Name: ballistic labeling of pyramidal neurons in brain slices and in primary cell culture
Uploaded: 2020-04-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture at JoVE.com

Dette arbeidet ble finansiert av NIH-bevilgninger HD043680, MH106392, DA013137 og NS100624.

Alle dyreprotokoller ble gjennomgått og godkjent av Animal Care and Use Committee ved University of South Carolina (føderal sikringsnummer: D16-00028).
1. Forberedelse av DiI/ Wolfram perle rør
<ol><li>Oppløs 100 mg polyvinylpyrrolidon (PVP) med 10 ml ddH2O. Vortex PVP-oppløsningen lett.</li>
	<li>Fyll slangen med PVP-løsningen (se Materialtabellen) og la den stå i 20 min. Deretter utviser pvp-oppløsningen gjennom den andre enden av slangen ved hjelp av en...

<ol>
	<li>Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+"DiOlistic"+labeling+of+the+nervous+system+using+lipophilic+dye+combinations.">Multicolor "DiOlistic" labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations.</a> Neuron. 27, 219-225 (2000).</li><li>Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, R. O., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ballistic+delivery+of+dyes+for+structural+and+functional+studies+of+the+nervous+system.">Ballistic delivery of dyes for structural and functional studies of the nervous system.</a> Cold Spring Harbor Protocol. 2009 (4), 5202 (2009).</li><li>Seabold, G. K., Daunais, J. B., Rau, A., Grant, K. A., Alvarez, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DiOLISTIC+labeling+of+neurons+from+rodent+and+non-human+primate+brain+slices.">DiOLISTIC labeling of neurons from rodent and non-human primate brain slices.</a> Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).</li><li>Spacek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+the+Golgi+method:+a+time-lapse+study+of+the+early+stages+of+impregnation+in+single+sections.">Dynamics of the Golgi method: a time-lapse study of the early stages of impregnation in single sections.</a> Journal of Neurocytology. 18 (1), 27-38 (1989).</li><li>McLaurin, K. A., Li, H., Booze, R. M., Mactutus, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+Timing:+NeuroHIV+Progression+in+the+Post-cART+Era.">Disruption of Timing: NeuroHIV Progression in the Post-cART Era.</a> Science Reports. 9 (1), 827 (2019).</li><li>Spruston, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyramidal+neurons:+dendritic+structure+and+synaptic+integration.">Pyramidal neurons: dendritic structure and synaptic integration.</a> Nature Reviews Neurosciences. 9 (3), 206-221 (2008).</li><li>Megias, M., Emri, Z., Freund, T. F., Gulyas, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+number+and+distribution+of+inhibitory+and+excitatory+synapses+on+hippocampal+CA1+pyramidal+cells.">Total number and distribution of inhibitory and excitatory synapses on hippocampal CA1 pyramidal cells.</a> Neuroscience. 102, 527-540 (2001).</li><li>Peters, A., Kaiserman-Abramof, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+small+pyramidal+neuron+of+the+rat+cerebral+cortex.+The+perikaryon,+dendrites+and+spines.">The small pyramidal neuron of the rat cerebral cortex. The perikaryon, dendrites and spines.</a> American Journal of Anatomy. 127, 321-355 (1970).</li><li>Harris, K. M., Sultan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+the+number,+location,+and+size+of+synaptic+vesicles+provides+an+anatomical+basis+for+the+nonuniform+probability+of+release+at+hippocampal+CA1+synapses.">Variation in the number, location, and size of synaptic vesicles provides an anatomical basis for the nonuniform probability of release at hippocampal CA1 synapses.</a> Neuropharmacology. 34, 1387-1395 (1995).</li><li>Sorra, K. E., Fiala, J. C., Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+assessment+of+the+involvement+of+perforations,+spinules,+and+spine+branching+in+hippocampal+synapse+formation.">Critical assessment of the involvement of perforations, spinules, and spine branching in hippocampal synapse formation.</a> Journal of Comparative Neurology. 398, 225-240 (1998).</li><li>Mancuso, J. J., Chen, Y., Li, X., Xue, Z., Wong, S. T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+dendritic+spine+detection:+from+Golgi+to+high-resolution+optical+imaging.">Methods of dendritic spine detection: from Golgi to high-resolution optical imaging.</a> Neuroscience. 251, 129-140 (2012).</li><li>McLaurin, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+connectivity+in+medium+spiny+neurons+of+the+nucleus+accumbens:+A+sex-dependent+mechanism+underlying+apathy+in+the+HIV-1+transgenic+rat.">Synaptic connectivity in medium spiny neurons of the nucleus accumbens: A sex-dependent mechanism underlying apathy in the HIV-1 transgenic rat.</a> Frontiers in Behavior Neurosciences. 12, 285 (2018).</li><li>Roscoe, R. F., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+transgenic+female+rat:+synaptodendritic+alterations+of+medium+spiny+neurons+in+the+nucleus+accumbens.">HIV-1 transgenic female rat: synaptodendritic alterations of medium spiny neurons in the nucleus accumbens.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 9 (5), 642-653 (2014).</li><li>Li, H., Aksenova, M., Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Booze, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Filamentous+Actin+(F-actin)+Puncta+in+Rat+Cortical+Neurons.">Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (108), e53697 (2016).</li><li>Rodriguez, A., Ehlenberger, D. B., Dickstein, D. L., Hof, P. R., Wearne, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+Three-Dimensional+Detection+and+Shape+Classification+of+Dendritic+Spines+from+Fluorescence+Microscopy+Images.">Automated Three-Dimensional Detection and Shape Classification of Dendritic Spines from Fluorescence Microscopy Images.</a> PLoS ONE. 3 (10), 1371 (2008).</li></ol>

I denne protokollen beskriver vi en allsidig merkingsteknikk for nevroner fra både rottehjernen og de som dyrkes in vitro. Videre rapporterer vi metodikken for bruk av nevronal rekonstruksjonprogramvare og nevronal rekonstruksjon kvantitativ analyseprogramvare for å vurdere nevronal morfologi og dendrittiske spines. Vurderingen av nevronal morfologi og dendrittiske spines gir en mulighet til å bestemme endringer i dendrittiske forgreningskompleksitet, nevronal arbor kompleksitet, dendrittisk ryggraden morfologi og syn...

I 2000 beskrev Gan et al. en rask merkingsteknikk for individuelle nevroner og glia i nervesystemet som kombinerte ulike lipofile fargestoffer, noe som muliggjør samtidig merking av mange hjerneceller med forskjellige farger1,2. Mer nylig ble en ballistisk merkingsteknikk beskrevet av Seabold et al.3 som introduserte fluorescerende fargestoffer (Dil) i nevronene i hjerneskiver. En allsidig fargeteknikk, ballistisk merking er verdsatt for sin evne til å bli utnyttet i flere dyrearter og over et bredt spekter av aldre. Videre kan det kombineres med immunfarging for å identifisere underpopulasjoner av hjerneceller3. Sammenlignet med tradisjonelle teknikker (f.eks. Golgi-Cox sølv impregnering, mikroinjeksjon)4, gir ballistisk merking en mulighet til å tydeligere skille morfologiske egenskaper, inkludert dendrittiske spines, en funksjon som er avgjørende for å tegne slutninger om nevronal kompleksitet og synaptisk tilkobling5.
Eksitatoriske pyramidale nevroner er preget av en enkelt, stor apical dendritt, flere kortere basal dendritter, og tusenvis av dendrittiske spines6. Pyramidale nevroner finnes i flere hjerneregioner relatert til høyere orden kognitiv behandling, inkludert prefrontal cortex (PFC) og hippocampus. I PFC observeres pyramidale nevroner i lag II/III og lag V, med hver utstilling av unik morfologi. Spesielt pyramidale nevroner i lag II / III av PFC har en kortere apical dendritt og mindre forgrening enn pyramidale nevroner i lag V6. Innenfor hippocampus, pyramidale nevroner ligger i både CA1 og CA3 regioner, med hver viser distinkte morfologier. Spesielt viser pyramidale nevroner i CA1-regionen en mer særegen apical dendritt, med forgrening som skjer lenger fra soma, i forhold til CA3-regionen6.
Dendrittiske spines på pyramidale nevroner i både PFC og hippocampus er det primære stedet for eksitatoriske synapser7. Morfologiske egenskaper av dendrittiske spines, som er klassisk preget i tre primære kategorier (dvs. tynn, stubby eller sopp8), har vært relatert til størrelsen på eksitatoriske synapse9. Tynne spines, preget av en lang, tynn hals, lite bulbous hode, og mindre postsynaptiske tettheter, er mer ustabile og utvikler svakere forbindelser. Imidlertid er soppspines, som har et større dendrittisk ryggradshode, anerkjent for å danne sterkere synaptiske forbindelser, en effekt som følge av deres større størrelse. I skarp kontrast er stubby spines blottet for en ryggradsnakke, og viser et omtrent lik hode- og nakkevolumforhold8. Innenfor hippocampus kan forgrenede spines også observeres, hvorved ryggraden har flere hoder som kommer fra samme dendrittiske ryggraden halsen10. Derfor kan morfologiske endringer av dendrittiske spines reflektere funksjonalitet og strukturell kapasitet. Videre har studier vist at størrelsen og formen på dendrittiske spines er knyttet til deres strukturelle plastisitet, noe som fører til ideen om at små spines er involvert i læring og oppmerksomhet, mens større, mer stabile spines, er involvert i langsiktige prosesser, inkludert minne11. I tillegg kan fordelingen av dendrittiske spines langs dendritten være forbundet med synaptisk tilkobling5,12.
Dermed har dagens metodiske papir tre mål: 1) Presenter vår protokoll for ballistisk merking, som har blitt benyttet med en suksessrate (dvs. nevroner som oppfyller utvalgskriteriene og egnet for analyse) på 83,3%5,12,13 og på tvers av flere hjerneregioner (dvs. PFC, nucleus accumbens, hippocampus); 2) Demonstrere generalizability av teknikken og dens anvendelse til nevroner dyrket in vitro; 3) Detalj metodikken som brukes i neuronal rekonstruksjon programvare og slutninger som kan trekkes fra slike data.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:868px;" width="869">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">20Gx25mm PrecisionGlide needle</td>
			<td style="width:263px;">BD</td>
			<td style="width:143px;">305175</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24-well cell culture plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">35 mm Glass Bottom Dishes</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-1.5-20-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Antibiotic-Antimycotic solution</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>30004CI</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">B-27 supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>50X</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Barrel liner</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Borax</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Boric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B0252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cartridge holder</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Confocal imaging software</td>
			<td style="width:263px;">Nikon</td>
			<td style="width:143px;">EZ-C1</td>
			<td>version 3.81b</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:263px;">Nikon</td>
			<td style="width:143px;">TE-2000E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cover glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>637-137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DilC18(3)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM/F12 medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10565-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dumont #5 Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dumont #7 Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">F344 rat</td>
			<td style="width:263px;">(Harlan Laboratories, Indianapolis, IN)</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glucose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>101174Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GlutaMax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HBSS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4641</td>
			<td>10X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Helios diffusion screens</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Helios gene gun kit</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Helios gene gun system</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Helium hose assembly</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Iris Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>15914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Iris Scissors</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methylene chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D150-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Neurobasal medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Neurolucida 360 software</td>
			<td style="width:263px;">mbf bioscience</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td>dendritic spine analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyvinylpyrrolidone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>5295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ProLong Gold antifade reagent</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P36930</td>
			<td>mounting medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat brain matrix, 300 - 600g, Coronal, 0.5mm</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>15047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sevoflurane</td>
			<td>Merritt Veterinary Supply</td>
			<td>347075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SuperFrost Plus Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-154%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe kit</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tefzel tubing</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tubing cutter</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tubing Prep station</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tungsten M-25 Microcarrier 1.7 &#181;m</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vannas Scissors</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500086</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ballistic labeling of pyramidal neurons in brain slices and in primary cell culture

Det har blitt rapportert at størrelsen og formen på dendrittiske spines er relatert til deres strukturelle plastisitet. For å identifisere den morfologiske strukturen til pyramidale nevroner og dendrittiske spines, kan en ballistisk merkingsteknikk benyttes. I den nåværende protokollen er pyramidale nevroner merket med DilC18(3) farog analysert ved hjelp av nevronal rekonstruksjonsprogramvare for å vurdere nevronal morfologi og dendrittiske spines. For å undersøke nevronal struktur utføres dendrittitisk forgreningsanalyse og Sholl-analyse, slik at forskere kan trekke slutninger om dendrittitisk forgrening skantkompleksitet og nevronal arbor kompleksitet, henholdsvis. Evalueringen av dendrittiske spines utføres ved hjelp av en automatisk assistert klassifiseringsalgoritme integrert i rekonstruksjonsprogramvaren, som klassifiserer spines i fire kategorier (dvs. tynn, sopp, stubby, filopodia). Videre velges ytterligere tre parametere (dvs. lengde, hodediameter og volum) også for å vurdere endringer i dendrittisk ryggradmorfologi. For å validere potensialet for bred anvendelse av den ballistiske merkingsteknikken, ble pyramidale nevroner fra in vitro cellekultur merket. Samlet sett er den ballistiske merkingsmetoden unik og nyttig for å visualisere nevroner i forskjellige hjerneregioner hos rotter, som i kombinasjon med sofistikert rekonstruksjonsprogramvare gjør det mulig for forskere å belyse de mulige mekanismene som ligger til grunn for nevrokognitiv dysfunksjon.

I figur 2Able de typiske pyramidale nevronene i hippocampalregionen i rottehjerneseksjonene identifisert av ballistisk merkingsteknologi, preget av en stor apical dendritt og flere mindre basal dendritter rundt soma. Figur 2B viser nevronen i den kvantitative analyseprogramvaren for nevronal rekonstruksjon etter at soma ble oppdaget, dendrittiske grener ble sporet, og spines ble oppdaget. Deretter ble dataene analysert ved hjelp av nevronal rekonstruksjon kvanti...

Watch this Scientific Journal Video about Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture at JoVE.com

Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture

Vi presenterer en protokoll for å merke og analysere pyramidale nevroner, noe som er avgjørende for å evaluere potensielle morfologiske endringer i nevroner og dendrittiske spines som kan ligge til grunn for nevrokjemiske og atferdsmessige abnormiteter.

Ballistisk merking av pyramidale nevroner i hjerneskiver og i primær cellekultur

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of ...

Denne protokollen gjør det mulig å evaluere potensielle morfologiske endringer i nevroner og dendrittiske spines som kan understreke nevrokjemiske og atferdsmessige abnormiteter. Det er unikt og nyttig for å visualisere nevroner i forskjellige hjerneregioner hos rotter, som i kombinasjon med sofistikert rekonstruksjonsprogramvare gjør det mulig for forskere å belyse mulige mekanismer underliggende nevrokognitiv dysfunksjon. Begynn med å forberede PVP-løsning i henhold til manuskriptretninger.Fyll slangen med PVP og la det stå i 20 minutter. Og utvise den gjennom den andre enden med en 10 milliliter sprøyte. Kombiner 170 milligram wolfram mikrokarrierperler med 250 mikroliter metylenklorid.Deretter grundig virvle suspensjonen. Deretter legger du til 6 milligram lipofil DilC18 (3) fargestoff til 300 mikroliter metylenklorid og vortex. Pipet 250 mikroliter av wolfram perle suspensjon på et glass lysbilde.Vent til suspensjonen skal lufttørke og tilsett 300 mikroliter av fargestoffoppløsningen. Når den er tørket, bruk en barberhøvel til å dele blandingen i to 1,5 milliliter sentrifugerør og fyll rørene med vann. Sonicate blandingen i et vannbad til homogen.Pass på at sonicator spissen ligger direkte på rørene. Kombiner de to blandingene i et 15 milliliter konisk rør. Og sonikere i ytterligere tre minutter, og pass på at ingen store klumper av fargestoffbelagte perler forblir.Etter sonikering trekker du blandingen inn i PVP-belagte rør med en 10 milliliter sprøyte. Og mate slangen inn i forberedelsesstasjonen. Roter slangen i ett minutt.Fjern forsiktig alt vannet med en sprøyte. Slå på nitrogengassen og juster nitrogenstrømmen til ca. 0,5 liter per minutt. Roter slangen i tilberedningsstasjonen og tørk den med nitrogen i 30 minutter.Fjern slangen fra stasjonen og kutt den i 13 millimeter segmenter med en rørkutter. Pass på at rotten ikke reagerer på skadelige stimuli og reflekser er fraværende. Fest den deretter i liggende stilling.Lag et snitt langs thoraxmidline. Skill membranen og åpne brystet med saks. Sett deretter inn en 20 gauge 25 millimeter nål i venstre ventrikkel.Klipp umiddelbart høyre atrium med saks og perfuse 15 milliliter på 100 millimolar PBS med en 5 millimeter per minutt strømningshastighet. Deretter perfuse 100 milliliter på 4% PFA bufret i PBS. Etter perfusjon, fjern hele rottehjernen.Og postfix det med 4% PFA i 10 minutter. Bruk en rotte hjernematrise til å kutte 500 mikrometer tykk koronar seksjon. Lag en knyttneve kutt og holde bladet på plass.Deretter gjør et ekstra kutt med et annet blad og vertikalt fjerne det første bladet, holde vevet på bladoverflaten. Legg hjerneskivene i 24-brønnplaten med 1 milliliter PBS i hver brønn. Og gjenta prosessen til alle skiver er kuttet.Fjern PBS fra hver målrettet brønn. Legg brusken med dil/wolframrør og plasser den i applikatoren. Sett et stykke filterpapir mellom de to nettingskjermene.Og koble applikatoren til heliumslangen. Juster deretter utgangstrykket på helium til 90 pounds per kvadrattomme. Plasser applikatoren vertikalt på midten av den målrettede brønnen 1,5 centimeter mellom prøven og nettingskjermen.Deretter avfyrer du Dil/wolfram-slangen. Last brusk med neste rør og fyr kontinuerlig perlene fra slangen på de resterende skivene. Fyll 24-brønnsplaten med 100 millimolar PBS.Og vask skivene tre ganger med 500 mikroliter frisk PBS. Pass på at skivene ikke snus under vasken. Når du er ferdig, legg til 500 mikroliter frisk PBS til skivene.Og inkuber dem i tre timer ved fire grader Celsius i mørket. Etter inkubasjonen, bruk en fin børste til å overføre hjerneskiver på glasssklier. Og legg umiddelbart til en milliliter antifademonteringsmedium til hver seksjon.Plasser en 22 og 15 millimeter deksler over seksjonene og tørk lysbildene i mørket. Slå på det konfokale mikroskopsystemet og bytt til et 60X-mål. Juster bildeinnstillingene i henhold til manuskriptinstruksjonene.Og få Z-stack bilder for målrettet neuron type basert på hjernen region grenser og morfologiske egenskaper nevroner. Isoler primære kortikale nevron fra F344/N rotter på postnatal dag én og kultur dem i en 35 millimeter glass bunnrett i en uke. Forfriskende halvparten av mediet på den tredje dagen etter isolasjon.Vask fatet to ganger med 1 milliliter 100 millimolar PBS. Og fikse cellene med 4% PFA i 15 minutter ved romtemperatur. Ballistisk merke cellene som tidligere beskrevet.Og vask dem tre ganger til med 1 milliliter PBS. Tilsett 500 mikroliter PBS til cellene og inkuber dem i tre timer ved fire grader Celsius i mørket. Tilsett deretter 200 mikroliter antifademonteringsmedium.Og få Z-stack bilder for hver målrettet nevron. Typiske pyramidale nevroner i hippocampal regionen i rotte hjerneseksjoner ble identifisert med ballistisk merking teknologi preget av en stor apical dendritt og flere mindre basal dendritt rundt soma. Neuronal rekonstruksjon kvantitativ analyse programvare ble brukt til å spore dendrittiske grener og oppdage spines.Deretter ble programvaren brukt til å vurdere dendrittiske forgreningskompleksiteten og nevronal arborkompleksitet. Morfologiske endringer i dendrittiske spines ble vurdert ved hjelp av lengde, volum og hodediameter. Deretter ble spines klassifisert i tynne, stubby, og sopp spines.Og den relative frekvensen av antall spines mellom hver radius ble undersøkt. Videre ble den ballistiske merkingsteknikken validert på et primært pyramidenevron i cellekulturen. Pyramidale nevroner ble identifisert basert på trekantformen til soma og stor apical dendritt.Deretter ble neuronal rekonstruksjonsprogramvare brukt til å analysere fordelingen av tynne dendrittiske spines og dendrittisk ryggradslengde. Når du prøver denne protokollen, er det viktig å unngå store klumper eller klynger av ballistiske fargestoffbelagte wolframperler som starter forberedelse. Klumper ville ikke tillate individuelle nevroner å skilles ut.Kombinert med nevronal rekonstruksjon programvare denne metoden tillater oss å undersøke nevronale og dendrittiske ryggraden morfologi i hippocampal pyramidale nevroner. Neuronal rekonstruksjon programvare benytter en algoritme for å tilby automatisk assistert klassifisering av dendrittiske spines. Kvantifiseringen av flere nevronale parametere gir en mulighet til å bedre forstå mekanismen underliggende nevronal kognitiv dysfunksjon.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde Fluorescent Merking Tillater målrettet Ekstracellulær Single-enhet Opptak fra Identifiserte Nerveceller<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Bildebehandling Kalsium Responses i GFP-merket Neurons av hypothalamus mus hjernen Slices

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

Spenning-sensitive Dye Opptak fra Axoner, dendritter og dendrittiske spines av enkelte nerveceller i hjernen skiver

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Dual Elektrofysiologiske Opptak av Synaptically-fremkalt Astroglial og Neuronal Responses i akutt hippocampus Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Primær Culture of Mouse dopaminerge nevroner

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Sammenkoblede hele cellen Recordings i organotypic hippocampus Slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Isolasjon, Kultur og langsiktig vedlikehold av Primary mesencefalisk dopaminerge nevroner Fra Embryonic Gnagere Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Hel-celle Patch-clamp Recordings i hjernen skiver

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...