Name: ballistic labeling of pyramidal neurons in brain slices and in primary cell culture
Uploaded: 2020-04-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture at JoVE.com

עבודה זו ממומנת על ידי NIH מענקים HD043680, MH106392, DA013137, ו NS100624.

כל הפרוטוקולים בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים באוניברסיטת דרום קרוליינה (מספר הביטחון הפדרלי: D16-00028).
1. הכנת אבובים דיאני/טונגסטן חרוז
<ol><li>לפזר 100 מ"ג של polyvinylפירוסיים (PVP) עם 10 מ ל של ddH2O. מערבולת פתרון PVP בקלילות.</li>
	<li>ממלאים את אבובים עם פתרון PVP ...

<ol>
	<li>Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+"DiOlistic"+labeling+of+the+nervous+system+using+lipophilic+dye+combinations.">Multicolor "DiOlistic" labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations.</a> Neuron. 27, 219-225 (2000).</li><li>Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, R. O., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ballistic+delivery+of+dyes+for+structural+and+functional+studies+of+the+nervous+system.">Ballistic delivery of dyes for structural and functional studies of the nervous system.</a> Cold Spring Harbor Protocol. 2009 (4), 5202 (2009).</li><li>Seabold, G. K., Daunais, J. B., Rau, A., Grant, K. A., Alvarez, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DiOLISTIC+labeling+of+neurons+from+rodent+and+non-human+primate+brain+slices.">DiOLISTIC labeling of neurons from rodent and non-human primate brain slices.</a> Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).</li><li>Spacek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+the+Golgi+method:+a+time-lapse+study+of+the+early+stages+of+impregnation+in+single+sections.">Dynamics of the Golgi method: a time-lapse study of the early stages of impregnation in single sections.</a> Journal of Neurocytology. 18 (1), 27-38 (1989).</li><li>McLaurin, K. A., Li, H., Booze, R. M., Mactutus, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+Timing:+NeuroHIV+Progression+in+the+Post-cART+Era.">Disruption of Timing: NeuroHIV Progression in the Post-cART Era.</a> Science Reports. 9 (1), 827 (2019).</li><li>Spruston, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyramidal+neurons:+dendritic+structure+and+synaptic+integration.">Pyramidal neurons: dendritic structure and synaptic integration.</a> Nature Reviews Neurosciences. 9 (3), 206-221 (2008).</li><li>Megias, M., Emri, Z., Freund, T. F., Gulyas, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+number+and+distribution+of+inhibitory+and+excitatory+synapses+on+hippocampal+CA1+pyramidal+cells.">Total number and distribution of inhibitory and excitatory synapses on hippocampal CA1 pyramidal cells.</a> Neuroscience. 102, 527-540 (2001).</li><li>Peters, A., Kaiserman-Abramof, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+small+pyramidal+neuron+of+the+rat+cerebral+cortex.+The+perikaryon,+dendrites+and+spines.">The small pyramidal neuron of the rat cerebral cortex. The perikaryon, dendrites and spines.</a> American Journal of Anatomy. 127, 321-355 (1970).</li><li>Harris, K. M., Sultan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+the+number,+location,+and+size+of+synaptic+vesicles+provides+an+anatomical+basis+for+the+nonuniform+probability+of+release+at+hippocampal+CA1+synapses.">Variation in the number, location, and size of synaptic vesicles provides an anatomical basis for the nonuniform probability of release at hippocampal CA1 synapses.</a> Neuropharmacology. 34, 1387-1395 (1995).</li><li>Sorra, K. E., Fiala, J. C., Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+assessment+of+the+involvement+of+perforations,+spinules,+and+spine+branching+in+hippocampal+synapse+formation.">Critical assessment of the involvement of perforations, spinules, and spine branching in hippocampal synapse formation.</a> Journal of Comparative Neurology. 398, 225-240 (1998).</li><li>Mancuso, J. J., Chen, Y., Li, X., Xue, Z., Wong, S. T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+dendritic+spine+detection:+from+Golgi+to+high-resolution+optical+imaging.">Methods of dendritic spine detection: from Golgi to high-resolution optical imaging.</a> Neuroscience. 251, 129-140 (2012).</li><li>McLaurin, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+connectivity+in+medium+spiny+neurons+of+the+nucleus+accumbens:+A+sex-dependent+mechanism+underlying+apathy+in+the+HIV-1+transgenic+rat.">Synaptic connectivity in medium spiny neurons of the nucleus accumbens: A sex-dependent mechanism underlying apathy in the HIV-1 transgenic rat.</a> Frontiers in Behavior Neurosciences. 12, 285 (2018).</li><li>Roscoe, R. F., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+transgenic+female+rat:+synaptodendritic+alterations+of+medium+spiny+neurons+in+the+nucleus+accumbens.">HIV-1 transgenic female rat: synaptodendritic alterations of medium spiny neurons in the nucleus accumbens.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 9 (5), 642-653 (2014).</li><li>Li, H., Aksenova, M., Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Booze, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Filamentous+Actin+(F-actin)+Puncta+in+Rat+Cortical+Neurons.">Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (108), e53697 (2016).</li><li>Rodriguez, A., Ehlenberger, D. B., Dickstein, D. L., Hof, P. R., Wearne, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+Three-Dimensional+Detection+and+Shape+Classification+of+Dendritic+Spines+from+Fluorescence+Microscopy+Images.">Automated Three-Dimensional Detection and Shape Classification of Dendritic Spines from Fluorescence Microscopy Images.</a> PLoS ONE. 3 (10), 1371 (2008).</li></ol>

בפרוטוקול זה, אנו מתארים טכניקת תיוג רב-תכליתי עבור נוירונים ממוח החולדה ואלה שגדלו בתוך מבחנה. יתרה מזאת, אנו מדווחים על המתודולוגיה לניצול תוכנת שחזור עצבית ושחזור עצבי כמותי להערכת המבנה העצבי והשדרה הדנדלית. הערכה של מורפולוגיה עצבית ושדרה דנדריטי מספק הזדמנות לקבוע שינויים במורכבות...

בשנת 2000, גן ואח ' תיאר טכניקת תיוג מהירה לנוירונים בודדים ולגליה במערכת העצבים שבשילוב צבעי ליפוליים שונים, ומאפשר תיוג סימולטני של תאי מוח רבים בצבעים שונים1,2. לאחרונה, טכניקת תיוג בליסטי תוארה על ידי סיאולד ואח '3 שהוצגו צבעי פלורסנט (דיל) לתוך הנוירונים של פרוסות המוח. טכניקה מכתימה רב-תכליתי, תיוג בליסטי הוא מוערך על יכולתה להיות מנוצל במינים רבים בעלי חיים ולאורך מגוון רחב של גילאים. יתר על כן, זה יכול להיות משולב עם כתמים חיסוני לזהות אוכלוסיות משנה של תאי המוח3. לעומת טכניקות מסורתיות (למשל, Golgi-קוקס כסף הספגה, microinjection)4, תיוג בליסטי מעניקה הזדמנות להבדיל באופן ברור יותר מאפיינים מורפולוגיים, כולל השדרה הדנדריטי, תכונה קריטית לציור מסקנות על מורכבות עצבית וקישוריות סינפטית5.
מרגש הנוירונים מתאפיין באחד, דנדריטים הרשמי הגדול, מספר דנדטים בסיס קצר, ואלפי שובך הדנדריטים6. הנוירונים האלה מצויים באזורי המוח המרובים הקשורים לעיבוד קוגניטיבי גבוה יותר, כולל קליפת ראש הדור הקדמי (טוראי ראשון) ו ההיפוקמפוס. בטוראי הראשון, הנוירונים באמצע המבנה מתבוננים בשכבות II/III ושכבה V, כאשר כל אחד מהם מציג מורפולוגיה ייחודית. במיוחד, הנוירונים באמצע שכבה II/III של הטוראי הראשון יש הדנדריטים פסגה קצר יותר ופחות הסתעפות מאשר הנוירונים באמצע השכבה V6. בתוך ההיפוקמפוס, הנוירונים באמצע הפירמידה ממוקמים הן באזורים CA1 ו CA3, עם כל הצגת מורפולוגיות נפרדות. באופן ספציפי, הנוירונים באזור CA1 מוצג הדנדריטים הרשמי הייחודי יותר, עם הסתעפות המתרחשים רחוק יותר הסומה, ביחס לאזור CA36.
הדנדריטים הדנדריטי על הנוירונים באמצע הפירמידה הן הראשון ההיפוקמפוס הם האתר העיקרי של סינפסות מרגש7. מאפיינים מורפולוגיים של שתדלתיים דנדריטים, אשר מאופיינים באופן קלאסי לתוך שלוש קטגוריות ראשיות (כלומר, דק, קלוש, או פטריות8), היו קשורים בגודל של הרגש סינפסה9. השדרה הדק, המאופיינת בצוואר ארוך, דק, ראש בולבוסי קטן, וצפיפות הפוסט-סינפטית הקטנה יותר, אינם יציבים יותר ומפתחים התקשרויות חלשות יותר. עם זאת, שדרה פטריות, אשר יש ראש השדרה הדנדריטי גדול יותר, מוכרים ליצירת קשרים סינפטית חזקים יותר, אפקט כתוצאה מהגודל הגדול שלהם. בניגוד חד, שדרה שולי הוא נטול צוואר עמוד השדרה, המציגות יחס שווה ערך ראש וצוואר שווים8. בתוך ההיפוקמפוס, שדרה הסתעפות יכול להיות גם נצפתה, לפיה עמוד השדרה יש ראשים מרובים היוצאים מן הצוואר הדנדריטי זהה10. לכן, השינויים הורפולוגיים של הקוצים הדנדריטים יכולים לשקף פונקציונליות וקיבולת מבנית. יתר על כן, מחקרים הוכיחו כי הגודל והצורה של השדרה הדנדריטי מתייחס הפלסטיות הקונסטרוקטיבי שלהם, המוביל את הרעיון כי הקוצים הקטנים מעורבים בלמידה ובתשומת לב, בעוד שבעמודי השדרה הגדולים והיציבים יותר, מעורבים בתהליכים ארוכי טווח, כולל זיכרון11. בנוסף, הפצת הקוצים הדנדריטים לאורך הדנדריטים עשויה להיות קשורה לקישוריות סינפטית5,12.
לפיכך, הנייר המתודולוגי הנוכחי כולל שלוש מטרות: 1) הצגת הפרוטוקול שלנו עבור תיוג בליסטי, אשר כבר מנוצל עם שיעור הצלחה (כלומר, הנוירונים לפגוש קריטריונים הבחירה מתאים לניתוח) של 83.3%5,12,13 וברחבי מחוזות המוח מרובים (כלומר, טוראי ראשון, 2) להפגין את היכולת הגנריות של הטכניקה ואת יישומו לנוירונים שגדלו בתוך מבחנה; 3) פירוט המתודולוגיה הנמצאת בשימוש בתוכנת שחזור עצבית ומסקנות שניתן לשאוב מנתונים אלה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:868px;" width="869">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">20Gx25mm PrecisionGlide needle</td>
			<td style="width:263px;">BD</td>
			<td style="width:143px;">305175</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24-well cell culture plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">35 mm Glass Bottom Dishes</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-1.5-20-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Antibiotic-Antimycotic solution</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>30004CI</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">B-27 supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>50X</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Barrel liner</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Borax</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Boric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B0252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cartridge holder</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Confocal imaging software</td>
			<td style="width:263px;">Nikon</td>
			<td style="width:143px;">EZ-C1</td>
			<td>version 3.81b</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:263px;">Nikon</td>
			<td style="width:143px;">TE-2000E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cover glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>637-137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DilC18(3)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM/F12 medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10565-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dumont #5 Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dumont #7 Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">F344 rat</td>
			<td style="width:263px;">(Harlan Laboratories, Indianapolis, IN)</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glucose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>101174Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GlutaMax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HBSS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4641</td>
			<td>10X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Helios diffusion screens</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Helios gene gun kit</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Helios gene gun system</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Helium hose assembly</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Iris Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>15914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Iris Scissors</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methylene chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D150-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Neurobasal medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Neurolucida 360 software</td>
			<td style="width:263px;">mbf bioscience</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td>dendritic spine analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyvinylpyrrolidone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>5295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ProLong Gold antifade reagent</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P36930</td>
			<td>mounting medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat brain matrix, 300 - 600g, Coronal, 0.5mm</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>15047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sevoflurane</td>
			<td>Merritt Veterinary Supply</td>
			<td>347075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SuperFrost Plus Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-154%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe kit</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tefzel tubing</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tubing cutter</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tubing Prep station</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tungsten M-25 Microcarrier 1.7 &#181;m</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vannas Scissors</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500086</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ballistic labeling of pyramidal neurons in brain slices and in primary cell culture

דווח כי גודל וצורה של השדרה הדנדריטים קשורה הפלסטיות הקונסטרוקטיבי שלהם. כדי לזהות את המבנה המיורפולוגי של הנוירונים ושידולי הדנדריטים, ניתן לעשות שימוש בטכניקת תיוג בליסטיים. בפרוטוקול הנוכחי, הנוירונים העצביים מתויגים עם DilC18 (3) לצבוע וניתח באמצעות תוכנת שחזור עצבי להעריך מורפולוגיה עצבית ושפה דנדריטי. כדי לחקור את המבנה העצבי, ניתוח הסתעפות הדנדריטים וניתוח שולבה מבוצעים, ומאפשר לחוקרים לצייר מסקנות על מורכבות הסתעפות הדנדריטים והמורכבות העצבית העצביים, בהתאמה. הערכה של השדרה הדנדריטי מתבצעת באמצעות הסיווג האוטומטי באמצעות אלגוריתם מיון אינטגרלי לתוכנה שחזור, אשר מסווג את הקוצים לתוך ארבע קטגוריות (כלומר, דק, פטריות, שמנה, שמנת, פילפיאה). יתר על כן, שלושה פרמטרים נוספים (כלומר, אורך, ראש קוטר, ונפח) נבחרים גם להעריך שינויים במבנה השדרה הדנדריטי. כדי לאמת את הפוטנציאל של היישום הרחב של טכניקת תיוג בליסטי, הנוירונים בצורה מרחבית מתוך תרבות תא מבחנה בהצלחה מתויג. בסך הכל, שיטת התיוג הבליסטי היא ייחודית ושימושית להמחיש נוירונים באזורי מוח שונים בחולדות, אשר בשילוב עם תוכנת שחזור מתוחכמת, מאפשר לחוקרים להבהיר את המנגנונים האפשריים המשמשים כבסיס תפקוד נוירוקוגניטיבי.

באיור 2A, את הנוירונים טיפוסי הפירמידה באזור ההיפוקמאל בסעיפים המוח חולדה זוהו על ידי הטכנולוגיה תיוג בליסטי, המאופיינת על ידי אחד גדול הדנדריטים הדנדריטים ומספר דנדטים בסיס קטן יותר סביב סומה. איור 2B מראה את העצב בתוך התוכנה ניתוח כמותי שחזור נוירואליות ל?...

Watch this Scientific Journal Video about Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture at JoVE.com

Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture

אנו מציגים פרוטוקול כדי לתייג ולנתח נוירונים באמצע, אשר קריטי להערכת שינויים מורפולוגיים פוטנציאליים בנוירונים ובקוצים הדנדריטים שעלולים להיות מומים נוירוכימיקלים והתנהגותיים.

בליסטי לתיוג של הנוירונים בתוך המוח בפרוסות ובתרבות התא הראשוני

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of ...

פרוטוקול זה מאפשר להעריך שינויים מורפולוגיים פוטנציאליים בנוירונים ובעמודי שדרה דנדריטיים שעשויים לה מדגישים חריגות נוירוכימיות והתנהגותיות. זה ייחודי ושימושי עבור לדמיין נוירונים באזורים שונים במוח בחולדות, אשר בשילוב עם תוכנת שחזור מתוחכמת מאפשר לחוקרים להבהיר את המנגנונים האפשריים שבבסיס תפקוד נוירוקוגניטיבי. התחילו בהכנת פתרון PVP בהתאם לכיווני כתב היד.מלאו את הצינור ב-PVP והשאירו אותו למשך 20 דקות. ולגרש אותו דרך הקצה השני עם מזרק 10 מיליליטר. שלבו 170 מיליגרם של גם גם 250 מיקרוליטרים של מתילן כלוריד.ואז ביסודיות מערבולת ההשעיה. לאחר מכן, מוסיפים 6 מיליגרם של צבע DilC18(3) ליפופילי ל-300 מיקרוליטרים של מתילן כלוריד ומערבולת. Pipet 250 מיקרוליטרים של מתלי חרוז טונגסטן על מגלשת זכוכית.המתינו עד שההשעיה תיייבש באוויר ותוסיפו 300 מיקרוליטרים של תותר הצבע. לאחר התייבשות, להשתמש סכין גילוח כדי לפצל את התערובת לשני צינורות צנטריפוגה 1.5 מיליליטר ולמלא את הצינורות במים. sonicate את התערובת באמבט מים עד הומוגני.מוודא כי קצה sonicator טמון ישירות על הצינורות. מערבבים את שתי תערובות בצינור חרוט 15 מיליליטר. ו sonicate במשך שלוש דקות נוספות, לוודא כי לא גושים גדולים של חרוזים מצופים צבע להישאר.לאחר sonication, לצייר את התערובת לתוך צינורות מצופה PVP עם מזרק 10 מיליליטר. ולהאכיל את הצינורות לתחנת ההכנה. סובב את הצינור למשך דקה אחת.בזהירות להסיר את כל המים באמצעות מזרק. מפעילים את גז החנקן ומתאימים את זרימת החנקן לכ-0.5 ליטר לדקה. לסובב את הצינור בתחנת ההכנה ולייבש אותו עם חנקן במשך 30 דקות.מוציאים את הצינור מהתחנה וחותכים אותו למקטעים של 13 מ"מ עם חותך צינורות. ודא כי החולדה אינה מגיבה לגירויים מזיקים ורפלקסים נעדרים. אז תאבטח את זה בתמקם ה"סופין".בצע חתך לאורך קו האמצע של בית החזה. מפרידים את הסרעפת ופתיחת החזה במספריים. ואז להכניס מחט 20 מד 25 מילימטר לתוך החדר השמאלי.מיד לחתוך את ה אטריום הנכון עם מספריים וללעוס 15 מיליליטר של 100 מילימטר PBS עם קצב זרימה של 5 מילימטרים לדקה. לאחר מכן לבלבל 100 מיליליטר של 4%PFA במאגר PBS. לאחר תדלוק, להסיר את המוח החולדה כולה.ולהדביק אותו עם 4%PFA במשך 10 דקות. השתמש במטריצת מוח עכברוש לחתוך 500 מיקרומטר עבה קטע coronal. לעשות חתך אגרוף ולשמור את הלהב במקום.לאחר מכן בצע חתך שני עם להב שני ולהסיר אנכית את הלהב הראשון, שמירה על הרקמה על פני הלהב. מניחים את פרוסות המוח בצלחת 24 באר עם 1 מיליליטר של PBS בכל באר. ולחזור על התהליך עד שכל הפרוסות נחתכו.הסר PBS מכל באר ממוקדת. טען את הסחוס עם חתיכת צינורות דיל / טונגסטן והכנס אותו למוליך. שים פיסת נייר סינון בין שני מסכי רשת שינוי.ולחבר את המוליך לצינור ההליום. ואז להתאים את לחץ הפלט של הליום ל 90 פאונד לאינץ 'מרובע. הנח את המוליך אנכית במרכז הבאר הממוקדת באורך 1.5 ס"מ בין המדגם למסך רשת שינוי.ואז לירות צינורות דיל / טונגסטן. לטעון את הסחוס עם הצינור הבא ברציפות לירות את חרוזים מן הצינורות על הפרוסות הנותרות. מלאו את צלחת ה-24 בארות ב-100 מילימולרים PBS.ולשטוף את הפרוסות שלוש פעמים עם 500 microliters של PBS טרי. ודא כי הפרוסות לא להתהפך במהלך לשטוף. בסיום, הוסיפו 500 מיקרוליטר של PBS טרי לפרוסות.ותגרה אותם במשך שלוש שעות בארבע מעלות צלזיוס בחושך. לאחר הדגירה, השתמש במברשת דקה כדי להעביר את פרוסות המוח לשקופיות זכוכית. ומיד להוסיף מיליליטר אחד של מדיום הרכבה antifade לכל קטע.מניחים כיסוי של 22 על 15 מילימטר מעל החלקים ומייבשים את השקופיות בחושך. הפעל את מערכת המיקרוסקופ הקונפוקל ולעבור למטרה 60X. התאם את הגדרות ההדמיה בהתאם לכיווני כתב היד.ולקבל תמונות Z-stack עבור סוג נוירון ממוקד מבוסס על גבולות אזור המוח ומאפיינים מורפולוגיים של נוירונים. לבודד את הנוירון קליפת המוח העיקרי מחולדות F344/N ביום שלאחר הלידה אחד ולתרבת אותם בצלחת תחתונה זכוכית 35 מילימטר במשך שבוע אחד. מחצית מהמדיום מרענן ביום השלישי לאחר הבידוד.לשטוף את המנה פעמיים עם 1 מיליליטר של 100 מילימולר PBS. ולתקן את התאים עם 4% PFA במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. תייג את התאים בצורה בליסטית כפי שתואר קודם לכן.ולשטוף אותם שלוש פעמים נוספות עם 1 מיליליטר של PBS. מוסיפים 500 מיקרוליטרים של PBS לתאים ו דגירה אותם במשך שלוש שעות בארבע מעלות צלזיוס בחושך. לאחר מכן הוסיפו 200 מיקרוליטרים של מדיום הרכבה נגד חיטוי.ולקבל תמונות מחסנית Z עבור כל נוירון ממוקד. נוירונים פירמידליים טיפוסיים באזור ההיפוקמפוס בחלקי המוח של החולדות זוהו עם טכנולוגיית תיוג בליסטי המאופיינת בדנדריט אפית אחד גדול וכמה דנדריטים בסיסיים קטנים יותר סביב סומה. תוכנת ניתוח כמותי שחזור עצבי שימשה להתחקות אחר ענפים דנדריטיים ולזהות קוצים.לאחר מכן, התוכנה שימשה להערכת מורכבות הסתעפות דנדריטית ומורכבות ארבור עצבית. שינויים מורפולוגיים בקוצים דנדריטיים הוערכו באמצעות אורך, נפח וקוטר ראש. ואז קוצים סווגו לקוצים דקים, דקים ופטריות.והתדירות היחסית של מספר הקוצים בין כל רדיוס נבדקה. יתר על כן, טכניקת התיוג הבליסטי אומתה על נוירון פירמידלי ראשוני בתרבות התאים. נוירונים פירמידליים זוהו בהתבסס על צורת המשולש של הומה ודנדריט אפי גדול.לאחר מכן נעשה שימוש בתוכנת שחזור עצבי כדי לנתח את התפלגותם של קוצים דנדריטיים דקים ואורך עמוד שדרה דנדריטי. בעת ניסיון פרוטוקול זה, חשוב להימנע גושים גדולים או אשכולות של חרוזים טונגסטן מצופה צבע בליסטי החל הכנה. גושים לא יאפשרו לנוירונים בודדים להיות מכובדים.בשילוב עם תוכנת שחזור עצבי שיטה זו מאפשרת לנו לבחון מורפולוגיה של עמוד השדרה העצבי והדנדריטי בנוירונים פירמידליים בהיפוקמפוס. תוכנת שחזור עצבי להשתמש באלגוריתם להציע סיווג בסיוע אוטומטי של קוצים דנדריטיים. כימות של פרמטרים עצביים מרובים מציע הזדמנות להבין טוב יותר את המנגנון שבבסיס תפקוד קוגניטיבי עצבי.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Dissection והתרבות של נוירונים Commissural מחוט השדרה עובריים

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

תיוג DiOLISTIC של הנוירונים מפני מכרסמים שאינן פרוסות המוח האנושי הפרימאטים

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

תיוג של פלורסנט מדרדר מאפשר להקלטה ממוקדת חד תאית מיחידת נוירונים שזוהו<em&gt; בvivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

תגובות סידן הדמיה בנוירונים GFP-tagged של פרוסות מוח עכבר ההיפותלמוס

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

הקלטת דיי מתח רגישה מהאקסונים, הדנדריטים וקוצים הדנדריטים של נוירונים בודדים בפרוסות מוח

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

קלטות אלקטרו כפולות של תגובות Astroglial ועצביות עוררו-synaptically בפרוסות ביפוקמפוס חריפות

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

יסודי תרבות של עכבר דופאמין נוירונים

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

הקלטות תא כל לזווג בפרוסות בהיפוקמפוס Organotypic

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

בידוד, תרבות והטווח ארוך תחזוקה של יסודיים mesencephalic דופאמין נוירונים ממוח עוברי מכרסם

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

הקלטות תיקון מהדק כל תא פרוסות המוח

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...