Name: ballistic labeling of pyramidal neurons in brain slices and in primary cell culture
Uploaded: 2020-04-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch NIH-Stipendien HD043680, MH106392, DA013137 und NS100624 finanziert.

Alle Tierprotokolle wurden vom Animal Care and Use Committee der University of South Carolina überprüft und genehmigt (Bundesversicherungsnummer: D16-00028).
1. Herstellung von DiI/Tungsten-Perlenschläuchen
<ol><li>100 mg Polyvinylpyrrolidon (PVP) mit 10 ml ddH2O. Vortex die PVP-Lösung leicht auflösen.</li>
	<li>Füllen Sie den Schlauch mit der PVP-Lösung (siehe Materialtabelle) und lassen Sie ihn 20 min. Dann vertreiben Sie die PVP-Lösung durch das andere ...

<ol>
	<li>Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+"DiOlistic"+labeling+of+the+nervous+system+using+lipophilic+dye+combinations.">Multicolor "DiOlistic" labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations.</a> Neuron. 27, 219-225 (2000).</li><li>Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, R. O., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ballistic+delivery+of+dyes+for+structural+and+functional+studies+of+the+nervous+system.">Ballistic delivery of dyes for structural and functional studies of the nervous system.</a> Cold Spring Harbor Protocol. 2009 (4), 5202 (2009).</li><li>Seabold, G. K., Daunais, J. B., Rau, A., Grant, K. A., Alvarez, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DiOLISTIC+labeling+of+neurons+from+rodent+and+non-human+primate+brain+slices.">DiOLISTIC labeling of neurons from rodent and non-human primate brain slices.</a> Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).</li><li>Spacek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+the+Golgi+method:+a+time-lapse+study+of+the+early+stages+of+impregnation+in+single+sections.">Dynamics of the Golgi method: a time-lapse study of the early stages of impregnation in single sections.</a> Journal of Neurocytology. 18 (1), 27-38 (1989).</li><li>McLaurin, K. A., Li, H., Booze, R. M., Mactutus, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+Timing:+NeuroHIV+Progression+in+the+Post-cART+Era.">Disruption of Timing: NeuroHIV Progression in the Post-cART Era.</a> Science Reports. 9 (1), 827 (2019).</li><li>Spruston, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyramidal+neurons:+dendritic+structure+and+synaptic+integration.">Pyramidal neurons: dendritic structure and synaptic integration.</a> Nature Reviews Neurosciences. 9 (3), 206-221 (2008).</li><li>Megias, M., Emri, Z., Freund, T. F., Gulyas, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+number+and+distribution+of+inhibitory+and+excitatory+synapses+on+hippocampal+CA1+pyramidal+cells.">Total number and distribution of inhibitory and excitatory synapses on hippocampal CA1 pyramidal cells.</a> Neuroscience. 102, 527-540 (2001).</li><li>Peters, A., Kaiserman-Abramof, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+small+pyramidal+neuron+of+the+rat+cerebral+cortex.+The+perikaryon,+dendrites+and+spines.">The small pyramidal neuron of the rat cerebral cortex. The perikaryon, dendrites and spines.</a> American Journal of Anatomy. 127, 321-355 (1970).</li><li>Harris, K. M., Sultan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+the+number,+location,+and+size+of+synaptic+vesicles+provides+an+anatomical+basis+for+the+nonuniform+probability+of+release+at+hippocampal+CA1+synapses.">Variation in the number, location, and size of synaptic vesicles provides an anatomical basis for the nonuniform probability of release at hippocampal CA1 synapses.</a> Neuropharmacology. 34, 1387-1395 (1995).</li><li>Sorra, K. E., Fiala, J. C., Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+assessment+of+the+involvement+of+perforations,+spinules,+and+spine+branching+in+hippocampal+synapse+formation.">Critical assessment of the involvement of perforations, spinules, and spine branching in hippocampal synapse formation.</a> Journal of Comparative Neurology. 398, 225-240 (1998).</li><li>Mancuso, J. J., Chen, Y., Li, X., Xue, Z., Wong, S. T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+dendritic+spine+detection:+from+Golgi+to+high-resolution+optical+imaging.">Methods of dendritic spine detection: from Golgi to high-resolution optical imaging.</a> Neuroscience. 251, 129-140 (2012).</li><li>McLaurin, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+connectivity+in+medium+spiny+neurons+of+the+nucleus+accumbens:+A+sex-dependent+mechanism+underlying+apathy+in+the+HIV-1+transgenic+rat.">Synaptic connectivity in medium spiny neurons of the nucleus accumbens: A sex-dependent mechanism underlying apathy in the HIV-1 transgenic rat.</a> Frontiers in Behavior Neurosciences. 12, 285 (2018).</li><li>Roscoe, R. F., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+transgenic+female+rat:+synaptodendritic+alterations+of+medium+spiny+neurons+in+the+nucleus+accumbens.">HIV-1 transgenic female rat: synaptodendritic alterations of medium spiny neurons in the nucleus accumbens.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 9 (5), 642-653 (2014).</li><li>Li, H., Aksenova, M., Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Booze, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Filamentous+Actin+(F-actin)+Puncta+in+Rat+Cortical+Neurons.">Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (108), e53697 (2016).</li><li>Rodriguez, A., Ehlenberger, D. B., Dickstein, D. L., Hof, P. R., Wearne, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+Three-Dimensional+Detection+and+Shape+Classification+of+Dendritic+Spines+from+Fluorescence+Microscopy+Images.">Automated Three-Dimensional Detection and Shape Classification of Dendritic Spines from Fluorescence Microscopy Images.</a> PLoS ONE. 3 (10), 1371 (2008).</li></ol>

In diesem Protokoll beschreiben wir eine vielseitige Etikettierungstechnik für Neuronen sowohl aus Rattenhirn als auch für in vitro angebaute. Darüber hinaus berichten wir über die Methodik für die Verwendung von neuronaler Rekonstruktionssoftware und neuronaler Rekonstruktionquantitativer Analysesoftware zur Bewertung der neuronalen Morphologie und dendritischer Stacheln. Die Bewertung der neuronalen Morphologie und dendritischen Stacheln bietet die Möglichkeit, Veränderungen in dendritischer Verzweigungskomplexi...

Im Jahr 2000 beschrieben Gan et al. eine schnelle Etikettierungstechnik für einzelne Neuronen und Glia im Nervensystem, die verschiedene lipophile Farbstoffe kombinierte, was die gleichzeitige Kennzeichnung vieler Gehirnzellen mit verschiedenen Farben1,2ermöglichte. In jüngerer Zeit wurde eine ballistische Etikettierungstechnik von Seabold et al.3 beschrieben, die fluoreszierende Farbstoffe (Dil) in die Neuronen von Gehirnscheiben einführte. Eine vielseitige Färbetechnik, ballistische Etikettierung wird für seine Fähigkeit geschätzt, in mehreren Tierarten und über eine breite Palette von Altersgruppen verwendet werden. Darüber hinaus kann es mit Immunostainierung kombiniert werden, um Subpopulationen von Gehirnzellen3zu identifizieren. Im Vergleich zu herkömmlichen Techniken (z. B. Golgi-Cox Silberimprägnierung, Mikroinjektion)4bietet die ballistische Etikettierung die Möglichkeit, morphologische Merkmale, einschließlich dendritischer Stacheln, klarer zu unterscheiden, ein Merkmal, das entscheidend ist, um Rückschlüsse auf neuronale Komplexität und synaptische Konnektivität zu ziehen5.
Exzitatorische pyramidale Neuronen zeichnen sich durch einen einzigen, großen apikalen Dendrit, mehrere kürzere Basaldendriten und Tausende von dendritischen Stacheln6aus. Pyramidale Neuronen sind in mehreren Gehirnregionen im Zusammenhang mit höherer Ordnung kognitive Verarbeitung gefunden, einschließlich der präfrontalen Kortex (PFC) und Hippocampus. In der PFC werden pyramidale Neuronen in den Schichten II/III und Schicht V beobachtet, wobei jede eine einzigartige Morphologie aufweist. Insbesondere pyramidenförmige Neuronen in Schicht II/III der PFC haben einen kürzeren apikalen Dendrit und weniger verzweigt als pyramidale Neuronen in Schicht V6. Innerhalb des Hippocampus befinden sich pyramidale Neuronen sowohl in den CA1- als auch in der CA3-Region, wobei jede unterschiedliche Morphologie zeigt. Insbesondere pyramidenförmige Neuronen in der CA1-Region weisen einen ausgeprägteren apikalen Dendrit auf, wobei verzweigte Verbindungen weiter vom Soma entfernt auftreten, relativ zur CA3-Region6.
Dendritische Stacheln auf pyramidenförmigen Neuronen sowohl im PFC als auch im Hippocampus sind die primäre Stelle für exzitatorische Synapsen7. Morphologische Eigenschaften der dendritischen Stacheln, die klassisch in drei primäre Kategorien (d.h. dünn, stumpf oder Pilz8) charakterisiert sind, wurden mit der Größe der exzitatorischen Synapse9in Verbindung gebracht. Dünne Stacheln, die sich durch einen langen, dünnen Hals, einen kleinen bauchigen Kopf und kleinere postsynaptische Dichten auszeichnen, sind instabiler und entwickeln schwächere Verbindungen. Pilzdornen, die einen größeren dendritischen Wirbelsäulenkopf haben, sind jedoch dafür bekannt, stärkere synaptische Verbindungen zu bilden, ein Effekt, der sich aus ihrer größeren Größe ergibt. Im scharfen Kontrast sind stumpfe Dornen ohne Wirbelsäulenhals, die ein ungefähr gleiches Kopf- und Nackenvolumenverhältnisvon 8aufweisen. Innerhalb des Hippocampus können auch verzweigte Stacheln beobachtet werden, wobei die Wirbelsäule mehrere Köpfe hat, die aus dem gleichen dendritischen Wirbelsäulenhals10hervorgehen. Daher könnten die morphologischen Veränderungen der dendritischen Stacheln Funktionalität und strukturelle Kapazität widerspiegeln. Darüber hinaus haben Studien gezeigt, dass die Größe und Form der dendritischen Stacheln mit ihrer strukturellen Plastizität zusammenhängt, was zu der Idee führt, dass kleine Stacheln am Lernen und an der Aufmerksamkeit beteiligt sind, während größere, stabilere Stacheln an langfristigen Prozessen beteiligt sind, einschließlich Gedächtnis11. Darüber hinaus kann die Verteilung der dendritischen Stacheln entlang des Dendriten mit synaptischen Konnektivität5,12verbunden sein.
So hat das vorliegende methodische Papier drei Ziele: 1) Präsentieren Sie unser Protokoll für die ballistische Kennzeichnung, das mit einer Erfolgsrate (d. h. Neuronen, die Auswahlkriterien erfüllen und für die Analyse geeignet sind) von 83,3%5,12,13 und über mehrere Hirnregionen hinweg (d. h. PFC, Nucleus accumbens, hippocampus) verwendet wurde. 2) Nachweis der Verallgemeinerbarkeit der Technik und ihrer Anwendung auf in vitro angebaute Neuronen; 3) Erläutern Sie die In-Neuronal-Rekonstruktionssoftware verwendete Methodik und die Schlussfolgerungen, die aus solchen Daten gezogen werden können.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:868px;" width="869">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">20Gx25mm PrecisionGlide needle</td>
			<td style="width:263px;">BD</td>
			<td style="width:143px;">305175</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24-well cell culture plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">35 mm Glass Bottom Dishes</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-1.5-20-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Antibiotic-Antimycotic solution</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>30004CI</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">B-27 supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>50X</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Barrel liner</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Borax</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Boric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B0252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cartridge holder</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Confocal imaging software</td>
			<td style="width:263px;">Nikon</td>
			<td style="width:143px;">EZ-C1</td>
			<td>version 3.81b</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:263px;">Nikon</td>
			<td style="width:143px;">TE-2000E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cover glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>637-137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DilC18(3)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM/F12 medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10565-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dumont #5 Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dumont #7 Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">F344 rat</td>
			<td style="width:263px;">(Harlan Laboratories, Indianapolis, IN)</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glucose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>101174Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GlutaMax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HBSS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4641</td>
			<td>10X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Helios diffusion screens</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Helios gene gun kit</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Helios gene gun system</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Helium hose assembly</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Iris Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>15914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Iris Scissors</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methylene chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D150-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Neurobasal medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Neurolucida 360 software</td>
			<td style="width:263px;">mbf bioscience</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td>dendritic spine analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyvinylpyrrolidone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>5295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ProLong Gold antifade reagent</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P36930</td>
			<td>mounting medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat brain matrix, 300 - 600g, Coronal, 0.5mm</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>15047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sevoflurane</td>
			<td>Merritt Veterinary Supply</td>
			<td>347075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SuperFrost Plus Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-154%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe kit</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tefzel tubing</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tubing cutter</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tubing Prep station</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tungsten M-25 Microcarrier 1.7 &#181;m</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vannas Scissors</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500086</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ballistic labeling of pyramidal neurons in brain slices and in primary cell culture

Es wurde berichtet, dass die Größe und Form der dendritischen Stacheln mit ihrer strukturellen Plastizität zusammenhängt. Um die morphologische Struktur von pyramidenförmigen Neuronen und dendritischen Stacheln zu identifizieren, kann eine ballistische Etikettierungstechnik verwendet werden. Im vorliegenden Protokoll werden pyramidale Neuronen mit DilC18(3)-Farbstoff gekennzeichnet und mit neuronaler Rekonstruktionssoftware analysiert, um neuronale Morphologie und dendritische Stacheln zu bewerten. Zur Untersuchung der neuronalen Struktur werden dendritische Verzweigungsanalysen und Sholl-Analysen durchgeführt, die es den Forschern ermöglichen, Rückschlüsse auf die dendritische Verzweigungskomplexität bzw. die neuronale Arbor-Komplexität zu ziehen. Die Auswertung der dendritischen Stacheln erfolgt mit einem automatischen assistierten Klassifizierungsalgorithmus, der zur Rekonstruktionssoftware integriert ist und die Stacheln in vier Kategorien einreibt (d. h. dünn, Pilz, stumpf, filopodia). Darüber hinaus werden weitere drei Parameter (z. B. Länge, Kopfdurchmesser und Volumen) ausgewählt, um Veränderungen in der dendritischen Wirbelsäulenmorphologie zu bewerten. Um das Potenzial einer breiten Anwendung der ballistischen Etikettierungstechnik zu validieren, wurden pyramidale Neuronen aus der In-vitro-Zellkultur erfolgreich gekennzeichnet. Insgesamt ist die ballistische Etikettierungsmethode einzigartig und nützlich für die Visualisierung von Neuronen in verschiedenen Hirnregionen bei Ratten, was es Forschern ermöglicht, die möglichen Mechanismen zu klären, die neurokognitive Dysfunktion.

In Abbildung 2Awurden die typischen pyramidenförmigen Neuronen in der Hippocampusregion in den Hirnabschnitten der Ratte durch ballistische Etikettierungstechnologie identifiziert, die sich durch einen großen apikalen Dendrit und mehrere kleinere Basaldendriten um das Soma auszeichnete. Abbildung 2B zeigt das Neuron in der quantitativen Analysesoftware für die neuronale Rekonstruktion, nachdem das Soma nachgewiesen, dendritische Zweige und Stacheln nachgewies...

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Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture

Wir präsentieren ein Protokoll zur Kennzeichnung und Analyse pyramidaler Neuronen, das für die Bewertung potenzieller morphologischer Veränderungen in Neuronen und dendritischen Stacheln, die neurochemischen und verhaltensbedingten Anomalien zugrunde liegen können, entscheidend ist.

Ballistische Kennzeichnung von Pyramidal neurons in Gehirnscheiben und in der primären Zellkultur

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of ...

Dieses Protokoll ermöglicht es, mögliche morphologische Veränderungen in Neuronen und dendritischen Stacheln zu bewerten, die neurochemische und Verhaltensauffälligkeiten unterstreichen können. Es ist einzigartig und nützlich für die Visualisierung von Neuronen in verschiedenen Gehirnregionen bei Ratten, die in Kombination mit ausgeklügelter Rekonstruktionssoftware forschern ermöglicht, die möglichen Mechanismen zu klären, die neurokognitiven Dysfunktion zugrunde liegen. Beginnen Sie mit der Vorbereitung der PVP-Lösung nach Manuskriptanweisungen.Füllen Sie den Schlauch mit PVP und lassen Sie es für 20 Minuten. Und vertreiben Sie es durch das andere Ende mit einer 10-Milliliter-Spritze. Kombinieren Sie 170 Milligramm Wolfram-Mikroträger-Perlen mit 250 Mikroliter Methylenchlorid.Dann gründlich wirbeln die Suspension. Als nächstes fügen Sie 6 Milligramm lipophilen DilC18(3)Farbstoff zu 300 Mikroliter Methylenchlorid und Wirbel hinzu. Pipetten 250 Mikroliter der Wolfram-Perlen-Suspension auf einem Glasschlitten.Warten Sie, bis die Suspension lufttrocken ist, und fügen Sie 300 Mikroliter der Farbstofflösung hinzu. Nach dem Trocknen verwenden Sie ein Rasiermesser, um die Mischung in zwei 1,5 Milliliter Zentrifugenrohre aufzuteilen und die Rohre mit Wasser zu füllen. Beschallen Sie die Mischung in einem Wasserbad, bis sie homogen ist.Sicherstellen, dass die Schallspitze direkt auf den Rohren liegt. Kombinieren Sie die beiden Mischungen in einem 15 Milliliter konischen Rohr. Und für weitere drei Minuten beschallen, um sicherzustellen, dass keine großen Klumpen von Farbstoff beschichteten Perlen bleiben.Nach der Beschallung die Mischung mit einer 10-Milliliter-Spritze in den PVP-beschichteten Schlauch ziehen. Und füttern Sie die Schläuche in die Aufbereitungsstation. Drehen Sie die Schläuche für eine Minute.Entfernen Sie das gesamte Wasser vorsichtig mit einer Spritze. Schalten Sie das Stickstoffgas ein und stellen Sie den Stickstoffstrom auf etwa 0,5 Liter pro Minute ein. Drehen Sie die Schläuche in der Aufbereitungsstation und trocknen Sie sie 30 Minuten lang mit Stickstoff.Entfernen Sie die Schläuche von der Station und schneiden Sie sie mit einem Schlauchschneider in 13-Millimeter-Segmente. Stellen Sie sicher, dass die Ratte nicht auf schädliche Reize reagiert und Reflexe fehlen. Dann sichern Sie es in der Supine-Position.Machen Sie einen Schnitt entlang der brustbrusten Mittellinie. Trennen Sie das Zwerchfell und öffnen Sie die Brust mit einer Schere. Dann legen Sie eine 20 Gauge 25 Millimeter Nadel in den linken Ventrikel.Schneiden Sie sofort das rechte Atrium mit der Schere und durchdringen Sie 15 Milliliter 100 Millimolar PBS mit einem Durchfluss von 5 Millimetern pro Minute. Dann durchdringen Sie 100 Milliliter 4%PFA gepuffert in PBS. Nach der Perfusion, entfernen Sie das gesamte Rattenhirn.Und postfix es mit 4%PFA für 10 Minuten. Verwenden Sie eine Ratten-Gehirnmatrix, um 500 Mikrometer dicken koronalen Abschnitt zu schneiden. Machen Sie einen Faustschnitt und halten Sie die Klinge an Ort und Stelle.Dann machen Sie einen zweiten Schnitt mit einer zweiten Klinge und vertikal entfernen Sie die erste Klinge, halten Sie das Gewebe auf der Klingenoberfläche. Legen Sie die Gehirnscheiben in die 24-Well-Platte mit 1 Milliliter PBS in jedem Brunnen. Und wiederholen Sie den Vorgang, bis alle Scheiben geschnitten wurden.Entfernen Sie PBS von jedem Zielbrunnen. Den Knorpel mit einem Stück Dil/Wolfram-Schläuche nieren und in den Applikator legen. Legen Sie ein Stück Filterpapier zwischen die beiden Netzsiebe.Und schließen Sie den Applikator an den Heliumschlauch an. Passen Sie dann den Ausgangsdruck von Helium auf 90 Pfund pro Quadratzoll an. Platzieren Sie den Applikator vertikal in der Mitte des Zielbrunnens 1,5 Zentimeter zwischen der Probe und dem Netzbildschirm.Dann feuern Sie die Dil/Wolfram Rohre. Den Knorpel mit dem nächsten Schlauch beladen und die Perlen kontinuierlich aus den Schläuchen auf die restlichen Scheiben abfeuern. Füllen Sie die 24-Well-Platte mit 100 Millimolar PBS.Und waschen Sie die Scheiben dreimal mit 500 Mikroliter frisches PBS. Stellen Sie sicher, dass die Scheiben während des Waschens nicht umkippen. Wenn Sie fertig sind, fügen Sie 500 Mikroliter frisches PBS in die Scheiben.Und bebrüten sie drei Stunden bei vier Grad Celsius im Dunkeln. Nach der Inkubation, verwenden Sie eine feine Bürste, um die Gehirnscheiben auf Glasrutschen zu übertragen. Und sofort einen Milliliter Antifade-Montagemedium zu jedem Abschnitt hinzufügen.Legen Sie einen 22 mal 15 Millimeter großen Deckel über die Abschnitte und trocknen Sie die Dias im Dunkeln. Schalten Sie das konfokale Mikroskopsystem ein und wechseln Sie zu einem 60X-Objektiv. Passen Sie die Bildeinstellungen entsprechend den Anweisungen des Manuskripts an.Und erhalten Z-Stack-Bilder für den gezielten Neuronentyp basierend auf Gehirnregionsgrenzen und morphologischen Eigenschaften von Neuronen. Isolieren Sie primäre kortikale Neuron von F344/N Ratten am ersten Tag der Geburt und kulturen Sie sie in einer 35 Millimeter Glasbodenschale für eine Woche. Erfrischende Hälfte des Mediums am dritten Tag nach der Isolation.Waschen Sie die Schale zweimal mit 1 Milliliter 100 Millimolar PBS. Und fixieren Sie die Zellen mit 4%PFA für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Die Zellen werden wie zuvor beschrieben als ballistisch gekennzeichnet.Und waschen Sie sie noch dreimal mit 1 Milliliter PBS. Fügen Sie 500 Mikroliter PBS zu den Zellen hinzu und inkubieren Sie sie für drei Stunden bei vier Grad Celsius im Dunkeln. Dann fügen Sie 200 Mikroliter Antifade Montagemedium.Und erhalten Z-Stack-Bilder für jedes Zielneuron. Typische pyramidale Neuronen in der Hippocampusregion in den Hirnabschnitten der Ratte wurden mit ballistischer Etikettierungstechnologie identifiziert, die durch einen großen apikalen Dendrit und mehrere kleinere Basaldendriten um das Soma gekennzeichnet ist. Neuronale Rekonstruktion quantitative Analyse-Software wurde verwendet, um dendritische Zweige zu verfolgen und Stacheln zu erkennen.Anschließend wurde die Software verwendet, um die dendritische Verzweigungskomplexität und neuronale Arbor-Komplexität zu bewerten. Morphologische Veränderungen der dendritischen Stacheln wurden anhand von Länge, Volumen und Kopfdurchmesser bewertet. Dann wurden Stacheln in dünne, stumpfe und Pilzdornen klassifiziert.Und die relative Häufigkeit der Anzahl der Stacheln zwischen den einzelnen Radius wurde untersucht. Darüber hinaus wurde die ballistische Etikettierungstechnik auf einem primären pyramidenförmigen Neuron in der Zellkultur validiert. Pyramidenneuronen wurden anhand der Dreiecksform des Soma und des großen apikalen Dendriten identifiziert.Dann wurde neuronale Rekonstruktionssoftware verwendet, um die Verteilung von dünnen dendritischen Stacheln und dendritischen Wirbelsäulenlänge zu analysieren. Beim Versuch dieses Protokolls ist es wichtig, große Klumpen oder Cluster von ballistischen Farbstoff beschichtet Enwolframperlen Beginnen der Vorbereitung zu vermeiden. Klumpen würden es nicht erlauben, einzelne Neuronen zu unterscheiden.In Kombination mit neuronaler Rekonstruktionssoftware ermöglicht uns diese Methode, neuronale und dendritische Wirbelsäulenmorphologie in hippocampalen Pyramidenneuronen zu untersuchen. Neuronale Rekonstruktionssoftware verwenden einen Algorithmus, um eine automatische assistierte Klassifizierung der dendritischen Stacheln zu bieten. Die Quantifizierung mehrerer neuronaler Parameter bietet die Möglichkeit, den Mechanismus, der der neuronalen kognitiven Dysfunktion zugrunde liegt, besser zu verstehen.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Dissection und Kultur kommissuralen Nervenzellen aus embryonalen Rückenmark

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Forschung

Neurowissenschaften

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

DiOLISTIC Labeling von Neuronen aus Nager und nicht-menschlichen Primaten Hirnschnitten

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde Fluoreszenzmarkierung Ermöglicht Gezielte Extracellular Einzel-Einheit Aufnahme von identifizierten Neuronen<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Imaging Calcium Antworten in GFP-markierten Neuronen des Hypothalamus Maus Hirnschnitten

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

Voltage-sensitive Dye Aufnahme von Axonen, Dendriten und dendritischen Spines einzelner Neuronen in Hirnschnitten

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Dual-Elektrophysiologische Recordings synaptisch-evozierte astrogliale und neuronale Antworten in Acute Hippocampusschnitte

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Primärkultur von Maus dopaminergen Neuronen

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Gepaart ganze Zelle Recordings in Organotypische Hippocampus

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Isolation, Kultur und langfristige Wartung von Primär mesencephalen dopaminergen Neuronen aus embryonalen Nagetier Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-Cell-Patch-Clamp-Aufnahmen in Hirnschnitten

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...