Name: ballistic labeling of pyramidal neurons in brain slices and in primary cell culture
Uploaded: 2020-04-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture at JoVE.com

Ce travail a été financé par les subventions des NIH HD043680, MH106392, DA013137 et NS100624.

Tous les protocoles d’animaux ont été examinés et approuvés par le Comité de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de Caroline du Sud (numéro d’assurance fédéral : D16-00028).
1. Préparation de tubes de perles DiI/Tungsten
<ol><li>Dissoudre 100 mg de polyvinylpyrrolidone (PVP) avec 10 ml de ddH2O. Vortex la solution PVP à la légère.</li>
	<li>Remplissez le tube avec la solution PVP (voir Tableau des matériaux) et laissez-le penda...

<ol>
	<li>Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+"DiOlistic"+labeling+of+the+nervous+system+using+lipophilic+dye+combinations.">Multicolor "DiOlistic" labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations.</a> Neuron. 27, 219-225 (2000).</li><li>Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, R. O., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ballistic+delivery+of+dyes+for+structural+and+functional+studies+of+the+nervous+system.">Ballistic delivery of dyes for structural and functional studies of the nervous system.</a> Cold Spring Harbor Protocol. 2009 (4), 5202 (2009).</li><li>Seabold, G. K., Daunais, J. B., Rau, A., Grant, K. A., Alvarez, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DiOLISTIC+labeling+of+neurons+from+rodent+and+non-human+primate+brain+slices.">DiOLISTIC labeling of neurons from rodent and non-human primate brain slices.</a> Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).</li><li>Spacek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+the+Golgi+method:+a+time-lapse+study+of+the+early+stages+of+impregnation+in+single+sections.">Dynamics of the Golgi method: a time-lapse study of the early stages of impregnation in single sections.</a> Journal of Neurocytology. 18 (1), 27-38 (1989).</li><li>McLaurin, K. A., Li, H., Booze, R. M., Mactutus, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+Timing:+NeuroHIV+Progression+in+the+Post-cART+Era.">Disruption of Timing: NeuroHIV Progression in the Post-cART Era.</a> Science Reports. 9 (1), 827 (2019).</li><li>Spruston, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyramidal+neurons:+dendritic+structure+and+synaptic+integration.">Pyramidal neurons: dendritic structure and synaptic integration.</a> Nature Reviews Neurosciences. 9 (3), 206-221 (2008).</li><li>Megias, M., Emri, Z., Freund, T. F., Gulyas, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+number+and+distribution+of+inhibitory+and+excitatory+synapses+on+hippocampal+CA1+pyramidal+cells.">Total number and distribution of inhibitory and excitatory synapses on hippocampal CA1 pyramidal cells.</a> Neuroscience. 102, 527-540 (2001).</li><li>Peters, A., Kaiserman-Abramof, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+small+pyramidal+neuron+of+the+rat+cerebral+cortex.+The+perikaryon,+dendrites+and+spines.">The small pyramidal neuron of the rat cerebral cortex. The perikaryon, dendrites and spines.</a> American Journal of Anatomy. 127, 321-355 (1970).</li><li>Harris, K. M., Sultan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+the+number,+location,+and+size+of+synaptic+vesicles+provides+an+anatomical+basis+for+the+nonuniform+probability+of+release+at+hippocampal+CA1+synapses.">Variation in the number, location, and size of synaptic vesicles provides an anatomical basis for the nonuniform probability of release at hippocampal CA1 synapses.</a> Neuropharmacology. 34, 1387-1395 (1995).</li><li>Sorra, K. E., Fiala, J. C., Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+assessment+of+the+involvement+of+perforations,+spinules,+and+spine+branching+in+hippocampal+synapse+formation.">Critical assessment of the involvement of perforations, spinules, and spine branching in hippocampal synapse formation.</a> Journal of Comparative Neurology. 398, 225-240 (1998).</li><li>Mancuso, J. J., Chen, Y., Li, X., Xue, Z., Wong, S. T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+dendritic+spine+detection:+from+Golgi+to+high-resolution+optical+imaging.">Methods of dendritic spine detection: from Golgi to high-resolution optical imaging.</a> Neuroscience. 251, 129-140 (2012).</li><li>McLaurin, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+connectivity+in+medium+spiny+neurons+of+the+nucleus+accumbens:+A+sex-dependent+mechanism+underlying+apathy+in+the+HIV-1+transgenic+rat.">Synaptic connectivity in medium spiny neurons of the nucleus accumbens: A sex-dependent mechanism underlying apathy in the HIV-1 transgenic rat.</a> Frontiers in Behavior Neurosciences. 12, 285 (2018).</li><li>Roscoe, R. F., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+transgenic+female+rat:+synaptodendritic+alterations+of+medium+spiny+neurons+in+the+nucleus+accumbens.">HIV-1 transgenic female rat: synaptodendritic alterations of medium spiny neurons in the nucleus accumbens.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 9 (5), 642-653 (2014).</li><li>Li, H., Aksenova, M., Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Booze, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Filamentous+Actin+(F-actin)+Puncta+in+Rat+Cortical+Neurons.">Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (108), e53697 (2016).</li><li>Rodriguez, A., Ehlenberger, D. B., Dickstein, D. L., Hof, P. R., Wearne, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+Three-Dimensional+Detection+and+Shape+Classification+of+Dendritic+Spines+from+Fluorescence+Microscopy+Images.">Automated Three-Dimensional Detection and Shape Classification of Dendritic Spines from Fluorescence Microscopy Images.</a> PLoS ONE. 3 (10), 1371 (2008).</li></ol>

Dans ce protocole, nous décrivons une technique d’étiquetage polyvalente pour les neurones du cerveau de rat et ceux cultivés in vitro. En outre, nous rapportons la méthodologie pour utiliser le logiciel de reconstruction neuronale et le logiciel d’analyse quantitative de reconstruction neuronale pour évaluer la morphologie neuronale et les épines dendritiques. L’évaluation de la morphologie neuronale et des épines dendritiques fournit une occasion de déterminer des altérations dans la complexité de rami...

En 2000, Gan et coll. ont décrit une technique d’étiquetage rapide pour les neurones individuels et les glia dans le système nerveux qui a combiné divers colorants lipophiles, permettant l’étiquetage simultané de nombreuses cellules du cerveau avec des couleurs différentes1,2. Plus récemment, une technique d’étiquetage balistique a été décrite par Seabold et coll.3 qui a introduit des colorants fluorescents (Dil) dans les neurones des tranches de cerveau. Technique polyvalente de coloration, l’étiquetage balistique est apprécié pour sa capacité à être utilisée chez plusieurs espèces animales et à travers un large éventail d’âges. En outre, il peut être combiné avec l’immunostaining pour identifier les sous-populations des cellules du cerveau3. Par rapport aux techniques traditionnelles (p. ex., l’imprégnation argentée Golgi-Cox, microinjection)4, l’étiquetage balistique offre l’occasion de distinguer plus clairement les caractéristiques morphologiques, y compris les épines dendritiques, une caractéristique essentielle pour tirer des inférences sur la complexité neuronale et la connectivité synaptique5.
Les neurones pyramidaux excitatoires sont caractérisés par un seul, grand dendrite apical, de multiples dendrites basales plus courtes, et des milliers d’épines dendritiques6. Les neurones pyramidaux se trouvent dans plusieurs régions du cerveau liées au traitement cognitif de l’ordre supérieur, y compris le cortex préfrontal (PFC) et l’hippocampe. Dans le PFC, les neurones pyramidaux sont observés dans les couches II/III et la couche V, chacun présentant une morphologie unique. Plus précisément, les neurones pyramidaux dans la couche II/III du PFC ont un dendrite apique plus court et moins de ramification que les neurones pyramidaux dans la couche V6. Dans l’hippocampe, les neurones pyramidaux sont situés dans les régions CA1 et CA3, chacun affichant des morphologies distinctes. Plus précisément, les neurones pyramidaux dans la région de CA1 présentent un dendrite apical plus distinctif, avec la branche se produisant plus loin de la soma, par rapport à la région de CA36.
Les épines dendritiques sur les neurones pyramidaux dans le PFC et l’hippocampe sont le site primaire des synapses excitatrices7. Les caractéristiques morphologiques des épines dendritiques, qui sont classiquement caractérisées en trois catégories primaires (c.-à-d. minces, trapues, ou champignons8), ont été liées à la taille de la synapse excitatrice9. Les épines minces, caractérisées par un long cou mince, une petite tête bulbeuse et de plus petites densités postsynaptiques, sont plus instables et développent des connexions plus faibles. Cependant, les épines de champignon, qui ont une tête de colonne vertébrale dendritique plus grande, sont identifiées pour former des connexions synaptiques plus fortes, un effet résultant de leur plus grande taille. En contraste net, les épines trapues sont dépourvues d’un cou de la colonne vertébrale, présentant un rapport de volume de la tête et du cou à peu près égal8. Dans l’hippocampe, des épines ramifiées peuvent également être observées, auquel cas la colonne vertébrale a plusieurs têtes qui émergent du même cou de la colonne vertébrale dendritique10. Par conséquent, les changements morphologiques des épines dendritiques pourraient refléter la fonctionnalité et la capacité structurelle. En outre, des études ont démontré que la taille et la forme des épines dendritiques se rapportent à leur plasticité structurelle, conduisant à l’idée que les petites épines sont impliquées dans l’apprentissage et l’attention, tandis que de plus grandes épines plus stables, sont impliqués dans des processus à long terme, y compris la mémoire11. En outre, la distribution des épines dendritiques le long de la dendrite peut être associée à la connectivité synaptique5,12.
Ainsi, le présent document méthodologique a trois objectifs: 1) Présenter notre protocole d’étiquetage balistique, qui a été utilisé avec un taux de réussite (c’est-à-dire, neurones répondant aux critères de sélection et approprié pour l’analyse) de 83,3%5,12,13 et à travers les régions du cerveau multiples (c.-à-d., PFC, noyau accumbens, hippocampe); 2) Démontrer la généralisation de la technique et son application aux neurones cultivés in vitro; 3) Détail de la méthodologie utilisée dans le logiciel de reconstruction neuronale et les inférences qui peuvent être tirées à partir de ces données.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:868px;" width="869">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">20Gx25mm PrecisionGlide needle</td>
			<td style="width:263px;">BD</td>
			<td style="width:143px;">305175</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24-well cell culture plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">35 mm Glass Bottom Dishes</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-1.5-20-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Antibiotic-Antimycotic solution</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>30004CI</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">B-27 supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>50X</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Barrel liner</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Borax</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Boric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B0252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cartridge holder</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Confocal imaging software</td>
			<td style="width:263px;">Nikon</td>
			<td style="width:143px;">EZ-C1</td>
			<td>version 3.81b</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:263px;">Nikon</td>
			<td style="width:143px;">TE-2000E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cover glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>637-137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DilC18(3)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM/F12 medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10565-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dumont #5 Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dumont #7 Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">F344 rat</td>
			<td style="width:263px;">(Harlan Laboratories, Indianapolis, IN)</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glucose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>101174Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GlutaMax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HBSS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4641</td>
			<td>10X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Helios diffusion screens</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Helios gene gun kit</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Helios gene gun system</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Helium hose assembly</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Iris Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>15914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Iris Scissors</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methylene chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D150-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Neurobasal medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Neurolucida 360 software</td>
			<td style="width:263px;">mbf bioscience</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td>dendritic spine analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyvinylpyrrolidone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>5295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ProLong Gold antifade reagent</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P36930</td>
			<td>mounting medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat brain matrix, 300 - 600g, Coronal, 0.5mm</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>15047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sevoflurane</td>
			<td>Merritt Veterinary Supply</td>
			<td>347075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SuperFrost Plus Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-154%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe kit</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tefzel tubing</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tubing cutter</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tubing Prep station</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tungsten M-25 Microcarrier 1.7 &#181;m</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vannas Scissors</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500086</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ballistic labeling of pyramidal neurons in brain slices and in primary cell culture

Il a été rapporté que la taille et la forme des épines dendritiques est liée à leur plasticité structurelle. Pour identifier la structure morphologique des neurones pyramidaux et des épines dendritiques, une technique d’étiquetage balistique peut être utilisée. Dans le protocole actuel, les neurones pyramidaux sont étiquetés avec le colorant DilC18(3) et analysés à l’aide d’un logiciel de reconstruction neuronale pour évaluer la morphologie neuronale et les épines dendritiques. Pour étudier la structure neuronale, l’analyse de branchement dendritique et l’analyse de Sholl sont exécutées, permettant aux chercheurs de tirer des inférences au sujet de la complexité de ramification dendritique et de la complexité neuronale d’arborescence, respectivement. L’évaluation des épines dendritiques est effectuée à l’aide d’un algorithme de classification assisté automatique faisant partie intégrante du logiciel de reconstruction, qui classe les épines en quatre catégories (c.-à-d. minces, champignons, stubby, filopode). De plus, trois autres paramètres (c.-à-d. longueur, diamètre de la tête et volume) sont également choisis pour évaluer les altérations de la morphologie de la colonne vertébrale dendritique. Pour valider le potentiel d’application large de la technique d’étiquetage balistique, les neurones pyramidaux de la culture cellulaire in vitro ont été étiquetés avec succès. Dans l’ensemble, la méthode d’étiquetage balistique est unique et utile pour visualiser les neurones dans différentes régions du cerveau chez les rats, ce qui, en combinaison avec un logiciel de reconstruction sophistiqué, permet aux chercheurs d’élucider les mécanismes possibles sous-jacents dysfonction neurocognitive.

Dans la figure 2A, les neurones pyramidaux typiques dans la région hippocampique dans les sections du cerveau de rat ont été identifiés par la technologie d’étiquetage balistique, caractérisée par un grand dendrite apical et plusieurs dendrites basales plus petites autour du soma. La figure 2B montre le neurone dans le logiciel d’analyse quantitative de reconstruction neuronale après que le soma ait été détecté, des branches dendritiques ont ét?...

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Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture

Nous présentons un protocole pour étiqueter et analyser les neurones pyramidaux, qui est essentiel pour évaluer les altérations morphologiques potentielles dans les neurones et les épines dendritiques qui peuvent sous-tendre les anomalies neurochimiques et comportementales.

Étiquetage balistique des neurones pyramidaux dans les tranches de cerveau et dans la culture cellulaire primaire

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of ...

Ce protocole permet d’évaluer les altérations morphologiques potentielles des neurones et des épines dendritiques qui peuvent souligner les anomalies neurochimiques et comportementales. Il est unique et utile pour visualiser les neurones dans différentes régions du cerveau chez les rats, ce qui, en combinaison avec un logiciel de reconstruction sophistiqué permet aux chercheurs d’élucider les mécanismes possibles sous-jacents au dysfonctionnement neurocognitif. Commencez par préparer la solution PVP selon les directives manuscrites.Remplissez le tube de PVP et laissez-le pendant 20 minutes. Et l’expulser à travers l’autre bout avec une seringue de 10 millilitres. Mélanger 170 milligrammes de perles de microcarrier de tungstène avec 250 microlitres de chlorure de méthylène.Puis bien vortex de la suspension. Ensuite, ajoutez 6 milligrammes de colorant lipophile DilC18(3) à 300 microlitres de chlorure de méthylène et de vortex. Pipet 250 microlitres de la suspension de perle de tungstène sur une glissière en verre.Attendez que la suspension sèche à l’air libre et ajoutez 300 microlitres de la solution de teinture. Une fois séché, utiliser un rasoir pour diviser le mélange en deux tubes centrifugeuses de 1,5 millilitre et remplir les tubes d’eau. Sonicate le mélange dans un bain d’eau jusqu’à homogénéité.S’assurer que la pointe du sonicateur se trouve directement sur les tubes. Dans un tube conique de 15 millilitres, mélanger les deux mélanges. Et sonicate pendant encore trois minutes, en s’assurant qu’il ne reste pas de grandes touffes de perles enduites de teinture.Après la sonication, dessiner le mélange dans le tube enduit PVP avec une seringue de 10 millilitres. Et nourrir le tube dans la station de préparation. Faites pivoter le tube pendant une minute.Retirer soigneusement toute l’eau à l’aide d’une seringue. Allumez le gaz azoté et ajustez le débit d’azote à environ 0,5 litres par minute. Faites pivoter le tube dans la station de préparation et séchez-le avec de l’azote pendant 30 minutes.Retirez le tube de la station et coupez-le en segments de 13 millimètres à l’aide d’un coupe-tube. Assurez-vous que le rat n’est pas sensible aux stimuli nocifs et les réflexes sont absents. Ensuite, fixez-le dans la position supine.Faire une incision le long de la ligne médiane thoracique. Séparez le diaphragme et ouvrez la poitrine avec des ciseaux. Insérez ensuite une aiguille de 20 jauges de 25 millimètres dans le ventricule gauche.Coupez immédiatement l’atrium droit avec des ciseaux et perfusez 15 millilitres de PBS de 100 millimolaires avec un débit de 5 millimètres par minute. Puis parcourir 100 millilitres de 4%PFA tamponné en PBS. Après la perfusion, retirez tout le cerveau du rat.Et postfix il avec 4%PFA pendant 10 minutes. Utilisez une matrice cérébrale de rat pour couper 500 micromètres d’épaisseur section coronale. Faire une coupe de poing et garder la lame en place.Ensuite, faites une deuxième coupe avec une deuxième lame et retirez verticalement la première lame, en gardant le tissu sur la surface de la lame. Placez les tranches de cerveau dans la plaque de 24 puits avec 1 millilitre de PBS dans chaque puits. Et répétez le processus jusqu’à ce que toutes les tranches aient été coupées.Retirez le PBS de chaque puits ciblé. Chargez le cartilage avec un morceau de tube de dil/tungstène et placez-le dans l’applicateur. Mettez un morceau de papier filtre entre les deux écrans de maille.Et connectez l’applicateur au tuyau d’hélium. Réglez ensuite la pression de sortie de l’hélium à 90 livres par pouce carré. Placez l’applicateur verticalement au centre du puits ciblé de 1,5 centimètre entre l’échantillon et l’écran en maille.Puis tirez sur le tube de dil/tungstène. Chargez le cartilage avec le tube suivant et tirez continuellement les perles du tube sur les tranches restantes. Remplissez la plaque de 24 puits avec 100 millimolar PBS.Et laver les tranches trois fois avec 500 microlitres de PBS frais. S’assurer que les tranches ne se retournent pas pendant le lavage. Une fois terminé, ajouter 500 microlitres de PBS frais aux tranches.Et les incuber pendant trois heures à quatre degrés Celsius dans le noir. Après l’incubation, utiliser une brosse fine pour transférer les tranches de cerveau sur des toboggans en verre. Et ajoutez immédiatement un millilitre de support de montage antifade à chaque section.Placez un coverslip de 22 par 15 millimètres sur les sections et séchez les glissières dans l’obscurité. Allumez le système de microscope confocal et passez à un objectif 60X. Ajustez les paramètres d’imagerie en fonction des instructions manuscrites.Et obtenir des images Z-stack pour le type de neurone ciblé basé sur les limites de la région du cerveau et les caractéristiques morphologiques des neurones. Isoler le neurone cortical primaire des rats F344/N au premier jour postnatal et les culture dans un plat de fond en verre de 35 millimètres pendant une semaine. Rafraîchissant la moitié du milieu le troisième jour après l’isolement.Lavez le plat deux fois avec 1 millilitre de 100 millimolar PBS. Et fixer les cellules avec 4%PFA pendant 15 minutes à température ambiante. Étiquetez balistiquement les cellules comme précédemment décrites.Et lavez-les trois fois de plus avec 1 millilitre de PBS. Ajouter 500 microlitres de PBS aux cellules et les incuber pendant trois heures à quatre degrés Celsius dans l’obscurité. Ajouter ensuite 200 microlitres de milieu de montage antifade.Et obtenez des images Z-stack pour chaque neurone ciblé. Les neurones pyramidaux typiques dans la région hippocampale dans les sections de cerveau de rat ont été identifiés avec la technologie d’étiquetage balistique caractérisée par un grand dendrite apical et plusieurs dendrites basiques plus petits autour du soma. Le logiciel d’analyse quantitative de reconstruction neuronale a été utilisé pour tracer les branches dendritiques et détecter les épines.Par la suite, le logiciel a été utilisé pour évaluer la complexité des ramifications dendritiques et la complexité neuronale des arbres. Des changements morphologiques dans des épines dendritiques ont été évalués utilisant la longueur, le volume, et le diamètre de tête. Puis les épines ont été classées en épines minces, stubby, et champignons.Et la fréquence relative du nombre d’épines entre chaque rayon a été examinée. En outre, la technique d’étiquetage balistique a été validée sur un neurone pyramidal primaire dans la culture cellulaire. Des neurones pyramidaux ont été identifiés basés sur la forme de triangle du soma et le grand dendrite apical.Puis le logiciel de reconstruction neuronale a été utilisé pour analyser la distribution des épines dendritiques minces et de la longueur de la colonne vertébrale dendritique. Lorsque vous essayez ce protocole, il est important d’éviter de grandes touffes ou des grappes de perles de tungstène enduites de colorant balistique qui commencent la préparation. Les touffes ne permettraient pas de distinguer les neurones individuels.Combinée à un logiciel de reconstruction neuronale, cette méthode nous permet d’examiner la morphologie neuronale et dendritique de la colonne vertébrale dans les neurones pyramidaux hippocampiques. Le logiciel de reconstruction neuronale utilise un algorithme pour offrir la classification assistée automatique des épines dendritiques. La quantification de paramètres neuronaux multiples offre l’occasion de mieux comprendre le mécanisme sous-jacent au dysfonctionnement cognitif neuronal.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Dissection et la culture de neurones de la moelle épinière commissurales embryonnaires

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Recherche

Neurosciences

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

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DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Marquage fluorescent rétrograde Permet ciblée extracellulaire seule unité d&#39;enregistrement de neurones identifiés<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Les réponses de calcium dans les neurones d&#39;imagerie GFP-marqués de hypothalamiques tranches de cerveau de souris

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

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Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

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