Name: ballistic labeling of pyramidal neurons in brain slices and in primary cell culture
Uploaded: 2020-04-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture at JoVE.com

تم تمويل هذا العمل من قبل المنح المعاهد القومية للصحة HD043680، MH106392، DA013137، وNS100624.

تم مراجعة جميع بروتوكولات الحيوانات والموافقة عليها من قبل لجنة رعاية الحيوانات واستخدامها في جامعة كارولينا الجنوبية (رقم الضمان الفيدرالي: D16-00028).
1. إعداد أنابيب الزمرة DiI / التنغستن
<ol><li>حل 100 ملغ من polyvinylpyrrolidone (PVP) مع 10 مل من ddH2O. Vortex حل PVP طفيفة.</li>
	<li>ملء الأنابيب مع ح...

<ol>
	<li>Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+"DiOlistic"+labeling+of+the+nervous+system+using+lipophilic+dye+combinations.">Multicolor "DiOlistic" labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations.</a> Neuron. 27, 219-225 (2000).</li><li>Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, R. O., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ballistic+delivery+of+dyes+for+structural+and+functional+studies+of+the+nervous+system.">Ballistic delivery of dyes for structural and functional studies of the nervous system.</a> Cold Spring Harbor Protocol. 2009 (4), 5202 (2009).</li><li>Seabold, G. K., Daunais, J. B., Rau, A., Grant, K. A., Alvarez, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DiOLISTIC+labeling+of+neurons+from+rodent+and+non-human+primate+brain+slices.">DiOLISTIC labeling of neurons from rodent and non-human primate brain slices.</a> Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).</li><li>Spacek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+the+Golgi+method:+a+time-lapse+study+of+the+early+stages+of+impregnation+in+single+sections.">Dynamics of the Golgi method: a time-lapse study of the early stages of impregnation in single sections.</a> Journal of Neurocytology. 18 (1), 27-38 (1989).</li><li>McLaurin, K. A., Li, H., Booze, R. M., Mactutus, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+Timing:+NeuroHIV+Progression+in+the+Post-cART+Era.">Disruption of Timing: NeuroHIV Progression in the Post-cART Era.</a> Science Reports. 9 (1), 827 (2019).</li><li>Spruston, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyramidal+neurons:+dendritic+structure+and+synaptic+integration.">Pyramidal neurons: dendritic structure and synaptic integration.</a> Nature Reviews Neurosciences. 9 (3), 206-221 (2008).</li><li>Megias, M., Emri, Z., Freund, T. F., Gulyas, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+number+and+distribution+of+inhibitory+and+excitatory+synapses+on+hippocampal+CA1+pyramidal+cells.">Total number and distribution of inhibitory and excitatory synapses on hippocampal CA1 pyramidal cells.</a> Neuroscience. 102, 527-540 (2001).</li><li>Peters, A., Kaiserman-Abramof, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+small+pyramidal+neuron+of+the+rat+cerebral+cortex.+The+perikaryon,+dendrites+and+spines.">The small pyramidal neuron of the rat cerebral cortex. The perikaryon, dendrites and spines.</a> American Journal of Anatomy. 127, 321-355 (1970).</li><li>Harris, K. M., Sultan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+the+number,+location,+and+size+of+synaptic+vesicles+provides+an+anatomical+basis+for+the+nonuniform+probability+of+release+at+hippocampal+CA1+synapses.">Variation in the number, location, and size of synaptic vesicles provides an anatomical basis for the nonuniform probability of release at hippocampal CA1 synapses.</a> Neuropharmacology. 34, 1387-1395 (1995).</li><li>Sorra, K. E., Fiala, J. C., Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+assessment+of+the+involvement+of+perforations,+spinules,+and+spine+branching+in+hippocampal+synapse+formation.">Critical assessment of the involvement of perforations, spinules, and spine branching in hippocampal synapse formation.</a> Journal of Comparative Neurology. 398, 225-240 (1998).</li><li>Mancuso, J. J., Chen, Y., Li, X., Xue, Z., Wong, S. T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+dendritic+spine+detection:+from+Golgi+to+high-resolution+optical+imaging.">Methods of dendritic spine detection: from Golgi to high-resolution optical imaging.</a> Neuroscience. 251, 129-140 (2012).</li><li>McLaurin, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+connectivity+in+medium+spiny+neurons+of+the+nucleus+accumbens:+A+sex-dependent+mechanism+underlying+apathy+in+the+HIV-1+transgenic+rat.">Synaptic connectivity in medium spiny neurons of the nucleus accumbens: A sex-dependent mechanism underlying apathy in the HIV-1 transgenic rat.</a> Frontiers in Behavior Neurosciences. 12, 285 (2018).</li><li>Roscoe, R. F., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+transgenic+female+rat:+synaptodendritic+alterations+of+medium+spiny+neurons+in+the+nucleus+accumbens.">HIV-1 transgenic female rat: synaptodendritic alterations of medium spiny neurons in the nucleus accumbens.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 9 (5), 642-653 (2014).</li><li>Li, H., Aksenova, M., Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Booze, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Filamentous+Actin+(F-actin)+Puncta+in+Rat+Cortical+Neurons.">Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (108), e53697 (2016).</li><li>Rodriguez, A., Ehlenberger, D. B., Dickstein, D. L., Hof, P. R., Wearne, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+Three-Dimensional+Detection+and+Shape+Classification+of+Dendritic+Spines+from+Fluorescence+Microscopy+Images.">Automated Three-Dimensional Detection and Shape Classification of Dendritic Spines from Fluorescence Microscopy Images.</a> PLoS ONE. 3 (10), 1371 (2008).</li></ol>

في هذا البروتوكول، ونحن نصف تقنية وضع العلامات تنوعا للخلايا العصبية من كل من الدماغ الفئران وتلك التي تزرع في المختبر. وعلاوة على ذلك، نحن تقرير منهجية لاستخدام برامج إعادة بناء الخلايا العصبية وبرامج التحليل الكمي لإعادة بناء الخلايا العصبية لتقييم مورفولوجيا الخلايا العصبية والعمود ...

في عام 2000، وصف غان وآخرون تقنية وضع العلامات السريعة للخلايا العصبية الفردية وغليا في الجهاز العصبي الذي جمع بين الأصباغ الدهنية المختلفة، مما يسمح بوضع العلامات في وقت واحد من العديد من خلايا الدماغ مع ألوان مختلفة1،2. وفي الآونة الأخيرة، وصفت سيبولد وآخرون3 تقنية وضع العلامات البالستية التي أدخلت الأصباغ الفلورية (ديل) في الخلايا العصبية لشرائح الدماغ. تقنية تلطيخ متعددة الاستخدامات ، يتم تقدير العلامات البالستية لقدرتها على استخدامها في أنواع الحيوانات المتعددة وعبر مجموعة واسعة من الأعمار. وعلاوة على ذلك، يمكن الجمع بين ذلك مع المناعة لتحديد الفئات الفرعية من خلايا الدماغ3. بالمقارنة مع التقنيات التقليدية (على سبيل المثال، غولجي كوكس الفضة التلقيح، الحقن المجهري)4، وضع العلامات البالستية يتيح فرصة للتمييز بشكل أوضح خصائص مورفولوجية، بما في ذلك العمود الفقري الدندري، وهي ميزة حاسمة لرسم الاستدلالات حول تعقيد الخلايا العصبية والاتصال متشابك5.
تتميز الخلايا العصبية الهرمية المجازية بdendrite واحد كبير، وdendrites القاعدية أقصر متعددة، والآلاف منالعمودالفقري الدندري6. تم العثور على الخلايا العصبية الهرمية في مناطق الدماغ متعددة تتعلق أعلى ترتيب المعالجة المعرفية, بما في ذلك قشرة الجبهية (PFC) وقرن آمون. في PFC ، لوحظت الخلايا العصبية الهرمية في الطبقات الثانية / الثالثة والطبقة الخامسة ، مع كل عرض مورفولوجيا فريدة من نوعها. على وجه التحديد، الخلايا العصبية الهرمية في الطبقة الثانية / الثالثة من PFC لديها dendrite apical أقصر وأقل تفريع من الخلايا العصبية الهرمية في طبقة V6. داخل قرن آمون، وتقع الخلايا العصبية الهرمية في كل من مناطق CA1 و CA3، مع كل عرض مورفوولوجيا متميزة. على وجه التحديد، الخلايا العصبية الهرمية في منطقة CA1 تحمل dendrite apical أكثر تميزا، مع التفريع التي تحدث أبعد من سوما، بالنسبة إلى منطقة CA36.
العمود الفقري الدندريعلى الخلايا العصبية الهرمية في كل من PFC وقرن آمون هي الموقع الرئيسي للنقاط الاشتباك العصبي مثير7. الخصائص المورفولوجية للعمود الفقري التشجر، والتي تتميز كلاسيكيا إلى ثلاث فئات أساسية (أي رقيقة، كعب، أو فطر8)،وقد ارتبطت بحجم المشبك مثير9. العمود الفقري رقيقة، تتميز طويلة، والرقبة رقيقة، رئيس لمبة صغيرة، وأصغر كثافة postynaptic، هي أكثر غير مستقرة وتطوير اتصالات أضعف. ومع ذلك ، يتم التعرف على العمود الفقري للفطر ، والتي لديها رأس عمود فقري أكبر ، لتشكيل اتصالات متشابكة أقوى ، وهو تأثير ناتج عن حجمها الأكبر. في التباين الحاد ، تخلو العمود الفقري من رقبة العمود الفقري ، مما يعرض نسبة حجم رأس ورقبة متساوية تقريبًا8. داخل قرن آمون ، يمكن أيضًا ملاحظة العمود الفقري المتفرع ، حيث يحتوي العمود الفقري على رؤوس متعددة تخرج من نفس عنق العمود الفقري الدندري10. لذلك ، يمكن أن تعكس التغيرات المورفولوجية للعمود الفقري التشتري الوظائف والقدرة الهيكلية. وعلاوة على ذلك، فقد أثبتت الدراسات أن حجم وشكل العمود الفقري التشجري يرتبط بلدونتها الهيكلية، مما يؤدي إلى فكرة أن العمود الفقري الصغير يشارك في التعلم والاهتمام، في حين أن العمود الفقري الأكبر والأكثر استقرارًا، يشارك في عمليات طويلة الأجل، بما في ذلك الذاكرة11. بالإضافة إلى ذلك، قد يرتبط توزيع العمود الفقري التشجرني على طول dendrite مع الاتصال متشابك5,12.
وهكذا، فإن هذه الورقة المنهجية لها ثلاثة أهداف: 1) تقديم بروتوكولنا للوسم الباليستي، الذي تم استخدامه بمعدل نجاح (أي الخلايا العصبية التي تستوفي معايير الاختيار والمناسبة للتحليل) من 83.3٪5و12و13 وعبر مناطق الدماغ المتعددة (أي PFC، النواة accumbens، قرن آمون)؛ 2) إثبات التعميم من هذه التقنية وتطبيقها على الخلايا العصبية نمت في المختبر؛ 3) تفصيل المنهجية المستخدمة في برامج إعادة بناء الخلايا العصبية والاستدلالات التي يمكن استخلاصها من هذه البيانات.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:868px;" width="869">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">20Gx25mm PrecisionGlide needle</td>
			<td style="width:263px;">BD</td>
			<td style="width:143px;">305175</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24-well cell culture plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">35 mm Glass Bottom Dishes</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-1.5-20-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Antibiotic-Antimycotic solution</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>30004CI</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">B-27 supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>50X</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Barrel liner</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Borax</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Boric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B0252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cartridge holder</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Confocal imaging software</td>
			<td style="width:263px;">Nikon</td>
			<td style="width:143px;">EZ-C1</td>
			<td>version 3.81b</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:263px;">Nikon</td>
			<td style="width:143px;">TE-2000E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cover glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>637-137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DilC18(3)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM/F12 medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10565-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dumont #5 Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dumont #7 Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">F344 rat</td>
			<td style="width:263px;">(Harlan Laboratories, Indianapolis, IN)</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glucose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>101174Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GlutaMax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HBSS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4641</td>
			<td>10X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Helios diffusion screens</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Helios gene gun kit</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Helios gene gun system</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Helium hose assembly</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Iris Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>15914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Iris Scissors</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methylene chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D150-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Neurobasal medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Neurolucida 360 software</td>
			<td style="width:263px;">mbf bioscience</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td>dendritic spine analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyvinylpyrrolidone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>5295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ProLong Gold antifade reagent</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P36930</td>
			<td>mounting medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat brain matrix, 300 - 600g, Coronal, 0.5mm</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>15047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sevoflurane</td>
			<td>Merritt Veterinary Supply</td>
			<td>347075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SuperFrost Plus Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-154%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe kit</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tefzel tubing</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tubing cutter</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tubing Prep station</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tungsten M-25 Microcarrier 1.7 &#181;m</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vannas Scissors</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500086</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ballistic labeling of pyramidal neurons in brain slices and in primary cell culture

وقد أفيد أن حجم وشكل العمود الفقري التشجرات يرتبط اللدونة الهيكلية. لتحديد البنية المورفولوجية للخلايا العصبية الهرمية والعمود الفقري الدندري، يمكن استخدام تقنية وضع العلامات البالستية. في البروتوكول الحالي، يتم تسمية الخلايا العصبية الهرمية مع صبغة DilC18 (3) وتحليلها باستخدام برامج إعادة بناء الخلايا العصبية لتقييم مورفولوجيا الخلايا العصبية والعمود الفقري الدندري. للتحقيق في بنية الخلايا العصبية، يتم إجراء تحليل التشعب التشعب التشجري وتحليل شول، مما يسمح للباحثين باستخلاص استنتاجات حول تعقيد التفريكان التشعب يتكاثر وتعقيد المشتر العصبي، على التوالي. ويجري تقييم العمود الفقري الدندريتيكي باستخدام خوارزمية تصنيف تلقائية بمساعدة متكاملة من برنامج إعادة الإعمار، الذي يصنف العمود الفقري إلى أربع فئات (أي رقيقة، فطر، كعب، فيلوبوديا). وعلاوة على ذلك، يتم اختيار ثلاثة معلمات إضافية (أي الطول وقطر الرأس والحجم) لتقييم التعديلات في مورفولوجيا العمود الفقري التشدري. للتحقق من إمكانية التطبيق الواسع لتقنية وضع العلامات البالستية ، تم تصنيف الخلايا العصبية الهرمية من ثقافة الخلايا المختبرية بنجاح. وعموما ، فإن طريقة وضع العلامات البالستية هي فريدة من نوعها ومفيدة لتصور الخلايا العصبية في مناطق الدماغ المختلفة في الفئران ، والتي في تركيبة مع برامج إعادة الإعمار المتطورة ، ويسمح للباحثين لتوضيح الآليات الممكنة الكامنة وراء الخلل العصبي المعرفي.

في الشكل 2A، تم تحديد الخلايا العصبية الهرمية النموذجية في منطقة فرس النهر في أقسام دماغ الفئران من خلال تقنية وضع العلامات البالستية ، والتي تتميز بواحدة من dendrite apical كبيرة والعديد من الdendrites القاعدية الأصغر حول سوما. ويبين الشكل 2B الخلايا العصبية في برنامج...

Watch this Scientific Journal Video about Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture at JoVE.com

Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture

نحن نقدم بروتوكولًا لتسمية وتحليل الخلايا العصبية الهرمية ، وهو أمر بالغ الأهمية لتقييم التغيرات المورفولوجية المحتملة في الخلايا العصبية والعمود الفقري التشجري الذي قد يكمن وراء التشوهات الكيميائية العصبية والسلوكية.

وضع العلامات البالستية للخلايا العصبية الهرمية في شرائح الدماغ وفي ثقافة الخلايا الأولية

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of ...

هذا البروتوكول يجعل من الممكن لتقييم التعديلات المورفولوجية المحتملة في الخلايا العصبية والعمود الفقري التشعب التي قد تؤكد التشوهات الكيميائية العصبية والسلوكية. وهي فريدة ومفيدة لتصور الخلايا العصبية في مناطق الدماغ المختلفة في الفئران، والتي في تركيبة مع برامج إعادة الإعمار المتطورة يسمح للباحثين لتوضيح الآليات الممكنة الكامنة وراء الخلل العصبي المعرفي. ابدأ بإعداد حل PVP وفقًا لتوجيهات المخطوطات.ملء الأنابيب مع PVP وتركها لمدة 20 دقيقة. وطرده من خلال الطرف الآخر مع حقنة 10 ملليلتر. الجمع بين 170 ملليغرام من الخرز microcarrier التنغستن مع 250 ميكرولترات من كلوريد الميثيلين.ثم دوامة تماما تعليق. بعد ذلك، إضافة 6 ملليغرام من ديلك 18 الدهني (3) صبغ إلى 300 ميكرولترات من كلوريد الميثيلين ودوامة. Pipet 250 ميكرولترات من تعليق حبة التنغستن على شريحة زجاجية.انتظر تعليق للهواء الجاف وإضافة 300 ميكرولترات من محلول الصبغة. مرة واحدة المجففة، واستخدام شفرة حلاقة لتقسيم الخليط إلى اثنين من أنابيب الطرد المركزي 1.5 ملليلتر وملء الأنابيب بالماء. سونيكات الخليط في حمام مائي حتى متجانسة.التأكد من أن تلميح sonicator تقع مباشرة على الأنابيب. الجمع بين خليط اثنين في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر. و sonicate لمدة ثلاث دقائق أخرى، والتأكد من عدم وجود كتل كبيرة من الخرز المغلفة صبغ لا تزال.بعد سونيكيشن، رسم الخليط في أنابيب PVP المغلفة مع حقنة 10 ملليلتر. وإطعام الأنابيب في محطة التحضير. تدوير الأنابيب لمدة دقيقة واحدة.إزالة بعناية كل الماء باستخدام حقنة. بدوره على غاز النيتروجين وضبط تدفق النيتروجين إلى ما يقرب من 0.5 لتر في الدقيقة الواحدة. تدوير الأنابيب في محطة إعداد وتجفيفه مع النيتروجين لمدة 30 دقيقة.إزالة أنابيب من المحطة وقطع إلى شرائح 13 ملليمتر مع قاطع الأنابيب. تأكد من أن الفئران ليست استجابة للمحفزات الضارة وردود الفعل غائبة. ثم تأمينه في موقف supine.إجراء شق على طول خط الوسط الصدري. فصل الحجاب الحاجز وفتح الصدر مع مقص. ثم أدخل إبرة قياس 20 25 ملليمتر في البطين الأيسر.قطع فورا الأذين الأيمن مع مقص و perfuse 15 ملليلتر من 100 PBS ميليمولار مع 5 ملليمترات في الدقيقة معدل التدفق. ثم 100 milliliters perfuse من 4 ٪ PFA المخزنة في برنامج تلفزيوني. بعد التسريب، وإزالة الدماغ الفئران بأكملها.و postfix مع 4 ٪ PFA لمدة 10 دقائق. استخدام مصفوفة الدماغ الفئران لقطع 500 ميكرومتر سميكة قسم التاجية. جعل قطع قبضة والحفاظ على شفرة في مكانها.ثم جعل قطع الثانية مع شفرة الثانية وإزالة عموديا شفرة الأولى، والحفاظ على الأنسجة على سطح النصل. ضع شرائح الدماغ في لوحة 24-well مع 1 ملليلتر من PBS في كل بئر. وكرر العملية حتى يتم قطع جميع الشرائح.إزالة برنامج تلفزيوني من كل المستهدفة بشكل جيد. تحميل الغضروف مع قطعة من ديل / التنغستن الأنابيب ووضعها في قضيب. وضع قطعة من ورقة التصفية بين شاشتي شبكة.وربط قضيب خرطوم الهيليوم. ثم ضبط ضغط الناتج من الهليوم إلى 90 جنيه لكل بوصة مربعة. ضع قضيب عموديا على مركز المستهدفة جيدا 1.5 سم بين العينة وشاشة شبكة.ثم اطلاق النار ديل / التنغستن الأنابيب. تحميل الغضروف مع الأنابيب المقبل وطلق النار باستمرار الخرز من الأنابيب على الشرائح المتبقية. ملء لوحة 24-جيدا مع برنامج تلفزيوني 100 ميليمولار.وغسل شرائح ثلاث مرات مع 500 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني جديد. التأكد من أن الشرائح لا الوجه خلال الغسيل. عند الانتهاء، إضافة 500 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني جديد إلى شرائح.واحتضانهم لمدة ثلاث ساعات في أربع درجات مئوية في الظلام. بعد الحضانة، استخدم فرشاة دقيقة لنقل شرائح الدماغ على الشرائح الزجاجية. وعلى الفور إضافة ملليلتر واحد من antifade تصاعد المتوسطة لكل قسم.ضع غطاءً من 22 في 15 ملليمتر على الأقسام وجفف الشرائح في الظلام. قم بتشغيل نظام المجهر confocal والتحول إلى هدف 60X. ضبط إعدادات التصوير وفقًا لاتجاهات المخطوطة.والحصول على صور Z-المكدس لنوع الخلايا العصبية المستهدفة على أساس حدود منطقة الدماغ والخصائص المورفولوجية للخلايا العصبية. عزل الخلايا العصبية القشرية الأولية من الفئران F344/N في اليوم التالي للولادة واحد وثقافتها في طبق أسفل الزجاج 35 ملليمتر لمدة أسبوع واحد. تحديث نصف الوسط في اليوم الثالث بعد العزل.غسل الطبق مرتين مع 1 ملليلتر من 100 ملليمولار PBS. وأصلح الخلايا بنسبة 4٪ PFA لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تسمية الباليستية الخلايا كما هو موضح سابقا.واغسلها ثلاث مرات مع 1 ملليلتر من برنامج تلفزيوني. إضافة 500 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني إلى الخلايا واحتضانها لمدة ثلاث ساعات في أربع درجات مئوية في الظلام. ثم إضافة 200 ميكرولترات من antifade تصاعد المتوسطة.والحصول على صور Z-المكدس لكل الخلايا العصبية المستهدفة. تم تحديد الخلايا العصبية الهرمية النموذجية في منطقة فرس النهر في أقسام دماغ الفئران مع تقنية وضع العلامات الباليستية التي تتميز بـ dendrite كبير و عدة dendrites القاعدية الأصغر حول سوما. تم استخدام برامج التحليل الكمي لإعادة بناء الخلايا العصبية لتتبع الفروع التشعبية والكشف عن العمود الفقري.وفي وقت لاحق، تم استخدام البرنامج لتقييم تعقيد التفريع المتفرع وتعقيد العبور العصبي. تم تقييم التغيرات المورفولوجية في العمود الفقري التشعبي باستخدام الطول والحجم وقطر الرأس. ثم تم تصنيف العمود الفقري إلى العمود الفقري رقيقة، كعب، والفطر.وفحص التردد النسبي لعدد من العمود الفقري بين كل دائرة نصف قطرها. مزيد من أكثر تم التحقق من صحة تقنية وضع العلامات الباليستية على الخلايا العصبية الهرمية الأولية في ثقافة الخلية. تم تحديد الخلايا العصبية الهرمية على أساس شكل مثلث سوما ودندريت apical كبيرة.ثم تم استخدام برامج إعادة بناء الخلايا العصبية لتحليل توزيع العمود الفقري التشعب رقيقة وطول العمود الفقري التشعب. عند محاولة هذا البروتوكول، من المهم تجنب كتل كبيرة أو مجموعات من حبات التنغستن المغلفة بالمقذوفات من الطلاء بدءا من التحضير. الكتل لن تسمح بتمييز الخلايا العصبية الفردية.جنبا إلى جنب مع برامج إعادة بناء الخلايا العصبية هذه الطريقة يسمح لنا لفحص مورفولوجيا العمود الفقري العصبي والتشعب في الخلايا العصبية الهرمية فرسان. برامج إعادة بناء الخلايا العصبية استخدام خوارزمية لتقديم تلقائيا بمساعدة تصنيف العمود الفقري التشعب. يوفر التحديد الكمي للمعلمات العصبية المتعددة فرصة لفهم أفضل للآلية الكامنة في الخلل المعرفي العصبي.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

تشريح والثقافة من الخلايا العصبية من النخاع الشوكي صواري الجنينية

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

DiOLISTIC وصفها من الخلايا العصبية من القوارض والإنسان غير شرائح الدماغ الرئيسيات

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

الفلورسنت وصفها الوراء يسمح لخارج الخلية المستهدفة واحدة وحدة التسجيل من الخلايا العصبية التي تم تحديدها<em&gt; في الجسم الحي</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

الردود الكالسيوم في الخلايا العصبية التصوير GFP الموسومة تحت المهاد البصري من شرائح مخ الفأر

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

الجهد حساسة من تسجيل صبغ محاور عصبية، التشعبات والعمود الفقري شجيري الخلايا العصبية الفردية في شرائح الدماغ

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

تسجيلات الكهربية المزدوجة للSynaptically-استجابات Astroglial والخلايا العصبية في الحصين شرائح الحاد

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

الثقافة الابتدائية من الخلايا العصبية الدوبامين ماوس

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

تقرن تسجيلات خلية كاملة في عضوي شرائح الحصين

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

العزلة والثقافة وطويل الأجل صيانة الابتدائية الدماغ المتوسط ​​الدوبامين العصبية من المخ الجنينية القوارض

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

تسجيلات خلية كاملة التصحيح، المشبك في الدماغ شرائح

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...