Name: ballistic labeling of pyramidal neurons in brain slices and in primary cell culture
Uploaded: 2020-04-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture at JoVE.com

Эта работа финансировалась за счет грантов NIH HD043680, MH106392, DA013137 и NS100624.

Все протоколы о животных были рассмотрены и утверждены Комитетом по уходу за животными и использованию в Университете южной Каролины (федеральный номер гарантии: D16-00028).
1. Приготовление труб diI/вольфрама из биса
<ol><li>Растворите 100 мг поливинилпирролидона (PVP) с 10 мл ddH2</s...

<ol>
	<li>Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+"DiOlistic"+labeling+of+the+nervous+system+using+lipophilic+dye+combinations.">Multicolor "DiOlistic" labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations.</a> Neuron. 27, 219-225 (2000).</li><li>Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, R. O., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ballistic+delivery+of+dyes+for+structural+and+functional+studies+of+the+nervous+system.">Ballistic delivery of dyes for structural and functional studies of the nervous system.</a> Cold Spring Harbor Protocol. 2009 (4), 5202 (2009).</li><li>Seabold, G. K., Daunais, J. B., Rau, A., Grant, K. A., Alvarez, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DiOLISTIC+labeling+of+neurons+from+rodent+and+non-human+primate+brain+slices.">DiOLISTIC labeling of neurons from rodent and non-human primate brain slices.</a> Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).</li><li>Spacek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+the+Golgi+method:+a+time-lapse+study+of+the+early+stages+of+impregnation+in+single+sections.">Dynamics of the Golgi method: a time-lapse study of the early stages of impregnation in single sections.</a> Journal of Neurocytology. 18 (1), 27-38 (1989).</li><li>McLaurin, K. A., Li, H., Booze, R. M., Mactutus, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+Timing:+NeuroHIV+Progression+in+the+Post-cART+Era.">Disruption of Timing: NeuroHIV Progression in the Post-cART Era.</a> Science Reports. 9 (1), 827 (2019).</li><li>Spruston, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyramidal+neurons:+dendritic+structure+and+synaptic+integration.">Pyramidal neurons: dendritic structure and synaptic integration.</a> Nature Reviews Neurosciences. 9 (3), 206-221 (2008).</li><li>Megias, M., Emri, Z., Freund, T. F., Gulyas, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+number+and+distribution+of+inhibitory+and+excitatory+synapses+on+hippocampal+CA1+pyramidal+cells.">Total number and distribution of inhibitory and excitatory synapses on hippocampal CA1 pyramidal cells.</a> Neuroscience. 102, 527-540 (2001).</li><li>Peters, A., Kaiserman-Abramof, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+small+pyramidal+neuron+of+the+rat+cerebral+cortex.+The+perikaryon,+dendrites+and+spines.">The small pyramidal neuron of the rat cerebral cortex. The perikaryon, dendrites and spines.</a> American Journal of Anatomy. 127, 321-355 (1970).</li><li>Harris, K. M., Sultan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+the+number,+location,+and+size+of+synaptic+vesicles+provides+an+anatomical+basis+for+the+nonuniform+probability+of+release+at+hippocampal+CA1+synapses.">Variation in the number, location, and size of synaptic vesicles provides an anatomical basis for the nonuniform probability of release at hippocampal CA1 synapses.</a> Neuropharmacology. 34, 1387-1395 (1995).</li><li>Sorra, K. E., Fiala, J. C., Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+assessment+of+the+involvement+of+perforations,+spinules,+and+spine+branching+in+hippocampal+synapse+formation.">Critical assessment of the involvement of perforations, spinules, and spine branching in hippocampal synapse formation.</a> Journal of Comparative Neurology. 398, 225-240 (1998).</li><li>Mancuso, J. J., Chen, Y., Li, X., Xue, Z., Wong, S. T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+dendritic+spine+detection:+from+Golgi+to+high-resolution+optical+imaging.">Methods of dendritic spine detection: from Golgi to high-resolution optical imaging.</a> Neuroscience. 251, 129-140 (2012).</li><li>McLaurin, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+connectivity+in+medium+spiny+neurons+of+the+nucleus+accumbens:+A+sex-dependent+mechanism+underlying+apathy+in+the+HIV-1+transgenic+rat.">Synaptic connectivity in medium spiny neurons of the nucleus accumbens: A sex-dependent mechanism underlying apathy in the HIV-1 transgenic rat.</a> Frontiers in Behavior Neurosciences. 12, 285 (2018).</li><li>Roscoe, R. F., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+transgenic+female+rat:+synaptodendritic+alterations+of+medium+spiny+neurons+in+the+nucleus+accumbens.">HIV-1 transgenic female rat: synaptodendritic alterations of medium spiny neurons in the nucleus accumbens.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 9 (5), 642-653 (2014).</li><li>Li, H., Aksenova, M., Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Booze, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Filamentous+Actin+(F-actin)+Puncta+in+Rat+Cortical+Neurons.">Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (108), e53697 (2016).</li><li>Rodriguez, A., Ehlenberger, D. B., Dickstein, D. L., Hof, P. R., Wearne, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+Three-Dimensional+Detection+and+Shape+Classification+of+Dendritic+Spines+from+Fluorescence+Microscopy+Images.">Automated Three-Dimensional Detection and Shape Classification of Dendritic Spines from Fluorescence Microscopy Images.</a> PLoS ONE. 3 (10), 1371 (2008).</li></ol>

В этом протоколе мы описываем разностороннюю технику маркировки нейронов как из мозга крыс, так и из тех, которые выращивают в пробирке. Кроме того, мы сообщаем о методологии использования программного обеспечения реконструкции нейронов и программного обеспечения количественного ана...

В 2000 году Gan et al. описали технику быстрой маркировки для отдельных нейронов и глии в нервной системе, которая сочетала в себе различные липофильные красители, что позволило одновременно маркировать многие клетки мозга разными цветами1,2. Совсем недавно, метод баллистической маркировки был описан Seabold et al.3, которые ввели флуоресцентные красители (Dil) в нейроны ломтиков мозга. Универсальный метод окрашивания, баллистическая маркировка ценится за его способность быть использованы в нескольких видов животных и в широком диапазоне возрастов. Кроме того, он может быть объединен с иммунотированием для выявления субпопуляций клеток мозга3. По сравнению с традиционными методами (например, пропитка серебра Golgi-Cox, микроинъекция)4, баллистическая маркировка дает возможность более четко различать морфологические характеристики, в том числе дендритные шипы, особенность, которая имеет решающее значение для рисования выводов о нейронной сложности и синаптической связи5.
Возбуждение пирамидальных нейронов характеризуется одним, большой атический дендрит, несколько коротких базальных дендритов, и тысячи дендритных шипов6. Пирамидальные нейроны находятся в нескольких областях мозга, связанных с когнитивной обработкой более высокого порядка, включая префронтальную кору (PFC) и гиппокамп. В PFC пирамидальные нейроны наблюдаются в слоях II/III и слой V, при этом каждый из них демонстрирует уникальную морфологию. В частности, пирамидальные нейроны в слое II/III ПФУ имеют более короткий апикальный дендрит и меньше ветвления, чем пирамидальные нейроны в слое V6. В гиппокампе, пирамидальные нейроны расположены в обоих регионах CA1 и CA3, с каждым отображением различных морфологий. В частности, пирамидальные нейроны в регионе CA1 обладают более отличительной актикальный дендрит, с разветвления происходящих дальше от сомы, по отношению к CA3 регионе6.
Дендритные шипы на пирамидальных нейронов в пФУ и гиппокампе являются основным местом возбуждания синапсов7. Морфологические характеристики дендритных шипов, которые классически характеризуются на три основные категории (т.е. тонкие, коренастые илигрибы 8),были связаны с размером возбуждающей синапса9. Тонкие шипы, характеризующиеся длинной, тонкой шеей, маленькой луковичной головой и более мелкими постсинаптическими плотностями, более нестабильны и развивают слабые связи. Тем не менее, грибные шипы, которые имеют большую дендритную голову позвоночника, признаются для формирования более сильных синаптических связей, эффект в результате их большего размера. В резком контрасте, коренастый шипы лишены шеи позвоночника, демонстрируя примерно равные головы и шеи соотношение объема8. В гиппокампе, разветвленные шипы также могут наблюдаться, в котором позвоночник имеет несколько голов, которые возникают из той же дендритной шеи позвоночника10. Таким образом, морфологические изменения дендритных шипов могут отражать функциональность и структурные возможности. Кроме того, исследования показали, что размер и форма дендритных шипов относится к их структурной пластичности, что приводит к мысли, что небольшие шипы участвуют в обучении и внимания, в то время как большие, более стабильные шипы, участвуют в долгосрочных процессах, в том числе памяти11. Кроме того, распределение дендритных шипов вдоль дендрита может быть связано с синаптической связью5,,12.
Таким образом, в настоящем методологическом документе есть три цели: 1) Представить наш протокол для баллистической маркировки, который был использован с успехом (т.е. нейроны удовлетворения критериев отбора и подходит для анализа) 83,3%5,12,13 и через несколько областей мозга (т.е. PFC, ядро accumbens, гиппокамп); 2) Продемонстрировать обобщаемость техники и ее применение к нейронам, выращенным в пробирке; 3) Подробно методология, используемая в нейронной реконструкции программного обеспечения и выводы, которые могут быть сделаны из таких данных.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:868px;" width="869">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">20Gx25mm PrecisionGlide needle</td>
			<td style="width:263px;">BD</td>
			<td style="width:143px;">305175</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24-well cell culture plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">35 mm Glass Bottom Dishes</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-1.5-20-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Antibiotic-Antimycotic solution</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>30004CI</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">B-27 supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>50X</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Barrel liner</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Borax</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Boric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B0252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cartridge holder</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Confocal imaging software</td>
			<td style="width:263px;">Nikon</td>
			<td style="width:143px;">EZ-C1</td>
			<td>version 3.81b</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:263px;">Nikon</td>
			<td style="width:143px;">TE-2000E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cover glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>637-137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DilC18(3)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM/F12 medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10565-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dumont #5 Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dumont #7 Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">F344 rat</td>
			<td style="width:263px;">(Harlan Laboratories, Indianapolis, IN)</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glucose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>101174Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GlutaMax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HBSS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4641</td>
			<td>10X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Helios diffusion screens</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Helios gene gun kit</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Helios gene gun system</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Helium hose assembly</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Iris Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>15914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Iris Scissors</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methylene chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D150-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Neurobasal medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Neurolucida 360 software</td>
			<td style="width:263px;">mbf bioscience</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td>dendritic spine analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyvinylpyrrolidone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>5295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ProLong Gold antifade reagent</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P36930</td>
			<td>mounting medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat brain matrix, 300 - 600g, Coronal, 0.5mm</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>15047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sevoflurane</td>
			<td>Merritt Veterinary Supply</td>
			<td>347075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SuperFrost Plus Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-154%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe kit</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tefzel tubing</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tubing cutter</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tubing Prep station</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tungsten M-25 Microcarrier 1.7 &#181;m</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vannas Scissors</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500086</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ballistic labeling of pyramidal neurons in brain slices and in primary cell culture

Сообщалось, что размер и форма дендритных шипов связаны с их структурной пластичностью. Для определения морфологической структуры пирамидальных нейронов и дендритных шипов можно использовать метод баллистической маркировки. В настоящем протоколе, пирамидальные нейроны помечены с ДилC18(3) красителя и проанализированы с помощью программного обеспечения реконструкции нейронов для оценки морфологии нейронов и дендритных шипов. Для исследования структуры нейронов выполняются дендритный анализ ветвления и анализ Sholl, позволяющий исследователям делать выводы о дендритной сложности ветвления и сложности нейрональной беседки, соответственно. Оценка дендритных шипов проводится с использованием алгоритма автоматической ассистированной классификации, неотъемлемой частью программного обеспечения реконструкции, который классифицирует шипы на четыре категории (т.е. тонкие, грибные, коренастые, филоподия). Кроме того, для оценки изменений в морфологии дендритного позвоночника выбираются дополнительные три параметра (т.е. длина, диаметр головы и объем). Для проверки потенциала широкого применения метода баллистической маркировки, пирамидальные нейроны из культуры клеток in vitro были успешно помечены. В целом, метод баллистической маркировки уникален и полезен для визуализации нейронов в различных областях мозга у крыс, что в сочетании со сложным программным обеспечением реконструкции позволяет исследователям выяснить возможные механизмы, лежащие в основе нейрокогнитивная дисфункция.

На рисунке 2A, типичные пирамидальные нейроны в гиппокампе области в крысиных секций мозга были определены по технологии баллистической маркировки, характеризуется одним большим акическим дендритом и несколькими меньшими базальными дендритами вокруг сомы. <strong class="xfig"...

Watch this Scientific Journal Video about Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture at JoVE.com

Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture

Мы представляем протокол для обозначения и анализа пирамидальных нейронов, что имеет решающее значение для оценки потенциальных морфологических изменений в нейронах и дендритных позвоночниках, которые могут лежать в основе нейрохимических и поведенческих аномалий.

Баллистическая маркировка пирамидальных нейронов в мозговых фрагментах и в первичной культуре клеток

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of ...

Этот протокол позволяет оценить потенциальные морфологические изменения в нейронах и дендритных шипах, которые могут подчеркивать нейрохимические и поведенческие отклонения. Он уникален и полезен для визуализации нейронов в различных областях мозга у крыс, что в сочетании со сложным программным обеспечением реконструкции позволяет исследователям прояснить возможные механизмы, лежащие в основе нейрокогнитивной дисфункции. Начните с подготовки решения PVP в соответствии с рукописными указаниями.Заполните трубки с PVP и оставить его на 20 минут. И изгнать его через другой конец с 10 миллилитров шприц. Смешайте 170 миллиграммов вольфрама микрокарьерных бусин с 250 микролитров хлорида метилена.Затем тщательно вихрем подвески. Затем добавьте 6 миллиграммов липофильной DilC18(3)красителя в 300 микролитров хлорида метилена и вихря. Трубы 250 микролитров вольфрама шарик подвески на стеклянную горку.Подождите, пока подвеска высохнет и добавьте 300 микролитров раствора красителя. После того, как сушеные, использовать бритву, чтобы разделить смесь на две 1,5 миллилитров центрифуги труб и заполнить трубки с водой. Sonicate смесь в водяной бане до однородной.Убедившись, что наконечник sonicator лежит непосредственно на трубах. Смешайте две смеси в 15 миллилитров конической трубки. И sonicate еще на три минуты, убедившись, что не большие сгустки красителя покрытием бисера остаются.После sonication, нарисуйте смесь в PVP покрытием трубки с 10 миллилитров шприц. И кормить трубки в подготовительной станции. Поверните трубку на одну минуту.Аккуратно удалите всю воду с помощью шприца. Включите азотный газ и отрегулируйте поток азота примерно до 0,5 литра в минуту. Поверните трубку на станции подготовки и высушите ее азотом в течение 30 минут.Снимите трубку со станции и разрежьте ее на 13-миллиметровые сегменты трубчатым резаком. Убедитесь, что крыса не реагирует на вредные раздражители и рефлексы отсутствуют. Затем закрепню его в положении на спине.Сделайте разрез вдоль грудной линии. Разделим диафрагму и открой грудь ножницами. Затем вставьте 20 калибровочных 25 миллиметров иглы в левый желудочек.Немедленно вырежьте правый атриум ножницами и прополка 15 миллилитров 100 миллимолейных PBS с 5 миллиметрами в минуту скорости потока. Затем пронизыть 100 миллилитров 4%PFA буфера в PBS. После перфузии, удалить весь мозг крысы.И постфикс его с 4%PFA в течение 10 минут. Используйте матрицу мозга крысы, чтобы сократить 500 микрометров толщиной корональной секции. Сделать кулак вырезать и держать лезвие на месте.Затем сделайте второй разрез вторым лезвием и вертикально удалите первое лезвие, удерживая ткань на поверхности лезвия. Поместите ломтики мозга в 24-хорошо пластины с 1 миллилитр PBS в каждом хорошо. И повторяйте процесс до тех пор, пока все ломтики не будут разрезаны.Удалите PBS из каждого целевого хорошо. Загрузите хрящ куском тюбинга Dil/tungsten и поместите его в аппликатор. Положите лист фильтровальной бумаги между двумя сетчатыми экранами.И подключите аппликатор к гелиевому шлангу. Затем отрегулируйте выходной у давления гелия до 90 фунтов на квадратный дюйм. Поместите аппликатор вертикально по центру целевого хорошо 1,5 сантиметра между образцом и сетчатым экраном.Затем огонь Dil / вольфрама трубки. Загрузите хрящ с следующей трубки и непрерывно огонь бисера из труб на оставшиеся ломтики. Заполните 24-хорошо пластины с 100 миллимолярд PBS.И мыть ломтики три раза с 500 микролитров свежих PBS. Убедившись, что ломтики не перевернуть во время мытья. После завершения, добавить 500 микролитров свежих PBS к ломтикам.И инкубировать их в течение трех часов при четырех градусах по Цельсию в темноте. После инкубации используйте тонкую кисть для переноса ломтиков мозга на стеклянные горки. И сразу же добавить один миллилитр антифада монтажа среды для каждого раздела.Поместите 22 на 15 миллиметров крышки над секциями и высушите горки в темноте. Включите систему конфокального микроскопа и переключитесь на цель 60X. Отрегулируйте настройки изображения в соответствии с рукописными указаниями.И получить изображения для целевого типа нейронов на основе границ области мозга и морфологических характеристик нейронов. Изолировать первичный корковой нейрон от F344/N крыс в послеродовой день один и культуры их в 35 миллиметров стекла нижней блюдо в течение одной недели. Освежает половину среды на третий день после изоляции.Вымойте блюдо дважды с 1 миллилитр 100 миллимолярный PBS. И исправить клетки с 4%PFA в течение 15 минут при комнатной температуре. Баллистически обозначить клетки, как описано ранее.И мыть их еще три раза с 1 миллилитр PBS. Добавьте 500 микролитров PBS в клетки и инкубировать их в течение трех часов при четырех градусах Цельсия в темноте. Затем добавьте 200 микролитров антифадной крепления среды.И получить изображения для каждого целевого нейрона. Типичные пирамидальные нейроны в области гиппокампа в секциях мозга крыс были идентифицированы с помощью технологии баллистической маркировки, характеризующейся одним большим апическим дендритом и несколькими меньшими базальными дендритами вокруг сомы. Программное обеспечение количественного анализа нейронной реконструкции использовалось для отслеживания дендритных ветвей и обнаружения шипов.Впоследствии, программное обеспечение было использовано для оценки дендритных ветвлений сложности и нейрональной сложности беседки. Морфологические изменения в дендритных шипах оценивались с использованием длины, объема и диаметра головы. Затем шипы были классифицированы на тонкие, коренастые и грибные шипы.И была изучена относительная частота количества шипов между каждым радиусом. Более того, метод баллистической маркировки был проверен на первичном пирамидавом нейроне в клеточной культуре. Пирамидальные нейроны были определены на основе формы треугольника сомы и большого апического дендрита.Затем программное обеспечение для реконструкции нейронов было использовано для анализа распределения тонких дендритных шипов и длины дендритного позвоночника. При попытке этого протокола, важно, чтобы избежать больших скоплений или кластеров баллистического красителя покрытием вольфрама бусы начала подготовки. Clumps не позволит различать отдельные нейроны.В сочетании с программным обеспечением для реконструкции нейронов этот метод позволяет исследовать нейронную и дендритную морфологию позвоночника в гиппокампе пирамидальных нейронов. Программное обеспечение для реконструкции нейронов использует алгоритм, чтобы предложить автоматическую классификацию дендритных шипов. Количественная оценка нескольких параметров нейронов дает возможность лучше понять механизм, лежащий в основе когнитивной дисфункции нейронов.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Разбор и культуры спаечный Нейроны из эмбриональных спинного мозга

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

DiOLISTIC Маркировка нейроны от грызунов и не-человека Предстоятель фрагменты мозга

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Ретроградная Флуоресцентная маркировка Позволяет Целевые Внеклеточные единичные Запись с Выявленные Нейроны<em&gt; В естественных условиях</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Изображениями кальция Ответы на GFP с метками нейроны гипоталамуса фрагменты мозга мыши

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

Напряжение чувствительные краски Запись с аксонов, дендритов и дендритных шипиков отдельных нейронов в срезах мозга

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Двойной Электрофизиологические Записи синаптически-вызванных астроглиального и нейрональных ответов, при остром срезов гиппокампа

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Первичная культура Mouse дофаминергических нейронов

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Парные Целые Записи Сотовые в Органотипической срезов гиппокампа

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Изоляция, культуры и долгосрочного поддержания первичного теменной дофаминергических нейронов из эмбриональных грызунов Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Цельноклеточной патч-зажим Записи в головном мозге Ломтики

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...