Name: ballistic labeling of pyramidal neurons in brain slices and in primary cell culture
Uploaded: 2020-04-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture at JoVE.com

Este trabalho foi financiado pelas subvenções do NIH HD043680, MH106392, DA013137 e NS100624.

Todos os protocolos de animais foram revisados e aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade da Carolina do Sul (número de garantia federal: D16-00028).
1. Preparação da tubulação de dii/tungstênio
<ol><li>Dissolver 100 mg de polivinilpirrolido (PVP) com 10 mL de ddH2O. Vortex a solução PVP levemente.</li>
	<li>Encha a tubulação com a solução PVP (ver Tabela de Materiais) e deixe-a por 20 min. Em seguida, expulse a solução PVP...

<ol>
	<li>Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+"DiOlistic"+labeling+of+the+nervous+system+using+lipophilic+dye+combinations.">Multicolor "DiOlistic" labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations.</a> Neuron. 27, 219-225 (2000).</li><li>Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, R. O., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ballistic+delivery+of+dyes+for+structural+and+functional+studies+of+the+nervous+system.">Ballistic delivery of dyes for structural and functional studies of the nervous system.</a> Cold Spring Harbor Protocol. 2009 (4), 5202 (2009).</li><li>Seabold, G. K., Daunais, J. B., Rau, A., Grant, K. A., Alvarez, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DiOLISTIC+labeling+of+neurons+from+rodent+and+non-human+primate+brain+slices.">DiOLISTIC labeling of neurons from rodent and non-human primate brain slices.</a> Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).</li><li>Spacek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+the+Golgi+method:+a+time-lapse+study+of+the+early+stages+of+impregnation+in+single+sections.">Dynamics of the Golgi method: a time-lapse study of the early stages of impregnation in single sections.</a> Journal of Neurocytology. 18 (1), 27-38 (1989).</li><li>McLaurin, K. A., Li, H., Booze, R. M., Mactutus, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+Timing:+NeuroHIV+Progression+in+the+Post-cART+Era.">Disruption of Timing: NeuroHIV Progression in the Post-cART Era.</a> Science Reports. 9 (1), 827 (2019).</li><li>Spruston, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyramidal+neurons:+dendritic+structure+and+synaptic+integration.">Pyramidal neurons: dendritic structure and synaptic integration.</a> Nature Reviews Neurosciences. 9 (3), 206-221 (2008).</li><li>Megias, M., Emri, Z., Freund, T. F., Gulyas, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+number+and+distribution+of+inhibitory+and+excitatory+synapses+on+hippocampal+CA1+pyramidal+cells.">Total number and distribution of inhibitory and excitatory synapses on hippocampal CA1 pyramidal cells.</a> Neuroscience. 102, 527-540 (2001).</li><li>Peters, A., Kaiserman-Abramof, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+small+pyramidal+neuron+of+the+rat+cerebral+cortex.+The+perikaryon,+dendrites+and+spines.">The small pyramidal neuron of the rat cerebral cortex. The perikaryon, dendrites and spines.</a> American Journal of Anatomy. 127, 321-355 (1970).</li><li>Harris, K. M., Sultan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+the+number,+location,+and+size+of+synaptic+vesicles+provides+an+anatomical+basis+for+the+nonuniform+probability+of+release+at+hippocampal+CA1+synapses.">Variation in the number, location, and size of synaptic vesicles provides an anatomical basis for the nonuniform probability of release at hippocampal CA1 synapses.</a> Neuropharmacology. 34, 1387-1395 (1995).</li><li>Sorra, K. E., Fiala, J. C., Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+assessment+of+the+involvement+of+perforations,+spinules,+and+spine+branching+in+hippocampal+synapse+formation.">Critical assessment of the involvement of perforations, spinules, and spine branching in hippocampal synapse formation.</a> Journal of Comparative Neurology. 398, 225-240 (1998).</li><li>Mancuso, J. J., Chen, Y., Li, X., Xue, Z., Wong, S. T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+dendritic+spine+detection:+from+Golgi+to+high-resolution+optical+imaging.">Methods of dendritic spine detection: from Golgi to high-resolution optical imaging.</a> Neuroscience. 251, 129-140 (2012).</li><li>McLaurin, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+connectivity+in+medium+spiny+neurons+of+the+nucleus+accumbens:+A+sex-dependent+mechanism+underlying+apathy+in+the+HIV-1+transgenic+rat.">Synaptic connectivity in medium spiny neurons of the nucleus accumbens: A sex-dependent mechanism underlying apathy in the HIV-1 transgenic rat.</a> Frontiers in Behavior Neurosciences. 12, 285 (2018).</li><li>Roscoe, R. F., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+transgenic+female+rat:+synaptodendritic+alterations+of+medium+spiny+neurons+in+the+nucleus+accumbens.">HIV-1 transgenic female rat: synaptodendritic alterations of medium spiny neurons in the nucleus accumbens.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 9 (5), 642-653 (2014).</li><li>Li, H., Aksenova, M., Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Booze, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Filamentous+Actin+(F-actin)+Puncta+in+Rat+Cortical+Neurons.">Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (108), e53697 (2016).</li><li>Rodriguez, A., Ehlenberger, D. B., Dickstein, D. L., Hof, P. R., Wearne, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+Three-Dimensional+Detection+and+Shape+Classification+of+Dendritic+Spines+from+Fluorescence+Microscopy+Images.">Automated Three-Dimensional Detection and Shape Classification of Dendritic Spines from Fluorescence Microscopy Images.</a> PLoS ONE. 3 (10), 1371 (2008).</li></ol>

Neste protocolo, descrevemos uma técnica de rotulagem versátil para neurônios tanto do cérebro de ratos quanto daqueles cultivados in vitro. Além disso, relatamos a metodologia de utilização do software de reconstrução neuronal e do software de análise quantitativa de reconstrução neuronal para avaliar a morfologia neuronal e as espinhas dendríticas. A avaliação da morfologia neuronal e das espinhas dendríticas fornece uma oportunidade para determinar alterações na complexidade de ramificação dendrít...

Em 2000, Gan et al. descreveram uma técnica de rotulagem rápida para neurônios individuais e glia no sistema nervoso que combinava vários corantes lipofílicos, permitindo a rotulagem simultânea de muitas células cerebrais com cores diferentes1,2. Mais recentemente, uma técnica de rotulagem balística foi descrita por Seabold et al.3 que introduziu corantes fluorescentes (Dil) nos neurônios das fatias cerebrais. Uma técnica versátil de coloração, a rotulagem balística é apreciada por sua capacidade de ser utilizada em múltiplas espécies animais e em uma ampla gama de idades. Além disso, pode ser combinado com imunocoloração para identificar subpopulações de células cerebrais3. Em comparação com as técnicas tradicionais (por exemplo, impregnação de prata golgi-cox, microinjeção)4, a rotulagem balística oferece uma oportunidade para distinguir mais claramente características morfológicas, incluindo colunas dendríticas, característica que é fundamental para desenhar inferências sobre complexidade neuronal e conectividade sináptica5.
Neurônios piramidais excitatórios são caracterizados por um único, grande dendrito apical, múltiplos dendritos basais mais curtos, e milhares de espinhas dendríticas6. Neurônios piramidais são encontrados em múltiplas regiões cerebrais relacionadas ao processamento cognitivo de ordem superior, incluindo o córtex pré-frontal (PFC) e o hipocampo. No PFC, os neurônios piramidais são observados nas camadas II/III e camada V, com cada um apresentando morfologia única. Especificamente, os neurônios piramidais na camada II/III do PFC têm um dendrito apical mais curto e menos ramificação do que os neurônios piramidais na camada V6. Dentro do hipocampo, os neurônios piramidais estão localizados nas regiões CA1 e CA3, com cada uma exibindo morfologias distintas. Especificamente, os neurônios piramidais na região ca1 apresentam um dendrito apical mais distinto, com ramificações ocorrendo mais longe do soma, em relação à região ca36.
Espinhos dendréticos em neurônios piramidais tanto no PFC quanto no hipocampo são o local principal das sinapses excitatórias7. As características morfológicas das espinhas dendríticas, que são classicamente caracterizadas em três categorias primárias (ou seja, finas, stubby ou cogumelo8), foram relacionadas com o tamanho da sinapse excitatória9. Espinhos finos, caracterizados por um pescoço longo e fino, cabeça bulbosa pequena e densidades postynapticas menores, são mais instáveis e desenvolvem conexões mais fracas. No entanto, as espinhas de cogumelos, que têm uma cabeça de coluna dendrítica maior, são reconhecidas por formar conexões sinápticas mais fortes, um efeito resultante de seu tamanho maior. Em contraste acentuado, as espinhas stubby são desprovidas de um pescoço de coluna, exibindo uma razão de volume de cabeça e pescoço aproximadamente igual8. Dentro do hipocampo, espinhos ramificados também podem ser observados, pelo qual a coluna vertebral tem múltiplas cabeças que emergem do mesmo pescoço dendrítico10. Portanto, as mudanças morfológicas das espinhas dendríticas poderiam refletir a funcionalidade e a capacidade estrutural. Além disso, estudos têm demonstrado que o tamanho e a forma das espinhas dendríticas estão relacionados à sua plasticidade estrutural, levando à ideia de que pequenas espinhas estão envolvidas na aprendizagem e na atenção, enquanto espinhas maiores e mais estáveis estão envolvidas em processos de longo prazo, incluindo a memória11. Além disso, a distribuição de espinhos dendréticos ao longo do dendrito pode estar associada à conectividade sináptica5,12.
Assim, o presente trabalho metodológico tem três metas: 1) Apresentar nosso protocolo de rotulagem balística, que tem sido utilizado com uma taxa de sucesso (ou seja, neurônios atendendo aos critérios de seleção e apropriados para análise) de 83,3%5,12,13 e em múltiplas regiões cerebrais (ou seja, PFC, núcleo accumbens, hipocampo); 2) Demonstrar a generalização da técnica e sua aplicação aos neurônios cultivados in vitro; 3) Detalhe a metodologia utilizada no software de reconstrução neuronal e as inferências que podem ser extraídas desses dados.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:868px;" width="869">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">20Gx25mm PrecisionGlide needle</td>
			<td style="width:263px;">BD</td>
			<td style="width:143px;">305175</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24-well cell culture plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">35 mm Glass Bottom Dishes</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-1.5-20-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Antibiotic-Antimycotic solution</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>30004CI</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">B-27 supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>50X</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Barrel liner</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Borax</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Boric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B0252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cartridge holder</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Confocal imaging software</td>
			<td style="width:263px;">Nikon</td>
			<td style="width:143px;">EZ-C1</td>
			<td>version 3.81b</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:263px;">Nikon</td>
			<td style="width:143px;">TE-2000E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cover glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>637-137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DilC18(3)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM/F12 medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10565-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dumont #5 Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dumont #7 Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">F344 rat</td>
			<td style="width:263px;">(Harlan Laboratories, Indianapolis, IN)</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glucose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>101174Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GlutaMax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HBSS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4641</td>
			<td>10X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Helios diffusion screens</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Helios gene gun kit</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Helios gene gun system</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Helium hose assembly</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Iris Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>15914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Iris Scissors</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methylene chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D150-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Neurobasal medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Neurolucida 360 software</td>
			<td style="width:263px;">mbf bioscience</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td>dendritic spine analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyvinylpyrrolidone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>5295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ProLong Gold antifade reagent</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P36930</td>
			<td>mounting medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat brain matrix, 300 - 600g, Coronal, 0.5mm</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>15047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sevoflurane</td>
			<td>Merritt Veterinary Supply</td>
			<td>347075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SuperFrost Plus Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-154%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe kit</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tefzel tubing</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tubing cutter</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tubing Prep station</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tungsten M-25 Microcarrier 1.7 &#181;m</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vannas Scissors</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500086</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ballistic labeling of pyramidal neurons in brain slices and in primary cell culture

Foi relatado que o tamanho e a forma das espinhas dendríticas estão relacionados com sua plasticidade estrutural. Para identificar a estrutura morfológica de neurônios piramidais e espinhos dendrípticos, uma técnica de rotulagem balística pode ser utilizada. No presente protocolo, os neurônios piramidais são rotulados com tintura DilC18(3) e analisados usando software de reconstrução neuronal para avaliar a morfologia neuronal e as espinhas dendríticas. Para investigar a estrutura neuronal, são realizadas análises de ramificação dendríticas e análise de Sholl, permitindo que os pesquisadores desenhem inferências sobre a complexidade de ramificação dendrítica e a complexidade da árvore neuronal, respectivamente. A avaliação das espinhas dendríticas é realizada utilizando-se um algoritmo de classificação assistida automática integral ao software de reconstrução, que classifica as espinhas em quatro categorias (ou seja, fina, cogumelo, stubby, filopodia). Além disso, três parâmetros adicionais (ou seja, comprimento, diâmetro da cabeça e volume) também são escolhidos para avaliar alterações na morfologia da coluna vertebral dendrítica. Para validar o potencial de ampla aplicação da técnica de rotulagem balística, neurônios piramidais da cultura celular in vitro foram rotulados com sucesso. No geral, o método de rotulagem balística é único e útil para visualizar neurônios em diferentes regiões cerebrais em ratos, o que, em combinação com um sofisticado software de reconstrução, permite aos pesquisadores elucidar os possíveis mecanismos subjacentes disfunção neurocognitiva.

Na Figura 2A,os neurônios piramidais típicos na região hipocampal nas seções cerebrais de ratos foram identificados pela tecnologia de rotulagem balística, caracterizada por um grande dendrito apical e vários dendritos basais menores ao redor do soma. A Figura 2B mostra o neurônio no software de análise quantitativa da reconstrução neuronal após a destécnica, os ramos dendréticos foram rastreados e as espinhas foram detectadas. Posteriormente, os d...

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Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture

Apresentamos um protocolo para rotular e analisar neurônios piramidais, o que é fundamental para avaliar possíveis alterações morfológicas em neurônios e espinhas dendríticas que podem estar por trás de anormalidades neuroquímicas e comportamentais.

Rotulagem Balística de Neurônios Piramidais em Fatias Cerebrais e na Cultura Celular Primária

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of ...

Este protocolo permite avaliar possíveis alterações morfológicas em neurônios e colunas dendríticas que podem sublinhar anormalidades neuroquímicas e comportamentais. É único e útil para visualizar neurônios em diferentes regiões cerebrais em ratos, o que, em combinação com sofisticados softwares de reconstrução, permite aos pesquisadores elucidar os possíveis mecanismos subjacentes à disfunção neurocognitiva. Comece preparando a solução PVP de acordo com as instruções do manuscrito.Encha a tubulação com PVP e deixe-a por 20 minutos. E expulsá-lo pela outra extremidade com uma seringa de 10 mililitros. Combine 170 miligramas de contas de microcarrier de tungstênio com 250 microliters de cloreto de metileno.Em seguida, completamente vórtice a suspensão. Em seguida, adicione 6 miligramas de dilc18 lipofílico(3)corante a 300 microliters de cloreto de metileno e vórtice. Pipet 250 microliters da suspensão do tungstênio em uma lâmina de vidro.Aguarde a suspensão para secar o ar e adicione 300 microliters da solução de corante. Uma vez seco, use uma navalha para dividir a mistura em dois tubos de centrífugas de 1,5 mililitro e encha os tubos com água. Sonicar a mistura em um banho de água até ficar homogêneo.Certificando-se de que a ponta do sonicator está diretamente nos tubos. Misture as duas misturas em um tubo cônico de 15 mililitros. E sonicate por mais três minutos, certificando-se de que não restam grandes moitas de contas revestidas de corante.Após a sônicação, desenhe a mistura na tubulação revestida PVP com uma seringa de 10 mililitros. E alimente a tubulação na estação de preparação. Gire a tubulação por um minuto.Remova cuidadosamente toda a água usando uma seringa. Ligue o gás nitrogênio e ajuste o fluxo de nitrogênio para aproximadamente 0,5 litros por minuto. Gire a tubulação na estação de preparação e seque-a com nitrogênio por 30 minutos.Retire a tubulação da estação e corte-a em segmentos de 13 milímetros com um cortador de tubulação. Certifique-se de que o rato não está respondendo a estímulos nocivos e os reflexos estão ausentes. Em seguida, fixá-lo na posição supina.Faça uma incisão ao longo da linha média torácica. Separe o diafragma e abra o peito com uma tesoura. Em seguida, insira uma agulha de calibre 20 de 25 milímetros no ventrículo esquerdo.Corte imediatamente o átrio direito com uma tesoura e perfunda 15 mililitros de PBS de 100 mililitros com uma taxa de fluxo de 5 milímetros por minuto. Em seguida, perfuse 100 mililitros de 4%PFA tamponado em PBS. Após a perfusão, remova todo o cérebro de rato.E postfixá-lo com 4%PFA por 10 minutos. Use uma matriz cerebral de rato para cortar 500 micrômetros de espessura seção coronal. Faça um corte de punho e mantenha a lâmina no lugar.Em seguida, faça um segundo corte com uma segunda lâmina e remova verticalmente a primeira lâmina, mantendo o tecido na superfície da lâmina. Coloque as fatias cerebrais na placa de 24 poços com 1 mililitro de PBS em cada poço. E repita o processo até que todas as fatias tenham sido cortadas.Remova o PBS de cada alvo bem. Carregue a cartilagem com um pedaço de tubo de dil/tungstênio e coloque-a no aplicador. Coloque um pedaço de papel filtro entre as duas telas de malha.E conecte o aplicador à mangueira de hélio. Em seguida, ajuste a pressão de saída do hélio para 90 libras por polegada quadrada. Coloque o aplicador verticalmente no centro do poço direcionado de 1,5 centímetros entre a amostra e a tela de malha.Em seguida, dispare o tubo dil/tungstênio. Carregue a cartilagem com o tubo seguinte e atire continuamente as contas da tubulação nas fatias restantes. Encha a placa de 24 poços com PBS de 100 mililitros.E lave as fatias três vezes com 500 microliters de PBS fresco. Certifique-se de que as fatias não se virem durante a lavagem. Quando terminar, adicione 500 microliters de PBS fresco às fatias.E incuba-los por três horas a quatro graus Celsius no escuro. Após a incubação, use um pincel fino para transferir as fatias cerebrais para lâminas de vidro. E adicione imediatamente um mililitro de meio de montagem antifade a cada seção.Coloque uma cobertura de 22 por 15 milímetros sobre as seções e seque as lâminas no escuro. Ligue o sistema de microscópio confocal e mude para um objetivo de 60X. Ajuste as configurações de imagem de acordo com as instruções do manuscrito.E obter imagens de pilha Z para o tipo de neurônio alvo com base nos limites da região cerebral e características morfológicas dos neurônios. Isole o neurônio cortical primário dos ratos F344/N no primeiro dia pós-natal e cultue-os em um prato de fundo de vidro de 35 milímetros por uma semana. Refrescar metade do meio no terceiro dia após o isolamento.Lave o prato duas vezes com 1 mililitro de 100 mililitros PBS. E conserte as células com 4% de PFA por 15 minutos em temperatura ambiente. Rotular balísticamente as células como descrito anteriormente.E lave-os mais três vezes com 1 mililitro de PBS. Adicione 500 microliters de PBS às células e incuba-os por três horas a quatro graus Celsius no escuro. Em seguida, adicione 200 microliters de meio de montagem antifade.E obter imagens de pilha Z para cada neurônio alvo. Neurônios típicos do hipódromo na região hipocampal nas seções cerebrais de ratos foram identificados com tecnologia de rotulagem balística caracterizada por um grande dendrito apical e vários dendritos basais menores ao redor da soma. O software de análise quantitativa de reconstrução neuronal foi utilizado para rastrear ramos dendríticos e detectar colunas.Posteriormente, o software foi utilizado para avaliar a complexidade dendrítica da ramificação e a complexidade da arbórea neuronal. Alterações morfológicas nas espinhas dendríticas foram avaliadas utilizando-se comprimento, volume e diâmetro da cabeça. Em seguida, as espinhas foram classificadas em espinhos finos, stubby e cogumelos.E a frequência relativa do número de espinhos entre cada raio foi examinada. Além disso, a técnica de rotulagem balística foi validada em um neurônio piramim primário na cultura celular. Neurônios piramidais foram identificados com base na forma do triângulo da soma e grande dendrite apical.Em seguida, foi utilizado um software de reconstrução neuronal para analisar a distribuição de espinhos dendráticos finos e comprimento da coluna dendrítica. Ao tentar este protocolo, é importante evitar grandes aglomerados ou aglomerados de contas de tungstênio revestidas de corante balístico iniciando a preparação. Aglomerados não permitiriam que neurônios individuais fossem distinguidos.Combinado com o software de reconstrução neuronal, este método nos permite examinar a morfologia da coluna neuronal e dendrítica em neurônios piramifetais hipocampais. O software de reconstrução neuronal utiliza um algoritmo para oferecer classificação assistida automática de espinhas dendríticas. A quantificação de múltiplos parâmetros neuronais oferece uma oportunidade para entender melhor o mecanismo subjacente à disfunção cognitiva neuronal.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Dissecção e Cultura de Neurônios da Medula Espinhal comissural embrionárias

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Neurociência

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

Labeling DiOLISTIC de Neurônios de roedores e não-humanos fatias do cérebro do primata

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Labeling fluorescentes retrógrada Permite alvejado Extracelular Gravação Single-unidade dos neurônios identificados<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Respostas de imagem de cálcio nos neurônios GFP-tagged fatias de cérebro de rato Hipotalâmicos

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

Tensão sensível Gravação Dye de axônios, dendritos e espinhas dendríticas de neurônios individuais em fatias de cérebro

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Dois registros eletrofisiológicos de sinapticamente evocadas Respostas astroglial e neuronal em fatias hipocampais agudas

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Cultura primária de neurônios dopaminérgicos mouse

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Emparelhados Recordings células inteiras em organotï¿½icas fatias do hipocampo

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Isolamento, cultura e Long-Term Manutenção da Primária mesencefálico Dopaminergic neurônios dos cérebros de roedores Embryonic

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Gravações de células inteiras de patch-clamp em Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...