Name: ballistic labeling of pyramidal neurons in brain slices and in primary cell culture
Uploaded: 2020-04-02T14:00:00
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この研究は、NIH助成金HD043680、MH106392、DA013137、およびNS100624によって資金提供されました。

すべての動物のプロトコルは、サウスカロライナ大学の動物ケアと使用委員会によって見直され、承認されました(連邦保証番号:D16-00028)。
1. DiI/タングステンビーズチューブの準備
<ol><li>100 mgのポリビニルピロリドン(PVP)を10 mLのddH2O. Vortexで軽く溶解します。</li>
	<li>PVP溶液(材料表を参照)でチューブを充填し、20分間放置します。次いで、10 mLシリン...

<ol>
	<li>Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+"DiOlistic"+labeling+of+the+nervous+system+using+lipophilic+dye+combinations.">Multicolor "DiOlistic" labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations.</a> Neuron. 27, 219-225 (2000).</li><li>Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, R. O., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ballistic+delivery+of+dyes+for+structural+and+functional+studies+of+the+nervous+system.">Ballistic delivery of dyes for structural and functional studies of the nervous system.</a> Cold Spring Harbor Protocol. 2009 (4), 5202 (2009).</li><li>Seabold, G. K., Daunais, J. B., Rau, A., Grant, K. A., Alvarez, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DiOLISTIC+labeling+of+neurons+from+rodent+and+non-human+primate+brain+slices.">DiOLISTIC labeling of neurons from rodent and non-human primate brain slices.</a> Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).</li><li>Spacek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+the+Golgi+method:+a+time-lapse+study+of+the+early+stages+of+impregnation+in+single+sections.">Dynamics of the Golgi method: a time-lapse study of the early stages of impregnation in single sections.</a> Journal of Neurocytology. 18 (1), 27-38 (1989).</li><li>McLaurin, K. A., Li, H., Booze, R. M., Mactutus, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+Timing:+NeuroHIV+Progression+in+the+Post-cART+Era.">Disruption of Timing: NeuroHIV Progression in the Post-cART Era.</a> Science Reports. 9 (1), 827 (2019).</li><li>Spruston, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyramidal+neurons:+dendritic+structure+and+synaptic+integration.">Pyramidal neurons: dendritic structure and synaptic integration.</a> Nature Reviews Neurosciences. 9 (3), 206-221 (2008).</li><li>Megias, M., Emri, Z., Freund, T. F., Gulyas, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+number+and+distribution+of+inhibitory+and+excitatory+synapses+on+hippocampal+CA1+pyramidal+cells.">Total number and distribution of inhibitory and excitatory synapses on hippocampal CA1 pyramidal cells.</a> Neuroscience. 102, 527-540 (2001).</li><li>Peters, A., Kaiserman-Abramof, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+small+pyramidal+neuron+of+the+rat+cerebral+cortex.+The+perikaryon,+dendrites+and+spines.">The small pyramidal neuron of the rat cerebral cortex. The perikaryon, dendrites and spines.</a> American Journal of Anatomy. 127, 321-355 (1970).</li><li>Harris, K. M., Sultan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+the+number,+location,+and+size+of+synaptic+vesicles+provides+an+anatomical+basis+for+the+nonuniform+probability+of+release+at+hippocampal+CA1+synapses.">Variation in the number, location, and size of synaptic vesicles provides an anatomical basis for the nonuniform probability of release at hippocampal CA1 synapses.</a> Neuropharmacology. 34, 1387-1395 (1995).</li><li>Sorra, K. E., Fiala, J. C., Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+assessment+of+the+involvement+of+perforations,+spinules,+and+spine+branching+in+hippocampal+synapse+formation.">Critical assessment of the involvement of perforations, spinules, and spine branching in hippocampal synapse formation.</a> Journal of Comparative Neurology. 398, 225-240 (1998).</li><li>Mancuso, J. J., Chen, Y., Li, X., Xue, Z., Wong, S. T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+dendritic+spine+detection:+from+Golgi+to+high-resolution+optical+imaging.">Methods of dendritic spine detection: from Golgi to high-resolution optical imaging.</a> Neuroscience. 251, 129-140 (2012).</li><li>McLaurin, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+connectivity+in+medium+spiny+neurons+of+the+nucleus+accumbens:+A+sex-dependent+mechanism+underlying+apathy+in+the+HIV-1+transgenic+rat.">Synaptic connectivity in medium spiny neurons of the nucleus accumbens: A sex-dependent mechanism underlying apathy in the HIV-1 transgenic rat.</a> Frontiers in Behavior Neurosciences. 12, 285 (2018).</li><li>Roscoe, R. F., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+transgenic+female+rat:+synaptodendritic+alterations+of+medium+spiny+neurons+in+the+nucleus+accumbens.">HIV-1 transgenic female rat: synaptodendritic alterations of medium spiny neurons in the nucleus accumbens.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 9 (5), 642-653 (2014).</li><li>Li, H., Aksenova, M., Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Booze, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Filamentous+Actin+(F-actin)+Puncta+in+Rat+Cortical+Neurons.">Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (108), e53697 (2016).</li><li>Rodriguez, A., Ehlenberger, D. B., Dickstein, D. L., Hof, P. R., Wearne, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+Three-Dimensional+Detection+and+Shape+Classification+of+Dendritic+Spines+from+Fluorescence+Microscopy+Images.">Automated Three-Dimensional Detection and Shape Classification of Dendritic Spines from Fluorescence Microscopy Images.</a> PLoS ONE. 3 (10), 1371 (2008).</li></ol>

このプロトコルでは、ラット脳とインビトロで成長したニューロンの両方のニューロンに対する汎用性の高い標識技術について説明する。さらに、神経変態と神経再建定量解析ソフトウェアを用いて、神経形態や樹状脊椎を評価する方法論を報告する。神経形態と樹状脊椎の評価は、樹状分岐の複雑さ、ニューロンの樹状樹状の複雑さ、樹状脊椎形態、シナプス接続性の変化を決定する機会?...

2000年、Gan et al. は、種々の親油性色素を組み合わせた神経系における個々のニューロンおよびグリアに対する迅速な標識技術を説明し、異なる色11,22を有する多くの脳細胞の同時標識を可能にする。最近では、脳スライスのニューロンに蛍光色素(Dil)を導入したシーボルトら3によって弾道標識技術が説明された。多目的な染色技術、弾道標識は、複数の動物種で、年齢の広い範囲にわたって利用される能力のために高く評価される。さらに、免疫染色と組み合わせて、脳細胞3の亜集団を同定することができる。従来の技術(例えば、ゴルジ・コックス銀含浸、マイクロインジェクション)4と比較して、弾道標識は樹状棘を含む形態学的特徴をより明確に区別する機会を与える。5
興奮性錐体ニューロンは、単一の大きな尖形樹状突起、複数の短い基礎樹状突起、および樹状脊椎の数千人によって特徴付けられる6。錐体ニューロンは、前頭前野(PFC)および海馬を含む高次認知処理に関連する複数の脳領域で発見される。PFCでは、錐体ニューロンは層II/IIIおよび層Vで観察され、それぞれが独特の形態を示す。具体的には、PFCの層II/IIIの錐体ニューロンは、層V6の錐体ニューロンよりも短い有端樹状突起および枝分かれが少ない。海馬内では、錐体ニューロンはCA1とCA3の両方の領域に位置し、それぞれが異なる形態を示しています。具体的には、CA1領域における錐体ニューロンは、より特徴的な尖体樹状突起を呈し、分岐は、CA3領域6に対して、ソーマから遠く離れた場所で生じる。
PFCと海馬の両方の錐体ニューロン上の樹状脊椎は興奮シナプス7の主要な部位である。樹状脊椎の形態学的特徴は、古典的に3つの主要なカテゴリ(すなわち、薄い、頑固、またはキノコ8)に特徴付けられるが、興奮性シナプス9の大きさに関連している。細い棘は、長くて細い首、小さな球根の頭部、およびより小さなポストナプティクス密度によって特徴付けられるが、より不安定であり、弱い接続を開発する。しかし、より大きな樹状脊椎の頭部を有するキノコ脊椎は、より強いシナプス接続を形成することが認められ、その大きなサイズに起因する効果がある。鋭い対照的に、頑固な棘は脊柱首を欠き、頭頸部容積比8にほぼ等しい。海馬内では、分岐した脊椎も観察され、それによって脊椎は同じ樹状脊椎頸部10から出現する複数の頭部を有する。したがって、樹状脊椎の形態学的変化は、機能性および構造的能力を反映する可能性がある。さらに、樹状脊椎の大きさと形状が構造的可塑性に関連していることを実証した研究は、小さな棘が学習と注意に関与しているのに対し、より大きく、より安定した脊椎は、記憶11を含む長期的なプロセスに関与しているという考えにつながる。さらに、樹状突起に沿った樹状脊椎の分布は、シナプス接続性5,1212と関連している可能性がある。
したがって、本方法論的論文には3つの目標があります:1)成功率(すなわち、ニューロンが選択基準を満たし、分析に適しているニューロン)で利用された弾道標識のプロトコルを83.3%5、12、13と複数の脳領域(すなわち、PFC、側坐核、海馬)にわたって提示する。5,12,132)この技術の一般化性と、インビトロで成長したニューロンへの応用を実証する。3) 神経再建ソフトウェアで利用される方法論と、そのようなデータから引き出すことができる推論を詳述する。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:868px;" width="869">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">20Gx25mm PrecisionGlide needle</td>
			<td style="width:263px;">BD</td>
			<td style="width:143px;">305175</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24-well cell culture plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">35 mm Glass Bottom Dishes</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-1.5-20-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Antibiotic-Antimycotic solution</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>30004CI</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">B-27 supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>50X</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Barrel liner</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Borax</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Boric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B0252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cartridge holder</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Confocal imaging software</td>
			<td style="width:263px;">Nikon</td>
			<td style="width:143px;">EZ-C1</td>
			<td>version 3.81b</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:263px;">Nikon</td>
			<td style="width:143px;">TE-2000E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cover glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>637-137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DilC18(3)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM/F12 medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10565-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dumont #5 Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dumont #7 Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">F344 rat</td>
			<td style="width:263px;">(Harlan Laboratories, Indianapolis, IN)</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glucose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>101174Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GlutaMax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HBSS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4641</td>
			<td>10X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Helios diffusion screens</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Helios gene gun kit</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Helios gene gun system</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Helium hose assembly</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Iris Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>15914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Iris Scissors</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methylene chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D150-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Neurobasal medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Neurolucida 360 software</td>
			<td style="width:263px;">mbf bioscience</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td>dendritic spine analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyvinylpyrrolidone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>5295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ProLong Gold antifade reagent</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P36930</td>
			<td>mounting medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat brain matrix, 300 - 600g, Coronal, 0.5mm</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>15047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sevoflurane</td>
			<td>Merritt Veterinary Supply</td>
			<td>347075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SuperFrost Plus Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-154%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe kit</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tefzel tubing</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tubing cutter</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tubing Prep station</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tungsten M-25 Microcarrier 1.7 &#181;m</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vannas Scissors</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500086</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ballistic labeling of pyramidal neurons in brain slices and in primary cell culture

樹状棘の大きさや形は、その構造的可塑性に関連していると報告されています。錐体ニューロンと樹状棘の形態構造を同定するために、弾道標識技術を利用することができる。本プロトコルでは、錐体ニューロンはDilC18(3)色素で標識され、ニューロンの再構成ソフトウェアを用いて神経の形態と樹状脊椎を評価するために分析されます。神経構造を調べるため、樹枝解析とSholl解析が行われ、樹状分岐の複雑さと神経細胞の複雑性に関する推論をそれぞれ描くことができます。樹状脊椎の評価は、脊椎を4つのカテゴリ(すなわち、薄い、キノコ、スタビー、フィロポディア)に分類する再構成ソフトウェアに不可欠な自動補助分類アルゴリズムを使用して行われます。さらに、樹状脊椎形態の変化を評価するために、さらに3つのパラメータ(すなわち、長さ、頭の直径、および体積)も選択される。弾道標識技術の広い応用の可能性を検証するために、インビトロ細胞培養からの錐体ニューロンに正常に標識された。全体として、弾道ラベリング法は、高度な再構築ソフトウェアと組み合わせて、ラットの異なる脳領域のニューロンを視覚化するのにユニークで有用であり、研究者は基礎となる可能性のあるメカニズムを解明することができます神経認知機能障害.

図2Aでは、ラット脳切片の海馬領域における典型的な錐体ニューロンを、1つの大きな頭突きといくつかの小さな基底樹状突起を特徴とする弾道標識技術によって同定された。図2Bは、相腫が検出された後の神経再建定量解析ソフトウェアにおけるニューロンを示し、樹状枝を追跡し、脊椎を検出した。その後、神経再建定量解析ソフトウェアを用?...

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Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture

神経化学的および行動異常の根本にある可能性のあるニューロンおよび樹状脊椎の形態変化の可能性を評価するために重要な錐体ニューロンを標識し、分析するプロトコルを提示する。

脳スライスと一次細胞培養における錐体ニューロンの弾道標識

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of ...

このプロトコルは、神経化学的および行動異常を強調する可能性のあるニューロンおよび樹状脊椎における潜在的な形態学的変化を評価することを可能にする。これは、高度な再建ソフトウェアと組み合わせて、研究者が神経認知機能障害の根底にある可能なメカニズムを解明することを可能にするラットの異なる脳領域のニューロンを視覚化するのにユニークで有用です。まず、原稿の指示に従ってPVP溶液を準備します。チューブにPVPを充填し、20分間放置します。そして、10ミリリットルの注射器でもう一方の端を通してそれを排出します。170ミリグラムのタングステンマイクロキャリアビーズと250マイクロリットルの塩化メチレンを組み合わせます。その後、徹底的にサスペンションを渦。次に、6ミリグラムの親油性DilC18(3)色素を300マイクロリットルの塩化メチレンとボルテックスに加えます。ガラススライド上にタングステンビーズ懸濁液のピペット250マイクロリットル。懸濁液が空気乾燥するのを待ち、300マイクロリットルの染料溶液を加えます。乾燥したら、カミソリを使用して混合物を2つの1.5ミリリットル遠心管に分割し、チューブに水を充填します。均質になるまで水浴で混合物を超音波処理します。超音波処理器の先端が直接チューブ上にあることを確認します。2つの混合物を15ミリリットルの円錐管に組み合わせます。そして、さらに3分間超音波処理し、染料コーティングされたビーズの大きな塊が残らないようにします。超音波処理の後、10ミリリットルのシリンジでPVPコーティングチューブに混合物を引き込みます。そして、準備ステーションにチューブを供給します。チューブを 1 分間回転させます。慎重に注射器を使用してすべての水を除去します。窒素ガスをオンにし、窒素の流れを毎分約0.5リットルに調整します。準備ステーションでチューブを回転させ、窒素で30分間乾燥させます。駅からチューブを取り外し、チューブカッターで13ミリメートルのセグメントにカットします。ラットが有害な刺激に反応せず、反射神経がないことを確認してください。その後、サピーヌの位置にそれを確保します。胸部中線に沿って切開を行います。ダイヤフラムを分離し、はさみで胸を開きます。その後、20ゲージ25ミリメートルの針を左心室に挿入します。すぐに右心房をはさみで切り、1分あたり5ミリメートルの流量で100ミリモルPBSの15ミリリットルを浸透させます。その後、PBSに緩衝された4%PFAの100ミリリットルを浸透させます。灌流後、ラットの脳全体を取り除く。4%PFAで10分間後置きします。ラットの脳マトリックスを使用して、厚さ500マイクロメートルのコロナセクションを切断します。拳をカットし、所定の位置にブレードを保ちます。その後、2番目のブレードで2回目のカットを行い、最初のブレードを垂直に取り外し、ブレード表面に組織を維持します。各井戸にPBSの1ミリリットルと24ウェルプレートに脳スライスを置きます.そして、すべてのスライスがカットされるまで、プロセスを繰り返します。各ターゲットからPBSを削除します。軟骨をディル/タングステンチューブでロードし、アプリケータに入れなさい。2つのメッシュスクリーンの間にフィルターペーパーを置きます。そして、アプリケーターをヘリウムホースに接続します。その後、ヘリウムの出力圧力を1平方インチ当たり90ポンドに調整します。サンプルとメッシュ画面の間のターゲットウェルの中央にアプリケータを垂直に配置します。その後、ディル/タングステンチューブを発射します。次のチューブで軟骨をロードし、連続残りのスライスのチューブからビーズを発射します。24ウェルプレートに100ミリモルPBSを充填します。そして、新鮮なPBSの500マイクロリットルでスライスを3回洗います。洗浄中にスライスがひっくり返らないようにします。終了したら、スライスに新鮮なPBSを500マイクロリットル加えます。そして、暗闇の中で摂氏4度で3時間インキュベートします。インキュベーションの後、細かいブラシを使用して、脳のスライスをガラススライドに移します。そして、すぐに各セクションにアンチフェード実装媒体の1ミリリットルを追加します。セクションの上に22 x 15ミリメートルのカバースリップを置き、暗闇の中でスライドを乾燥させます。共焦点顕微鏡システムをオンにし、60倍の目的に切り替えます。原稿の方向に合わせて画像設定を調整します。そして、脳領域の境界とニューロンの形態学的特徴に基づいて、標的ニューロン型のZスタック画像を取得する。出生後1日目にF344/Nラットから一次皮質ニューロンを分離し、35ミリメートルのガラス底皿で1週間培養する。分離後3日目にメディアの半分をリフレッシュする。100ミリモルPBSの1ミリリットルで皿を2回洗います。そして、室温で15分間4%PFAで細胞を固定します。前述のようにセルにバリスティックラベルを付けます。そして、PBSの1ミリリットルでさらに3回洗います。500マイクロリットルのPBSを細胞に加え、暗闇の中で摂氏4度で3時間インキュベートします。その後、アンチフェードマウントメディアの200マイクロリットルを追加します。各標的ニューロンのZスタック画像を取得します。ラット脳切片の海馬領域における典型的な錐体ニューロンは、1つの大きな天端樹状突起およびいくつかの小さな基底樹状突起を特徴とする弾道標識技術で同定された。神経再建定量解析ソフトウェアを使用して樹状枝を追跡し、脊椎を検出しました。その後、このソフトウェアは、樹状分岐の複雑さと神経細胞の複雑さを評価するために使用されました。樹状脊椎の形態学的変化を、長さ、体積、および頭部の直径を用いて評価した。その後、棘は薄い、頑固な、そしてキノコの棘に分類された。各半径間の脊椎の数の相対頻度を調べた。さらに弾道標識技術は、細胞培養における一次錐型の錐体ニューロンで検証された。ピラミッド型ニューロンは、相馬と大きな尖形デンドライトの三角形の形状に基づいて同定された。その後、神経再建ソフトウェアを用いて、細い樹状脊椎と樹状脊椎の長さの分布を解析した。このプロトコルを試みる際には、大きな塊や弾道染料被覆タングステンビーズのクラスターが準備を開始しないようにすることが重要です。塊は、個々のニューロンを区別することを許可しません。神経再建ソフトウェアと組み合わせることで、この方法は、海馬錐体ニューロンにおける神経および樹状脊椎形態を調べることができます。ニューロン再構成ソフトウェアは、樹状脊椎の自動補助分類を提供するアルゴリズムを利用します。複数の神経パラメーターの定量化は、ニューロン認知機能障害の根底にあるメカニズムをよりよく理解する機会を提供します。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

胚の脊髄から交連ニューロンの解剖と文化

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

げっ歯類からの神経細胞とヒト以外の霊長類の脳スライスのDiOLISTIC標識

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

逆行性蛍光標識は、特定された神経細胞から標的細胞外シングルユニット記録を可能にします<em生体内で&gt;</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

視床下部マウス脳スライスのGFPタグニューロンにおけるイメージングカルシウム応答

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

軸索、樹状突起および脳スライスにおける個々のニューロンの樹状突起棘から電位感受性色素記録

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

急性海馬スライスにおけるシナプス誘発アストログリアとニューロン活動の二重の電気生理学的記録

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

マウスドーパミン作動性ニューロンの初代培養

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

器官型海馬スライスにおけるペア全細胞記録

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

胚性齧歯類の脳から単離、プライマリ脳ドーパミンニューロンの文化と長期メンテナンス

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

脳スライスにおける全細胞パッチクランプ記録

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...