyg, Kloning och Hitta CRISPR-webbplatser och ange tre främsta Cas9-primpost för PLATSEN FÖR PAM-platsen. Välj en enda guide RNA som visar en hög specificitet poäng, i allmänhet större än 98%och saknar ett G efter NGG.Den utvalda singel-vägleder RNA lokaliseras vanligt på platser nästan starten och stopp kodonerna av genen av intresserar. Använd sedan en PCR-premix med inställningarna som anges i tabellen för att utföra en PCR-reaktion för att modifiera den befintliga plasmiden som uttrycker enguide-RNA som riktar sig mot TgUPRT-genen. För Toxoplasma-transfection, blanda två mikrogram reparerad mall-DNA med 20 mikrogram av single-guide RNA Cas9 uttrycket plasmider och blanda 400 mikroliter av parasit resuspension, DNA och fem mikroliter av 200 millimolar ATP 500 millimolar reducerad glutation i en 1,5 milliliter centrifuge röret.Lägg till cytomixbuffert för att få den totala volymen upp till 500 mikroliter vid behov och överför parasiten DNA-blandning till en fyra millimeters mellanrum med elektroporationsvette. Sedan elektroporat parasiterna på två kilovolt och 50 ohm motstånd. Att klona knockout parasiter, först utföra en tvåstegs utspädning av parasiterna för att uppnå en 10 parasiter per milliliter av D10 medium kompletteras med lämplig antibiotikakoncentration.Därefter överför 150 mikroliter av de återsuspade renade parasiterna till varje brunn av en 96-väl mikroplatta försådd med förhudsfibroblaster och inkubera mikroplattan vid 37 grader Celsius och 5%koldioxid i sju dagar. I slutet av inkubationen, identifiera de brunnar som innehåller en enda plakett och överföra 75 mikroliter av de resuspended Toxoplasma-infekterade mänskliga förhud fibroblaster från varje brunn av 96-brunn mikroplatt kultur i enskilda 1,5 milliliter rör. Samla in cellerna genom centrifugering och resuspend pelletsen i 10,25 mikroliter av lysbuffert som innehåller spädningsbuffert i DNA-frisläppningstillsats.Sedan inkubera proverna i fyra minuter vid rumstemperatur och två minuter vid 98 grader Celsius innan du utför PCR för att testa för integration av läkemedelsresistens kassetten och förlust av genen av intresse. Hämningseffekten av LHVS och vildtyp i delta CPL-stammar kan bestämmas genom att de plottar sina luciferasaktiviteter mot olika inhibitorkoncentrationer. Efter PCR är den muterade plasmiden linjäriserad och laddas i en 1%agarosgel för verifiering av en lyckad förstärkning.Efter gelutsug och E.coli-transformation kan de kloner som innehåller de förväntade plasmiderna screenas genom begränsning av endonuclease-matsmältningen i DNA-sekvensering. Efter reparationsmallförstärkning kan agarosgelelektrofores användas för att verifiera korrekt storlek på PCR-produkten. Generellt är sju till åtta kloner utvalda för den inledande screening för att kontrollera för radering av kodning sekvensen av genen av intresse, följt av detektering av de fem och tre främsta armar för att hjälpa minimalisera det totala antalet kloner som skall avskärmas.Ytterligare verifiering kan slutföras genom immunoblotting om någon antikropp som känner igen målproteinet finns tillgängligt. Innan luciferasaktivitetsmätningar erhålls bör en tydlig mikroplatta med en skeninfektion kontrolleras i mikroskop för att säkerställa att parasiterna inte helt och hållet lyser värdcellerna.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Determination of Chemical Inhibitor Efficiency against Intracellular Toxoplasma Gondii Growth Using a Luciferase-Based Growth Assay

Obtaining Highly Purified Toxoplasma gondii Oocysts by a Discontinuous Cesium Chloride Gradient

Obtaining Highly Purified Toxoplasma gondii Oocysts by a Discontinuous Cesium Chloride Gradient

Skaffa renat Toxoplasma gondii Oocystor av kontinuerliga cesiumklorid Gradient

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular protozoan pathogen that commonly infects humans. It is a well characterized apicomplexan associated with ...

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii Cysta Wall Bildning i aktiverade härledd från benmärg makrofager och Bradyzoite Villkor

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii ...

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Transnuclear Möss med fördefinierade Receptor T cellspecifika Against Toxoplasma gondii Erhållits via SCNT

Lymphocytes, such as T cells, undergo genetic V(D)J recombination, to generate a receptor with a certain specificity1. Mice transgenic for a rearranged ...

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

En genetisk skärm för att isolera Toxoplasma gondii Host-cell avstigning mutanter

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth ...

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Tillväxt av Mycobacterium tuberculosis Biofilmer

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

En parasit Rescue och Transformation analys för Antileishmanial screening mot intracellulära<em&gt; Leishmania donovani</em&gt; Amastigotes i THP1 Human akut monocytisk leukemicellinjen

Leishmaniasis is  one of the world's most neglected diseases, largely affecting the  poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million ...

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

Staphylococcus aureus Tillväxt med humant hemoglobin som järnkälla

S. aureus is a pathogenic bacterium that requires iron to  carry out vital metabolic functions and cause disease. The most abundant  reservoir of iron ...

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Genetisk manipulation i<em&gt; Δku80</em&gt; Stammar för funktionell genomik Analys av<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Använda fluorescerande proteiner för att visualisera och kvantifiera<em&gt; Klamydia</em&gt; Vacuole tillväxtdynamiken i levande celler

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Framåt Genetics skärmar Använda makrofager att identifiera<em&gt; Toxoplasma gondii</em&gt; Gener Viktigt för Resistance till IFN-γ beroende cell autonoma immunitet

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within ...