Name: ballistic labeling of pyramidal neurons in brain slices and in primary cell culture
Uploaded: 2020-04-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture at JoVE.com

Dette arbejde blev finansieret af NIH tilskud HD043680, MH106392, DA013137, og NS100624.

Alle dyreprotokoller blev gennemgået og godkendt af Animal Care and Use Committee ved University of South Carolina (federal assurance number: D16-00028).
1. Fremstilling af DiI/Wolfram perle slange
<ol><li>100 mg polyvinylpyrrolidon (PVP) opløses med 10 ml ddH2O. Vortex pvp-opløsningen let.</li>
	<li>Fyld slangen med PVP-opløsningen (se Materialebordet) og lad den være i 20 min. Udvis derefter PVP-opløsningen gennem den anden ende af slangen med en 10 ml spr...

<ol>
	<li>Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+"DiOlistic"+labeling+of+the+nervous+system+using+lipophilic+dye+combinations.">Multicolor "DiOlistic" labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations.</a> Neuron. 27, 219-225 (2000).</li><li>Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, R. O., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ballistic+delivery+of+dyes+for+structural+and+functional+studies+of+the+nervous+system.">Ballistic delivery of dyes for structural and functional studies of the nervous system.</a> Cold Spring Harbor Protocol. 2009 (4), 5202 (2009).</li><li>Seabold, G. K., Daunais, J. B., Rau, A., Grant, K. A., Alvarez, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DiOLISTIC+labeling+of+neurons+from+rodent+and+non-human+primate+brain+slices.">DiOLISTIC labeling of neurons from rodent and non-human primate brain slices.</a> Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).</li><li>Spacek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+the+Golgi+method:+a+time-lapse+study+of+the+early+stages+of+impregnation+in+single+sections.">Dynamics of the Golgi method: a time-lapse study of the early stages of impregnation in single sections.</a> Journal of Neurocytology. 18 (1), 27-38 (1989).</li><li>McLaurin, K. A., Li, H., Booze, R. M., Mactutus, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+Timing:+NeuroHIV+Progression+in+the+Post-cART+Era.">Disruption of Timing: NeuroHIV Progression in the Post-cART Era.</a> Science Reports. 9 (1), 827 (2019).</li><li>Spruston, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyramidal+neurons:+dendritic+structure+and+synaptic+integration.">Pyramidal neurons: dendritic structure and synaptic integration.</a> Nature Reviews Neurosciences. 9 (3), 206-221 (2008).</li><li>Megias, M., Emri, Z., Freund, T. F., Gulyas, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+number+and+distribution+of+inhibitory+and+excitatory+synapses+on+hippocampal+CA1+pyramidal+cells.">Total number and distribution of inhibitory and excitatory synapses on hippocampal CA1 pyramidal cells.</a> Neuroscience. 102, 527-540 (2001).</li><li>Peters, A., Kaiserman-Abramof, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+small+pyramidal+neuron+of+the+rat+cerebral+cortex.+The+perikaryon,+dendrites+and+spines.">The small pyramidal neuron of the rat cerebral cortex. The perikaryon, dendrites and spines.</a> American Journal of Anatomy. 127, 321-355 (1970).</li><li>Harris, K. M., Sultan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+the+number,+location,+and+size+of+synaptic+vesicles+provides+an+anatomical+basis+for+the+nonuniform+probability+of+release+at+hippocampal+CA1+synapses.">Variation in the number, location, and size of synaptic vesicles provides an anatomical basis for the nonuniform probability of release at hippocampal CA1 synapses.</a> Neuropharmacology. 34, 1387-1395 (1995).</li><li>Sorra, K. E., Fiala, J. C., Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+assessment+of+the+involvement+of+perforations,+spinules,+and+spine+branching+in+hippocampal+synapse+formation.">Critical assessment of the involvement of perforations, spinules, and spine branching in hippocampal synapse formation.</a> Journal of Comparative Neurology. 398, 225-240 (1998).</li><li>Mancuso, J. J., Chen, Y., Li, X., Xue, Z., Wong, S. T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+dendritic+spine+detection:+from+Golgi+to+high-resolution+optical+imaging.">Methods of dendritic spine detection: from Golgi to high-resolution optical imaging.</a> Neuroscience. 251, 129-140 (2012).</li><li>McLaurin, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+connectivity+in+medium+spiny+neurons+of+the+nucleus+accumbens:+A+sex-dependent+mechanism+underlying+apathy+in+the+HIV-1+transgenic+rat.">Synaptic connectivity in medium spiny neurons of the nucleus accumbens: A sex-dependent mechanism underlying apathy in the HIV-1 transgenic rat.</a> Frontiers in Behavior Neurosciences. 12, 285 (2018).</li><li>Roscoe, R. F., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+transgenic+female+rat:+synaptodendritic+alterations+of+medium+spiny+neurons+in+the+nucleus+accumbens.">HIV-1 transgenic female rat: synaptodendritic alterations of medium spiny neurons in the nucleus accumbens.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 9 (5), 642-653 (2014).</li><li>Li, H., Aksenova, M., Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Booze, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Filamentous+Actin+(F-actin)+Puncta+in+Rat+Cortical+Neurons.">Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (108), e53697 (2016).</li><li>Rodriguez, A., Ehlenberger, D. B., Dickstein, D. L., Hof, P. R., Wearne, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+Three-Dimensional+Detection+and+Shape+Classification+of+Dendritic+Spines+from+Fluorescence+Microscopy+Images.">Automated Three-Dimensional Detection and Shape Classification of Dendritic Spines from Fluorescence Microscopy Images.</a> PLoS ONE. 3 (10), 1371 (2008).</li></ol>

I denne protokol beskriver vi en alsidig mærkningsteknik til neuroner fra både rottehjernen og dem, der dyrkes in vitro. Desuden rapporterer vi metoden til at udnytte neuronal rekonstruktion software og neuronal rekonstruktion kvantitative analyse software til at vurdere neuronal morfologi og dendritiske pigge. Vurderingen af neuronal morfologi og dendritiske pigge giver mulighed for at bestemme ændringer i dendritisk forgrening kompleksitet, neuronal arbor kompleksitet, dendritiske rygsøjlen morfologi, og synaptiske...

I 2000 beskrev Gan et al. en hurtig mærkningsteknik for individuelle neuroner og glia i nervesystemet, der kombinerede forskellige lipofile farvestoffer, hvilket gav mulighed for samtidig mærkning af mange hjerneceller med forskellige farver1,2. For nylig, en ballistisk mærkning teknik blev beskrevet af Seabold et al.3, der indførte fluorescerende farvestoffer (Dil) i neuroner af hjerneskiver. En alsidig farvning teknik, ballistiskmærkning er værdsat for sin evne til at blive udnyttet i flere dyrearter og på tværs af en bred vifte af aldre. Desuden kan det kombineres med immunfarvning for at identificere delpopulationer af hjerneceller3. Sammenlignet med traditionelle teknikker (f.eks Golgi-Cox sølv imprægnering, mikroinjektion)4, ballistiske mærkning giver mulighed for at mere klart skelne morfologiske egenskaber, herunder dendritiske pigge, en funktion, der er afgørende for at drage slutninger om neuronal kompleksitet og synaptisktilslutningsmuligheder 5.
Excitatoriske pyramideformede neuroner er karakteriseret ved en enkelt, stor apilogisk dendrite, flere kortere basal dendritter, og tusindvis af dendritiske pigge6. Pyramideformede neuroner findes i flere hjerneregioner relateret til højere orden kognitiv behandling, herunder den præfrontale cortex (PFC) og hippocampus. I PFC observeres pyramideformede neuroner i lag II/III og lag V, hvor hver udviser unik morfologi. Specifikt pyramideformede neuroner i lag II/III af PFC har en kortere apilogisk dendrite og mindre forgrening end pyramideformede neuroner i lag V6. Inden for hippocampus, pyramideformede neuroner er placeret i både CA1 og CA3 regioner, med hver viser forskellige morfologier. Specifikt, pyramideformede neuroner i CA1 regionen udviser en mere karakteristisk apitisk dendrite, med forgrening forekommer længere fra soma, i forhold til CA3 regionen6.
Dendritiske pigge på pyramideformede neuroner i både PFC og hippocampus er det primære sted for excitatoriske synapser7. Morfologiske egenskaber af dendritiske pigge, som er klassisk karakteriseret i tre primære kategorier (dvs. tynde, stubby, eller champignon8), har været relateret til størrelsen af excitatoriske synapse9. Tynde pigge, karakteriseret ved en lang, tynd hals, lille løgformet hoved, og mindre postsynaptiske tætheder, er mere ustabile og udvikle svagere forbindelser. Men svampe pigge, som har en større dendritisk rygsøjlen hoved, er anerkendt for at danne stærkere synaptiske forbindelser, en effekt som følge af deres større størrelse. I skarp kontrast, stubby pigge er blottet for en rygsøjle hals, udviser en omtrent lige hoved og hals volumen forhold8. Inden for hippocampus, forgrenede pigge kan også observeres, hvorved rygsøjlen har flere hoveder, der kommer ud af samme dendritiske rygsøjlen hals10. Derfor kan de morfologiske ændringer af dendritiske pigge afspejle funktionalitet og strukturel kapacitet. Desuden har undersøgelser vist, at størrelsen og formen af dendritiske pigge vedrører deres strukturelle plasticitet, hvilket fører til tanken om, at små pigge er involveret i læring og opmærksomhed, mens større, mere stabile pigge, er involveret i langsigtede processer, herunder hukommelse11. Desuden kan fordelingen af dendritiske pigge langs dendrite være forbundet med synaptisktilslutning5,12.
Således den nuværende metodiske papir har tre mål: 1) Præsenter vores protokol for ballistiskmærkning, som er blevet udnyttet med en succesrate (dvs. neuroner opfylder udvælgelseskriterier og passende til analyse) på 83,3%5,12,13 og på tværs af flere hjerne regioner (dvs. PFC, kerne accumbens, hippocampus); 2) Demonstrere generaliserbarheden af teknikken og dens anvendelse på neuroner dyrket in vitro; 3) Nærmere oplysninger om den metode, der anvendes i neuronal genopbygning software og de slutninger, der kan drages af sådanne data.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:868px;" width="869">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">20Gx25mm PrecisionGlide needle</td>
			<td style="width:263px;">BD</td>
			<td style="width:143px;">305175</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24-well cell culture plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">35 mm Glass Bottom Dishes</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-1.5-20-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Antibiotic-Antimycotic solution</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>30004CI</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">B-27 supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>50X</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Barrel liner</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Borax</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Boric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B0252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cartridge holder</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Confocal imaging software</td>
			<td style="width:263px;">Nikon</td>
			<td style="width:143px;">EZ-C1</td>
			<td>version 3.81b</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:263px;">Nikon</td>
			<td style="width:143px;">TE-2000E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cover glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>637-137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DilC18(3)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM/F12 medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10565-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dumont #5 Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dumont #7 Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">F344 rat</td>
			<td style="width:263px;">(Harlan Laboratories, Indianapolis, IN)</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glucose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>101174Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GlutaMax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HBSS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4641</td>
			<td>10X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Helios diffusion screens</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Helios gene gun kit</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Helios gene gun system</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Helium hose assembly</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Iris Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>15914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Iris Scissors</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methylene chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D150-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Neurobasal medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Neurolucida 360 software</td>
			<td style="width:263px;">mbf bioscience</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td>dendritic spine analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyvinylpyrrolidone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>5295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ProLong Gold antifade reagent</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P36930</td>
			<td>mounting medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat brain matrix, 300 - 600g, Coronal, 0.5mm</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>15047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sevoflurane</td>
			<td>Merritt Veterinary Supply</td>
			<td>347075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SuperFrost Plus Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-154%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe kit</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tefzel tubing</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tubing cutter</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tubing Prep station</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tungsten M-25 Microcarrier 1.7 &#181;m</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vannas Scissors</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500086</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ballistic labeling of pyramidal neurons in brain slices and in primary cell culture

Det er blevet rapporteret, at størrelsen og formen af dendritiske pigge er relateret til deres strukturelle plasticitet. For at identificere den morfologiske struktur af pyramideformede neuroner og dendritiske pigge, en ballistisk mærkning teknik kan udnyttes. I den nuværende protokol, pyramideformede neuroner er mærket med DilC18 (3) farvestof og analyseres ved hjælp af neuronal rekonstruktion software til at vurdere neuronal morfologi og dendritiske pigge. At undersøge neuronal struktur, dendritic forgrening analyse og Sholl analyse udføres, så forskerne til at drage slutninger om dendritic forgrening kompleksitet og neuronal arbor kompleksitet, henholdsvis. Evalueringen af dendritiske pigge udføres ved hjælp af en automatisk assisteret klassificering algoritme integreret i genopbygningen software, som klassificerer pigge i fire kategorier (dvs. tynd, champignon, stubby, filopodia). Desuden vælges der yderligere tre parametre (dvs. længde, hoveddiameter og volumen) for at vurdere ændringer i dendritisk rygsøjlemorfologi. For at validere potentialet i bred anvendelse af den ballistiske mærkningsteknik blev pyramideformede neuroner fra in vitro-cellekultur med succes mærket. Samlet set er den ballistiske mærkningsmetode unik og nyttig til visualisering af neuroner i forskellige hjerneregioner hos rotter, som i kombination med sofistikeret rekonstruktionssoftware giver forskerne mulighed for at belyse de mulige mekanismer, der ligger til grund for neurokognitiv dysfunktion.

I figur 2A, de typiske pyramideformede neuroner i hippocampal regionen i rotte hjernen sektioner blev identificeret ved ballistiske mærkning teknologi, karakteriseret ved en stor apilogisk dendrite og flere mindre basal dendritter omkring soma. Figur 2B viser neuron i neuronal rekonstruktion kvantitative analyse software efter soma blev opdaget, dendritiske grene blev sporet, og pigge blev opdaget. Efterfølgende blev dataene analyseret ved hjælp af neuronal r...

Watch this Scientific Journal Video about Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture at JoVE.com

Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture

Vi præsenterer en protokol til at mærke og analysere pyramideformede neuroner, som er afgørende for at evaluere potentielle morfologiske ændringer i neuroner og dendritiske pigge, der kan ligge til grund for neurokemiske og adfærdsmæssige abnormiteter.

Ballistisk mærkning af pyramideformede neuroner i hjerneskiver og i primærcellekultur

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of ...

Denne protokol gør det muligt at evaluere potentielle morfologiske ændringer i neuroner og dendritiske pigge, der kan understrege neurokemiske og adfærdsmæssige abnormiteter. Det er unikt og nyttigt til at visualisere neuroner i forskellige hjerneregioner hos rotter, som i kombination med sofistikeret rekonstruktionssoftware giver forskerne mulighed for at belyse de mulige mekanismer, der ligger til grund for neurokognitiv dysfunktion. Begynd med at forberede PVP-løsning i henhold til manuskriptretninger.Fyld slangen med PVP og lad det være i 20 minutter. Og udstød den gennem den anden ende med en 10 milliliter sprøjte. Kombiner 170 milligram wolfram mikrocarrier perler med 250 mikroliter af methylenchlorid.Derefter grundigt vortex suspensionen. Dernæst tilsættes 6 milligram lipofile DilC18(3) farvestof til 300 mikroliter af methylenchlorid og vortex. Pipet 250 mikroliter af wolfram perle suspension på et glas dias.Vent på, at suspensionen lufttørres, og tilsæt 300 mikroliter af farveopløsningen. Når den er tørret, skal du bruge en barbermaskine til at opdele blandingen i to 1,5 milliliter centrifugerør og fylde rørene med vand. Sonikere blandingen i et vandbad, indtil homogen.Sørg for, at sonikatorspidsen ligger direkte på rørene. Kombiner de to blandinger i et 15 milliliter konisk rør. Og sonikere i yderligere tre minutter, og sørg for, at ingen store klumper af farvestof belagt perler tilbage.Efter sonikering trækkes blandingen ind i PVP-belagte slanger med en 10 millilitersprøjte. Og før slangen ind i forberedelsesstationen. Drej slangen i et minut.Fjern forsigtigt alt vandet med en sprøjte. Tænd for nitrogengassen og juster nitrogenstrømmen til ca. 0,5 liter i minuttet. Drej slangen i forberedelsesstationen og tør den med nitrogen i 30 minutter.Fjern slangen fra stationen og skær den i 13 millimeter segmenter med en slangeskærer. Sørg for, at rotten ikke reagerer på skadelige stimuli og reflekser er fraværende. Fastgør den derefter i liggende position.Lav et snit langs brystlinjen. Adskære mellemgulvet og åbn brystet med en saks. Sæt derefter en 20 gauge 25 millimeter nål ind i venstre hjertekammer.Skær straks højre atrium med en saks og gennemskinne 15 milliliter 100 millimolar PBS med en 5 millimeter pr. minut strømningshastighed. Derefter perfuse 100 milliliter af 4%PFA buffered i PBS. Efter perfusion, fjerne hele rotte hjernen.Og postfix det med 4% PFA i 10 minutter. Brug en rotte hjerne matrix til at skære 500 mikrometer tyk koronal sektion. Lav et knytnæveslag og hold klingen på plads.Lav derefter endnu et snit med en anden klinge, og fjern den første klinge lodret, så vævet holdes på klingens overflade. Placer hjernen skiver i 24-brønd plade med 1 milliliter PBS i hver brønd. Og gentag processen, indtil alle skiver er blevet skåret.Fjern PBS fra hver målrettet brønd. Læg brusken med et stykke Dil/wolframslange, og læg den i applikatoren. Sæt et stykke filterpapir mellem de to maskeskærme.Og tilslut applikatoren til heliumslangen. Derefter justere udgangstrykket af helium til 90 pounds per kvadrattomme. Anbring applikatoren lodret på midten af målstænningen 1,5 centimeter mellem prøven og maskeskærmen.Så fyr Dil / wolfram slanger. Læg brusken med den næste slange og brand løbende perlerne fra slangen på de resterende skiver. Fyld 24-brøndpladen med 100 millimolar PBS.Og vask skiverne tre gange med 500 mikroliter frisk PBS. Sørg for, at skiverne ikke vælter under vasken. Når du er færdig, tilsættes 500 mikroliter frisk PBS til skiverne.Og inkuber dem i tre timer ved fire grader Celsius i mørket. Efter inkubationen skal du bruge en fin børste til at overføre hjerneskiverne på glasdias. Og straks tilføje en milliliter antifade montering medium til hver sektion.Placer en 22 af 15 millimeter coverslip over sektionerne og tør dias i mørke. Tænd for det konfokale mikroskopsystem, og skift til en 60X målsætning. Juster billedindstillingerne i henhold til håndskriftsanvisninger.Og få Z-stack billeder til den målrettede neuron type baseret på hjernen region grænser og morfologiske egenskaber af neuroner. Isoler primær kortikal neuron fra F344/N rotter på postnatal dag et og kultur dem i en 35 millimeter glas bund skål for en uge. Forfriskende halvdelen af mediet på den tredje dag efter isolation.Skålen vaskes to gange med 1 milliliter 100 millimolar PBS. Og fastgør cellerne med 4% PFA i 15 minutter ved stuetemperatur. Ballistisk mærke cellerne som tidligere beskrevet.Og vask dem tre gange mere med 1 milliliter PBS. Tilsæt 500 mikroliter af PBS til cellerne og inkuber dem i tre timer ved fire grader Celsius i mørke. Derefter tilsættes 200 mikroliter af antifade montering medium.Og få Z-stack billeder for hver målrettet neuron. Typiske pyramideformede neuroner i hippocampal region i rotte hjernen sektioner blev identificeret med ballistiske mærkning teknologi karakteriseret ved en stor apikale dendrite og flere mindre basal dendritter omkring soma. Neuronal rekonstruktion kvantitativ analyse software blev brugt til at spore dendritiske grene og opdage pigge.Efterfølgende blev softwaren brugt til at vurdere dendritiske forgrening kompleksitet og neuronal arbor kompleksitet. Morfologiske ændringer i dendritiske pigge blev vurderet ved hjælp af længde, volumen og hoveddiameter. Så pigge blev klassificeret i tynde, stumpet, og champignon pigge.Og den relative hyppighed af antallet af pigge mellem hver radius blev undersøgt. Yderligere mere den ballistiske mærkning teknik blev valideret på en primær pyramideformet neuron i cellekultur. Pyramideale neuroner blev identificeret baseret på trekanten form af soma og store apical dendrite.Så neuronal rekonstruktion software blev brugt til at analysere fordelingen af tynde dendritiske pigge og dendritiske rygsøjlen længde. Når du forsøger denne protokol, er det vigtigt at undgå store klumper eller klynger af ballistiske farvestof belagt wolfram perler begynder forberedelse. Klumper ville ikke tillade individuelle neuroner at skelne.Kombineret med neuronal rekonstruktion software denne metode giver os mulighed for at undersøge neuronal og dendritisk rygsøjlen morfologi i hippocampal pyramideale neuroner. Neuronal rekonstruktion software udnytte en algoritme til at tilbyde automatisk assisteret klassificering af dendritiske pigge. Kvantificeringen af flere neuronale parametre giver mulighed for bedre at forstå den mekanisme, der ligger til grund for neuronal kognitiv dysfunktion.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograd fluorescensmærkning Tillader Målrettet Extracellular Single-unit Optagelse fra Identificerede Neuroner<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Imaging Calcium respons i GFP-mærkede neuroner i hypothalamus musehjerne Slices

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

Spændingsfølsomme Dye Optagelse fra axoner, dendritter og dendrit udløberne af individuelle neuroner i hjernen Slices

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Dobbelte Elektrofysiologiske Optagelser af synaptisk-evoked astrogliale og Neuronal respons i Akut hippocampusskiver

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Primær Kultur Mouse dopaminerge neuroner

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Forbundne Helcelle optagelser i Organotypiske hippocampusskiver

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Isolation, Kultur og opretholdelse på lang sigt af Primary mesencephaliske dopaminerge neuroner af embryonale Gnavere Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-celle Patch-clamp Optagelser i Brain Skiver

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...