Name: ballistic labeling of pyramidal neurons in brain slices and in primary cell culture
Uploaded: 2020-04-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture at JoVE.com

इस काम को एनआईएच ग्रांट एचडी043680, MH106392, DA013137 और NS100624 द्वारा वित्त पोषित किया गया था।

सभी पशु प्रोटोकॉल की समीक्षा की और दक्षिण कैरोलिना विश्वविद्यालय में पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया (संघीय आश्वासन संख्या: D16-00028) ।
1. DiI/टंगस्टन बीड ट्यूबिंग की तैयारी
<ol><li>ड?...

<ol>
	<li>Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+"DiOlistic"+labeling+of+the+nervous+system+using+lipophilic+dye+combinations.">Multicolor "DiOlistic" labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations.</a> Neuron. 27, 219-225 (2000).</li><li>Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, R. O., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ballistic+delivery+of+dyes+for+structural+and+functional+studies+of+the+nervous+system.">Ballistic delivery of dyes for structural and functional studies of the nervous system.</a> Cold Spring Harbor Protocol. 2009 (4), 5202 (2009).</li><li>Seabold, G. K., Daunais, J. B., Rau, A., Grant, K. A., Alvarez, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DiOLISTIC+labeling+of+neurons+from+rodent+and+non-human+primate+brain+slices.">DiOLISTIC labeling of neurons from rodent and non-human primate brain slices.</a> Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).</li><li>Spacek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+the+Golgi+method:+a+time-lapse+study+of+the+early+stages+of+impregnation+in+single+sections.">Dynamics of the Golgi method: a time-lapse study of the early stages of impregnation in single sections.</a> Journal of Neurocytology. 18 (1), 27-38 (1989).</li><li>McLaurin, K. A., Li, H., Booze, R. M., Mactutus, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+Timing:+NeuroHIV+Progression+in+the+Post-cART+Era.">Disruption of Timing: NeuroHIV Progression in the Post-cART Era.</a> Science Reports. 9 (1), 827 (2019).</li><li>Spruston, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyramidal+neurons:+dendritic+structure+and+synaptic+integration.">Pyramidal neurons: dendritic structure and synaptic integration.</a> Nature Reviews Neurosciences. 9 (3), 206-221 (2008).</li><li>Megias, M., Emri, Z., Freund, T. F., Gulyas, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+number+and+distribution+of+inhibitory+and+excitatory+synapses+on+hippocampal+CA1+pyramidal+cells.">Total number and distribution of inhibitory and excitatory synapses on hippocampal CA1 pyramidal cells.</a> Neuroscience. 102, 527-540 (2001).</li><li>Peters, A., Kaiserman-Abramof, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+small+pyramidal+neuron+of+the+rat+cerebral+cortex.+The+perikaryon,+dendrites+and+spines.">The small pyramidal neuron of the rat cerebral cortex. The perikaryon, dendrites and spines.</a> American Journal of Anatomy. 127, 321-355 (1970).</li><li>Harris, K. M., Sultan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+the+number,+location,+and+size+of+synaptic+vesicles+provides+an+anatomical+basis+for+the+nonuniform+probability+of+release+at+hippocampal+CA1+synapses.">Variation in the number, location, and size of synaptic vesicles provides an anatomical basis for the nonuniform probability of release at hippocampal CA1 synapses.</a> Neuropharmacology. 34, 1387-1395 (1995).</li><li>Sorra, K. E., Fiala, J. C., Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+assessment+of+the+involvement+of+perforations,+spinules,+and+spine+branching+in+hippocampal+synapse+formation.">Critical assessment of the involvement of perforations, spinules, and spine branching in hippocampal synapse formation.</a> Journal of Comparative Neurology. 398, 225-240 (1998).</li><li>Mancuso, J. J., Chen, Y., Li, X., Xue, Z., Wong, S. T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+dendritic+spine+detection:+from+Golgi+to+high-resolution+optical+imaging.">Methods of dendritic spine detection: from Golgi to high-resolution optical imaging.</a> Neuroscience. 251, 129-140 (2012).</li><li>McLaurin, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+connectivity+in+medium+spiny+neurons+of+the+nucleus+accumbens:+A+sex-dependent+mechanism+underlying+apathy+in+the+HIV-1+transgenic+rat.">Synaptic connectivity in medium spiny neurons of the nucleus accumbens: A sex-dependent mechanism underlying apathy in the HIV-1 transgenic rat.</a> Frontiers in Behavior Neurosciences. 12, 285 (2018).</li><li>Roscoe, R. F., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+transgenic+female+rat:+synaptodendritic+alterations+of+medium+spiny+neurons+in+the+nucleus+accumbens.">HIV-1 transgenic female rat: synaptodendritic alterations of medium spiny neurons in the nucleus accumbens.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 9 (5), 642-653 (2014).</li><li>Li, H., Aksenova, M., Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Booze, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Filamentous+Actin+(F-actin)+Puncta+in+Rat+Cortical+Neurons.">Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (108), e53697 (2016).</li><li>Rodriguez, A., Ehlenberger, D. B., Dickstein, D. L., Hof, P. R., Wearne, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+Three-Dimensional+Detection+and+Shape+Classification+of+Dendritic+Spines+from+Fluorescence+Microscopy+Images.">Automated Three-Dimensional Detection and Shape Classification of Dendritic Spines from Fluorescence Microscopy Images.</a> PLoS ONE. 3 (10), 1371 (2008).</li></ol>

इस प्रोटोकॉल में, हम चूहे के मस्तिष्क और विट्रो में उगाए गए दोनों न्यूरॉन्स के लिए एक बहुमुखी लेबलिंग तकनीक का वर्णन करते हैं। इसके अलावा, हम न्यूरोनल आकृति विज्ञान और डेंड्रिटिक कताई का आकलन करने के ल?...

2000 में, गन एट अल तंत्रिका तंत्र में व्यक्तिगत न्यूरॉन्स और ग्लिया के लिए एक रैपिड लेबलिंग तकनीक का वर्णन किया गया है जो विभिन्न लिपोफिलिक रंगों को संयुक्त करता है, जिससे विभिन्न रंगों के साथ कई मस्तिष्क कोशिकाओं की एक साथ लेबलिंगकीअनुमति1,2। हाल ही में, एक बैलिस्टिक लेबलिंग तकनीक Seabold एट अल3 द्वारा वर्णित किया गया था कि मस्तिष्क स्लाइस के न्यूरॉन्स में फ्लोरोसेंट रंगों (दिल) शुरू की । एक बहुमुखी धुंधला तकनीक, बैलिस्टिक लेबलिंग कई पशु प्रजातियों में और उम्र की एक विस्तृत श्रृंखला में उपयोग करने की क्षमता के लिए सराहना की है । इसके अलावा, इसे मस्तिष्क कोशिकाओंकीउपआबादी 3 की पहचान करने के लिए इम्यूनोस्टेनिंग के साथ जोड़ा जा सकता है। पारंपरिक तकनीकों (उदाहरण के लिए, गोलगी-कॉक्स सिल्वर इम्प्रोगम, माइक्रोइंजेक्शन)4की तुलना में, बैलिस्टिक लेबलिंग में डेंड्रिटिक कताई सहित रूपात्मक विशेषताओं को अधिक स्पष्ट रूप से अलग करने का अवसर मिलता है, एक विशेषता जो न्यूरोनल जटिलता और सिनैप्टिक कनेक्टिविटी5के बारे में अनुमान लगाने के लिए महत्वपूर्ण है।
एक्सेक्टेरी पिरामिड न्यूरॉन्स एक एकल, बड़े एपिकल डेंडराइट, कई छोटे बेसल डेन्डराइट्स, और हजारों डेन्ड्रिटिक कताई6की विशेषता है। पिरामिड न्यूरॉन्स उच्च क्रम संज्ञानात्मक प्रसंस्करण से संबंधित कई मस्तिष्क क्षेत्रों में पाए जाते हैं, जिसमें प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स (पीएफसी) और हिप्पोकैम्पस शामिल हैं। पीएफसी में, पिरामिड न्यूरॉन्स परतों द्वितीय/III और परत वी में मनाया जाता है, प्रत्येक अद्वितीय आकृति विज्ञान का प्रदर्शन के साथ । विशेष रूप से, पीएफसी की परत II/III में पिरामिड न्यूरॉन्स परत V6में पिरामिड न्यूरॉन्स की तुलना में एक छोटे एपिकल डेंराइट और कम शाखाओं में बंटी है । हिप्पोकैम्पस के भीतर, पिरामिड न्यूरॉन्स सीए 1 और सीए 3 दोनों क्षेत्रों में स्थित हैं, जिनमें से प्रत्येक अलग-अलग मॉर्मोलोजी प्रदर्शित करते हैं। विशेष रूप से, CA1 क्षेत्र में पिरामिड न्यूरॉन्स एक अधिक विशिष्ट एपिकल डेंडराइट प्रदर्शित करते हैं, जिसमें सीए 3 क्षेत्र6के सापेक्ष सोमा से आगे होने वाली शाखाओं में बंटी होती है।
पीएफसी और हिप्पोकैम्पस दोनों में पिरामिड न्यूरॉन्स पर डेंड्रिटिक कताई एक्साइटरी सिनेप्स7का प्राथमिक स्थल है। डेंड्रिटिक कताई की रूपात्मक विशेषताएं, जिन्हें शास्त्रीय रूप से तीन प्राथमिक श्रेणियों (यानी, पतली, ठूंठ या मशरूम8)में चित्रित किया गया है, एक्सेक्टेटरी सिनेप्स9के आकार से संबंधित हैं। पतली कताई, एक लंबी, पतली गर्दन, छोटे बल्बस सिर, और छोटे पोस्टसिनैप्टिक घनत्व की विशेषता, अधिक अस्थिर हैं और कमजोर कनेक्शन विकसित करते हैं। हालांकि, मशरूम कताई, जिसमें एक बड़ा डेंड्रिटिक रीढ़ सिर होता है, मजबूत सिनैप्टिक कनेक्शन बनाने के लिए पहचाना जाता है, जो उनके बड़े आकार के परिणामस्वरूप प्रभाव होता है। इसके विपरीत, ठूंठ कताई रीढ़ की गर्दन से रहित होती है, जो लगभग समान सिर और गर्दन की मात्रा अनुपात8का प्रदर्शन करती है। हिप्पोकैम्पस के भीतर, शाखाओं में बंटी कताई भी देखी जा सकती है, जिससे रीढ़ की हड्डी में कई सिर होते हैं जो एक ही डेंड्रिटिक रीढ़ की गर्दन10से निकलते हैं। इसलिए, डेंड्रिटिक कताई के रूपात्मक परिवर्तन कार्यक्षमता और संरचनात्मक क्षमता को प्रतिबिंबित कर सकते हैं। इसके अलावा, अध्ययनों से पता चला है कि डेंड्रिटिक कताई का आकार और आकार उनकी संरचनात्मक प्लास्टिसिटी से संबंधित है, जिससे यह विचार होता है कि छोटे कताई सीखने और ध्यान में शामिल हैं, जबकि बड़े, अधिक स्थिर कताई, स्मृति11सहित दीर्घकालिक प्रक्रियाओं में शामिल हैं। इसके अतिरिक्त, डेंड्राइट के साथ डेंड्रिटिक कताई का वितरण सिनैप्टिक कनेक्टिविटी5,,12से जुड़ा हो सकता है।
इस प्रकार, वर्तमान पद्धतिविज्ञान पत्र के तीन लक्ष्य हैं: 1) बैलिस्टिक लेबलिंग के लिए हमारे प्रोटोकॉल को प्रस्तुत करें, जिसका उपयोग सफलता दर (यानी, न्यूरॉन्स मीटिंग चयन मानदंड और विश्लेषण के लिए उपयुक्त) के साथ किया गया है) 83.3%5,,12,,13 और कई मस्तिष्क क्षेत्रों (यानी, पीएफसी, नाभिक एक्यूबेन्स, हिप्पोकैम्पस) में); 2) तकनीक की सामान्यता और विट्रो में उगाए गए न्यूरॉन्स के लिए इसके आवेदन को प्रदर्शित करें; 3) न्यूरोनल पुनर्निर्माण सॉफ्टवेयर में उपयोग की गई पद्धति और ऐसे डेटा से तैयार किए जा सकने वाले निष्कर्षों का विस्तार करें।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:868px;" width="869">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">20Gx25mm PrecisionGlide needle</td>
			<td style="width:263px;">BD</td>
			<td style="width:143px;">305175</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24-well cell culture plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">35 mm Glass Bottom Dishes</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-1.5-20-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Antibiotic-Antimycotic solution</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>30004CI</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">B-27 supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>50X</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Barrel liner</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Borax</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Boric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B0252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cartridge holder</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Confocal imaging software</td>
			<td style="width:263px;">Nikon</td>
			<td style="width:143px;">EZ-C1</td>
			<td>version 3.81b</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:263px;">Nikon</td>
			<td style="width:143px;">TE-2000E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cover glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>637-137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DilC18(3)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM/F12 medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10565-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dumont #5 Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dumont #7 Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">F344 rat</td>
			<td style="width:263px;">(Harlan Laboratories, Indianapolis, IN)</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glucose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>101174Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GlutaMax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HBSS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4641</td>
			<td>10X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Helios diffusion screens</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Helios gene gun kit</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Helios gene gun system</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Helium hose assembly</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Iris Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>15914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Iris Scissors</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methylene chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D150-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Neurobasal medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Neurolucida 360 software</td>
			<td style="width:263px;">mbf bioscience</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td>dendritic spine analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyvinylpyrrolidone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>5295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ProLong Gold antifade reagent</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P36930</td>
			<td>mounting medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat brain matrix, 300 - 600g, Coronal, 0.5mm</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>15047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sevoflurane</td>
			<td>Merritt Veterinary Supply</td>
			<td>347075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SuperFrost Plus Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-154%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe kit</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tefzel tubing</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tubing cutter</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tubing Prep station</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tungsten M-25 Microcarrier 1.7 &#181;m</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vannas Scissors</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500086</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ballistic labeling of pyramidal neurons in brain slices and in primary cell culture

यह बताया गया है कि डेंड्रिटिक कताई का आकार और आकार उनकी संरचनात्मक प्लास्टिसिटी से संबंधित है। पिरामिड न्यूरॉन्स और डेंड्रिटिक कताई की रूपात्मक संरचना की पहचान करने के लिए, एक बैलिस्टिक लेबलिंग तकनीक का उपयोग किया जा सकता है। वर्तमान प्रोटोकॉल में, पिरामिड न्यूरॉन्स को दिलसी18 (3) रंग से लेबल किया जाता है और न्यूरोनल मॉर्फोलॉजी और डेंड्रिटिक कताई का आकलन करने के लिए न्यूरोनल पुनर्निर्माण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके विश्लेषण किया जाता है। न्यूरोनल संरचना की जांच करने के लिए, डेंड्रिटिक ब्रांचिंग विश्लेषण और Sholl विश्लेषण किया जाता है, जिससे शोधकर्ताओं को क्रमशः डेन्ड्रिटिक ब्रांचिंग जटिलता और न्यूरोनल आर्बर जटिलता के बारे में अनुमान आकर्षित करने की अनुमति मिलती है। डेन्ड्रिटिक कताई का मूल्यांकन पुनर्निर्माण सॉफ्टवेयर के अभिन्न अंग के स्वचालित सहायता प्राप्त वर्गीकरण एल्गोरिदम का उपयोग करके किया जाता है, जो चार श्रेणियों (यानी, पतली, मशरूम, ठूंठ, फिलोपोडिया) में कताई को वर्गीकृत करता है। इसके अलावा, एक अतिरिक्त तीन मापदंडों (यानी, लंबाई, सिर व्यास, और मात्रा) भी डेंड्रिटिक रीढ़ आकृति विज्ञान में परिवर्तन का आकलन करने के लिए चुना जाता है । बैलिस्टिक लेबलिंग तकनीक के व्यापक अनुप्रयोग की क्षमता को मान्य करने के लिए, इन विट्रो सेल संस्कृति से पिरामिड न्यूरॉन्स सफलतापूर्वक लेबल किए गए थे। कुल मिलाकर, बैलिस्टिक लेबलिंग विधि चूहों में विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्रों में न्यूरॉन्स की कल्पना करने के लिए अद्वितीय और उपयोगी है, जो परिष्कृत पुनर्निर्माण सॉफ्टवेयर के संयोजन में, शोधकर्ताओं को अंतर्निहित संभावित तंत्र को स्पष्ट करने की अनुमति देता है न्यूरोकॉग्निटिव डिसफंक्शन।

चित्रा 2Aमें, चूहे के मस्तिष्क वर्गों में हिप्पोकैम्पल क्षेत्र में विशिष्ट पिरामिड न्यूरॉन्स की पहचान बैलिस्टिक लेबलिंग तकनीक द्वारा की गई थी, जिसकी विशेषता एक बड़े एपिकल डेंडराइट और सोमा ...

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Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture

हम पिरामिड न्यूरॉन्स को लेबल और विश्लेषण करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं, जो न्यूरॉन्स और डेंड्रिटिक कताई में संभावित रूपात्मक परिवर्तनों का मूल्यांकन करने के लिए महत्वपूर्ण है जो न्यूरोकेमिकल और व्यवहार असामान्यताओं को आबाद कर सकता है।

मस्तिष्क स्लाइस में और प्राथमिक सेल संस्कृति में पिरामिड न्यूरॉन्स की बैलिस्टिक लेबलिंग

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of ...

यह प्रोटोकॉल न्यूरॉन्स और डेंड्रिटिक कताई में संभावित रूपात्मक परिवर्तनों का मूल्यांकन करना संभव बनाता है जो न्यूरोकेमिकल और व्यवहार असामान्यताओं को रेखांकित कर सकता है। यह चूहों में विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्रों में न्यूरॉन्स की कल्पना के लिए अद्वितीय और उपयोगी है, जो परिष्कृत पुनर्निर्माण सॉफ्टवेयर के संयोजन में शोधकर्ताओं को न्यूरोकॉग्निटिव डिसफंक्शन अंतर्निहित संभावित तंत्र को स्पष्ट करने की अनुमति देता है। पांडुलिपि निर्देशों के अनुसार पीवीपी समाधान तैयार करके शुरू करें।पीवीपी के साथ ट्यूबिंग भरें और इसे 20 मिनट के लिए छोड़ दें। और इसे 10 मिलीलीटर सिरिंज के साथ दूसरे छोर के माध्यम से निष्कासित करें। मेथिलीन क्लोराइड के 250 माइक्रोलीटर के साथ टंगस्टन माइक्रोकैरियर मोतियों के 170 मिलीग्राम मिलाएं।फिर निलंबन को अच्छी तरह से भंवर में ला देते हैं। इसके बाद, मेथिलीन क्लोराइड और भंवर के 300 माइक्रोलीटर में लिपोफिलिक DilC18 (3) डाई के 6 मिलीग्राम जोड़ें। एक ग्लास स्लाइड पर टंगस्टन मनका निलंबन के पिपेट 250 माइक्रोलीटर।हवा सूखी करने के लिए निलंबन के लिए प्रतीक्षा करें और डाई समाधान के 300 माइक्रोलीटर जोड़ें। एक बार सूख जाने के बाद, मिश्रण को दो 1.5 मिलीलीटर सेंट्रलाइज ट्यूब में विभाजित करने के लिए एक रेजर का उपयोग करें और ट्यूबों को पानी से भर दें। समरूप होने तक पानी के स्नान में मिश्रण को सोनिकेट करें।यह सुनिश्चित करना कि सोनिकेटर टिप सीधे ट्यूबों पर निहित है। दोनों मिश्रणों को 15 मिलीलीटर शंकुदाता में मिलाएं। और एक और तीन मिनट के लिए sonicate, सुनिश्चित करें कि डाई लेपित मोती का कोई बड़ा झुरमुट रहते हैं ।सोनीफिकेशन के बाद, मिश्रण को 10 मिलीलीटर सिरिंज के साथ पीवीपी कोटेड ट्यूबिंग में खींचें। और तैयारी स्टेशन में ट्यूबिंग खिलाओ। ट्यूबिंग को एक मिनट के लिए घुमाएं।सावधानी से एक सिरिंज का उपयोग कर सभी पानी को हटा दें। नाइट्रोजन गैस चालू करें और नाइट्रोजन प्रवाह को लगभग 0.5 लीटर प्रति मिनट तक समायोजित करें। तैयारी स्टेशन में ट्यूबिंग घुमाएं और इसे 30 मिनट तक नाइट्रोजन के साथ सुखा लें।स्टेशन से ट्यूबिंग निकालें और इसे ट्यूबिंग कटर से 13 मिलीमीटर सेगमेंट में काट लें। सुनिश्चित करें कि चूहा हानिकारक उत्तेजनाओं के प्रति उत्तरदायी नहीं है और सजगता अनुपस्थित है। फिर इसे रीढ़ की स्थिति में सुरक्षित करें।वक्ष मिडलाइन के साथ एक चीरा बनाओ। डायाफ्राम को अलग करें और कैंची से छाती खोलें। इसके बाद बाएं वेंट्रिकल में 20 गेज 25 मिलीमीटर सुई डालें।तुरंत कैंची के साथ सही एट्रियम में कटौती करें और 5 मिलीमीटर प्रति मिनट प्रवाह दर के साथ 100 मिलीमोलर पीबीएस के 15 मिलीलीटर को छिद्रित करें। फिर पीबीएस में 4% पीएफए बफर के 100 मिलीलीटर को बढ़ाया जाता है। परफ्यूजन के बाद, पूरे चूहे के मस्तिष्क को हटा दें।और इसे 10 मिनट के लिए 4% पीएफए के साथ पोस्टफिक्स करें। 500 माइक्रोमीटर मोटी कोरोनल सेक्शन को काटने के लिए चूहा ब्रेन मैट्रिक्स का इस्तेमाल करें। एक मुट्ठी काट कर ब्लेड जगह में रखें।फिर एक दूसरे ब्लेड के साथ एक दूसरा कट बनाएं और ब्लेड की सतह पर ऊतक रखते हुए, पहले ब्लेड को हटा दें। प्रत्येक कुएं में पीबीएस के 1 मिलीलीटर के साथ 24-अच्छी प्लेट में मस्तिष्क स्लाइस रखें। और इस प्रक्रिया को तब तक दोहराएं जब तक कि सभी स्लाइस काट नहीं दिए गए हैं।प्रत्येक लक्षित अच्छी तरह से पीबीएस निकालें। दिल/टंगस्टन ट्यूबिंग के टुकड़े के साथ उपास्थि लोड और एप्लिकेटर में जगह है । दो जाल स्क्रीन के बीच फिल्टर पेपर का एक टुकड़ा रखो।और एप्लिकेटर को हीलियम नली से कनेक्ट करें। फिर हीलियम के आउटपुट प्रेशर को 90 पाउंड प्रति वर्ग इंच तक एडजस्ट करें। एप्लिकेटर को नमूने और जाल स्क्रीन के बीच 1.5 सेंटीमीटर लक्षित के केंद्र पर खड़ी रखें।इसके बाद दिल/टंगस्टन ट्यूबिंग को आग लगा दी । अगले ट्यूबिंग के साथ उपास्थि लोड और लगातार शेष स्लाइस पर टयूबिंग से मोती आग। 100 मिलीमोलर पीबीएस के साथ 24-वेल प्लेट भरें।और स्लाइस को ताजा पीबीएस के 500 माइक्रोलीटर के साथ तीन बार धोएं। सुनिश्चित करें कि स्लाइस धोने के दौरान फ्लिप नहीं करते हैं। समाप्त होने पर, स्लाइस में ताजा पीबीएस के 500 माइक्रोलीटर जोड़ें।और उन्हें अंधेरे में चार डिग्री सेल्सियस पर तीन घंटे के लिए इनक्यूबेट । इनक्यूबेशन के बाद, कांच की स्लाइड पर मस्तिष्क स्लाइस स्थानांतरित करने के लिए एक ठीक ब्रश का उपयोग करें। और तुरंत प्रत्येक खंड में एंटीफेड बढ़ते माध्यम का एक मिलीलीटर जोड़ें।वर्गों के ऊपर एक 22 बाय 15 मिलीमीटर कवरलिप रखें और अंधेरे में स्लाइड सूख जाएं। कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप सिस्टम चालू करें और 60X उद्देश्य पर स्विच करें। पांडुलिपि निर्देशों के अनुसार इमेजिंग सेटिंग्स को समायोजित करें।और मस्तिष्क क्षेत्र की सीमाओं और न्यूरॉन्स की रूपात्मक विशेषताओं के आधार पर लक्षित न्यूरॉन प्रकार के लिए जेड-स्टैक छवियां प्राप्त करें। एक दिन बाद F344/N चूहों से प्राथमिक कॉर्टिकल न्यूरॉन को अलग करें और उन्हें एक सप्ताह के लिए 35 मिलीमीटर ग्लास बॉटम डिश में संस्कृति दें। अलगाव के बाद तीसरे दिन माध्यम के आधे ताज़ा।100 मिलीमोलर पीबीएस के 1 मिलीलीटर के साथ दो बार डिश धोएं। और कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए 4% पीएफए के साथ कोशिकाओं को ठीक करें। बैलिस्टिक रूप से कोशिकाओं को पहले वर्णित लेबल करें।और उन्हें पीबीएस के 1 मिलीलीटर के साथ तीन बार और धोएं। कोशिकाओं में पीबीएस के 500 माइक्रोलीटर जोड़ें और अंधेरे में चार डिग्री सेल्सियस पर तीन घंटे के लिए उन्हें इनक्यूबेट करें। इसके बाद एंटीफैड माउंटिंग मीडियम के 200 माइक्रोलीटर डालें।और प्रत्येक लक्षित न्यूरॉन के लिए जेड-स्टैक छवियां प्राप्त करें। चूहे के मस्तिष्क वर्गों में हिप्पोकैम्पल क्षेत्र में विशिष्ट पिरामिड न्यूरॉन्स को बैलिस्टिक लेबलिंग तकनीक के साथ पहचाना गया था, जिसमें एक बड़े एपिकल डेंड्राइट और सोमा के चारों ओर कई छोटे बेसल डेन्ड्रिट्स की विशेषता थी। न्यूरोनल पुनर्निर्माण मात्रात्मक विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग डेंड्रिटिक शाखाओं का पता लगाने और कताई का पता लगाने के लिए किया गया था।बाद में, सॉफ्टवेयर का उपयोग डेंड्रिटिक ब्रांचिंग जटिलता और न्यूरोनल आर्बर जटिलता का आकलन करने के लिए किया गया था। डेंड्रिटिक कताई में रूपात्मक परिवर्तनों का मूल्यांकन लंबाई, मात्रा और सिर व्यास का उपयोग करके किया गया था। फिर कताई को पतली, ठूंठ और मशरूम कताई में वर्गीकृत किया गया।और प्रत्येक त्रिज्या के बीच कताई की संख्या की सापेक्ष आवृत्ति की जांच की गई थी। इसके अलावा और अधिक बैलिस्टिक लेबलिंग तकनीक सेल संस्कृति में एक प्राथमिक पिरामिड न्यूरॉन पर मान्य किया गया था। पिरामिड न्यूरॉन्स की पहचान सोमा और बड़े एपिकल डेंड्राइट के त्रिकोण आकार के आधार पर की गई थी।फिर न्यूरोनल पुनर्निर्माण सॉफ्टवेयर का उपयोग पतली डेंड्रिटिक कताई और डेंड्रिटिक स्पाइन लंबाई के वितरण का विश्लेषण करने के लिए किया गया था। इस प्रोटोकॉल का प्रयास करते समय, तैयारी शुरू करने वाले बड़े झुरमुट या बैलिस्टिक डाई कोटेड टंगस्टन मोतियों के समूहों से बचना महत्वपूर्ण है। झुरमुट अलग-अलग न्यूरॉन्स को प्रतिष्ठित नहीं होने देंगे।न्यूरोनल पुनर्निर्माण सॉफ्टवेयर के साथ संयुक्त यह विधि हमें हिप्पोकैम्पस पिरामिड न्यूरॉन्स में न्यूरोनल और डेंड्रिटिक स्पाइन आकृति विज्ञान की जांच करने की अनुमति देती है। न्यूरोनल पुनर्निर्माण सॉफ्टवेयर डेंड्रिटिक कताई के स्वचालित सहायता प्राप्त वर्गीकरण की पेशकश करने के लिए एक एल्गोरिदम का उपयोग करता है। कई न्यूरोनल मापदंडों का मात्राकरण न्यूरोनल संज्ञानात्मक रोग अंतर्निहित तंत्र को बेहतर ढंग से समझने का अवसर प्रदान करता है।

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

विच्छेदन और भ्रूणीय स्पाइनल कॉर्ड से Commissural न्यूरॉन्स की संस्कृति

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

कृंतक से न्यूरॉन्स और गैर मानव प्राइमेट मस्तिष्क स्लाइसें के DiOLISTIC लेबल

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

प्रतिगामी फ्लोरोसेंट लेबलिंग पहचाने गए न्यूरॉन्स से लक्षित कोशिकी एकल इकाई रिकॉर्डिंग के लिए अनुमति देता है<em&gt; विवो में</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

इमेजिंग Hypothalamic माउस मस्तिष्क स्लाइस की GFP टैग न्यूरॉन्स में कैल्शियम प्रतिक्रियाएँ

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

Axons, Dendrites और मस्तिष्क स्लाइसें में व्यक्तिगत न्यूरॉन्स के वृक्ष के समान spines से वोल्टेज के प्रति संवेदनशील डाई रिकॉर्डिंग

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

तीव्र hippocampal स्लाइस में Synaptically पैदा Astroglial और neuronal प्रतिक्रियाएँ की दोहरी electrophysiological रिकॉर्डिंग

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

माउस डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स के प्राथमिक संस्कृति

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Organotypic hippocampal स्लाइस में बनती पूरे सेल रिकॉर्डिंग

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

भ्रूण कृंतक दिमाग से प्राथमिक Mesencephalic डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स के अलगाव, संस्कृति और लंबी अवधि के रखरखाव

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

ब्रेन स्लाइस में पूरे सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...